高效液相色譜梯度洗脫法同時測定冠心蘇合滴丸中5個成分的含量

袁杰，張新艷

(1.遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院制劑中心,遼寧 沈陽　110032；2.遼寧省軍區(qū)沈陽第一干休所衛(wèi)生所，遼寧 沈陽　110032)

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高效液相色譜梯度洗脫法同時測定冠心蘇合滴丸中5個成分的含量

袁杰1，張新艷2

(1.遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院制劑中心,遼寧 沈陽110032；2.遼寧省軍區(qū)沈陽第一干休所衛(wèi)生所，遼寧 沈陽110032)

目的建立高效液相色譜(HPLC)梯度洗脫法同時測定冠心蘇合滴丸中的馬兜鈴酸Ⅰ、葒草苷、異葒草苷、牡荊苷和異牡荊苷含量。方法采用Diamonsil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以甲醇(A)-0.5%冰醋酸溶液(B)為流動相，進行梯度洗脫，流速0.9 mL·min-1，柱溫30 ℃，波長切換法檢測(0～21 min，390 nm，馬兜鈴酸Ⅰ；21～60 min，338 nm，葒草苷、異葒草苷、牡荊苷和異牡荊苷)；進樣量為10 μL。結(jié)果馬兜鈴酸Ⅰ、葒草苷、異葒草苷、牡荊苷和異牡荊苷5個成分的線性范圍分別為4.16～83.20 mg·L-1(r=0.999 6)、6.35～127.00 mg·L-1(r=0.999 8)、4.98～99.60 mg·L-1(r=0.999 2)、14.33～286.60 mg·L-1(r=0.999 7)、16.37～327.40 mg·L-1(r=0.999 4)；平均加樣回收率及相應的RSD分別為98.26%(1.40%)，99.23%(1.35%)，97.90%(1.58%)，96.97%(1.14%)，99.11%(1.58%)。結(jié)論該文建立的方法符合方法學驗證要求，可用于冠心蘇合滴丸中的5個指標性成分的同時定量測定。

中草藥/分析;滴丸劑;心絞痛;色譜法,高壓液相

冠心蘇合滴丸具有理氣寬胸，止痛的功效，臨床上主要用于心絞痛，胸悶憋氣等病癥的治療，該制劑是由青木香、檀香、蘇合香、冰片、乳香(制) 等5味中藥材加工而成的中藥復方滴丸劑，收載于《衛(wèi)生部頒藥品標準》中藥成方制劑第十二冊，標準僅規(guī)定了性狀、理化鑒別，無其它定量檢測項目[1]，也未檢索到對該制劑中所含冰片外的其他成分進行定量測定的文獻報道，不能較全面地控制本品的質(zhì)量。為更好地確保冠心蘇合滴丸質(zhì)量，提高冠心蘇合滴丸的質(zhì)量標準，本文作者采用HPLC法同時測定冠心蘇合滴丸馬兜鈴酸Ⅰ、葒草苷、異葒草苷、牡荊苷和異牡荊苷的含量，可有效地提高冠心蘇合滴丸的質(zhì)量標準，為其質(zhì)量監(jiān)管提供科學依據(jù)。

1　儀器與試藥

1.1儀器高效液相色譜儀(HP1100型，美國Waters)，紫外檢測器(Agilent1100型，安捷倫科技有限公司)；電子天平(島津AUW220D型，0.01 mg，日本島津公司)；超聲波清洗器(KQ3200B型，昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2試藥樣品：冠心蘇合滴丸，購于北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠(每丸重40 mg，批號：15290004、15290009、15290017)；試劑：甲醇為色譜純，冰醋酸為分析純；對照品：馬兜鈴酸 I(110746-201510，含量：99.1%)、葒草苷(111777-201302，置五氧化二磷干燥器中減壓干燥 12 h后使用，含量：97.9%)、異葒草苷(110769-200405，含量：94.0%)、牡荊苷(111687-200602，置五氧化二磷減壓干燥器中干燥 12 h以上使用)均購于中國食品藥品檢定研究院，異牡荊苷對照品(29702-25-8，含量：98.0%，-4℃下避光干燥保存)購于上海純優(yōu)生物科技有限公司。

2　方法與結(jié)果

2.1溶液的制備

2.1.1供試品溶液

冠心蘇合滴丸適量，研細，取約1.0 g，精密稱定，置50 mL量瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補充減失的重量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得冠心蘇合滴丸供試品溶液。

2.1.2混合對照品溶液

精密稱取對照品馬兜鈴酸Ⅰ、葒草苷、異葒草苷、牡荊苷和異牡荊苷各適量，分別置5個不同的20 mL量瓶中，用70%乙醇分別溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得單一濃度的對照品儲備溶液(馬兜鈴酸Ⅰ對照品0.416 g·L-1、葒草苷對照品0.635 g·L-1、異葒草苷對照品0.498 g·L-1、牡荊苷對照品1.433 g·L-1、異牡荊苷對照品1.637 g·L-1)。

再分別依次量取上述各對照品儲備液：2.5、1.0、2.5、5.0和5.0 mL，置同一50 mL量瓶中，加70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液(馬兜鈴酸Ⅰ對照品0.0208 g·L-1、葒草苷對照品0.0127 g·L-1、異葒草苷對照品0.0249 g·L-1、牡荊苷對照品0.1433 g·L-1、異牡荊苷對照品0.1637 g·L-1)。

2.1.3陰性對照溶液

按照冠心蘇合滴丸工藝方法分別制備青木香陰性樣品和檀香陰性樣品，按照“2.1.2”項下方法制備青木香陰性對照溶液和檀香陰性對照溶液。

2.2色譜條件色譜柱：Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流速：0.9 mL·min-1；進樣量為10 μL；柱溫：30 ℃；流動相A：甲醇，流動相B：0.5%冰醋酸溶液，梯度洗脫[2-8](0～15 min，22.0%A；15～21 min,22.0%A→31.0%A;21～36 min,31.0%A;36～54 min,31.0%A→43.0%A;54～60 min,43.0%A→22.0%A)；0～21 min時在390 nm[9]波長下檢測馬兜鈴酸Ⅰ，21～60 min在338 nm[6,10-11]波長下檢測葒草苷、異葒草苷、牡荊苷和異牡荊苷。

2.3含量測定方法學考察

2.3.1線性關系考察

分別精密吸取上述對照品儲備液各0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mL，將其置于10 mL量瓶中并用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得到一系列濃度的混合對照品溶液，按照上述測定方法進行測定，采用質(zhì)量濃度X作為橫坐標，測得的峰面積Y作為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程,如表1所示。

2.3.2專屬性實驗

分別精密吸取陰性對照溶液、混合對照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀中，在上述色譜條件下依法進行測定。試驗結(jié)果表明，各陰性對照溶液的色譜圖中，在所測馬兜鈴酸Ⅰ、葒草苷、異葒草苷、牡荊苷和異牡荊苷5個成分對應的位置無干擾，表明該方法專屬性良好，色譜圖見圖1。

表1　線性關系實驗結(jié)果

2.3.3重復性試驗

取同一批號15290004的冠心蘇合滴丸樣品適量，研細，取細粉6份，按上述供試品溶液制備方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進行測定，分別計算馬兜鈴酸Ⅰ、葒草苷、異葒草苷、牡荊苷和異牡荊苷的含量，并計算所測5個組分含量的RSD，結(jié)果所測5個組分的RSD依次為1.23%、1.54%、1.08%、0.99%和0.86%。結(jié)果表明本方法重復性良好。

2.3.4儀器精密度試驗

取上述混合對照品溶液，按上述規(guī)定的色譜條件重復進樣6次，記錄馬兜鈴酸Ⅰ、葒草苷、異葒草苷、牡荊苷和異牡荊苷的峰面積，分別計算這5個組分峰面積的RSD值，其RSD依次為1.06%、1.15%、0.98%、0.83%和0.77%。結(jié)果顯示儀器精密度良好。

2.3.5供試品溶液的穩(wěn)定性

取重復性項下的一份供試品溶液，在室溫下放置0 、1、2、4、8、12 h來評價供試品溶液的穩(wěn)定性，按上述色譜條件及測定方法，測定馬兜鈴酸Ⅰ、葒草苷、異葒草苷、牡荊苷和異牡荊苷的峰面積值，求得這5個組分的峰面積的RSD依次為0.98%、1.04%、0.88%、0.85%和0.73%，供試樣品溶液制備后12 h內(nèi)是較穩(wěn)定的。

2.3.6加樣回收率試驗

取批號為15290004已知含量的冠心蘇合滴丸適量，稱定6份，每份0.5 g，精密稱定，置50 mL量瓶中，精密加入“2.1.2”項下制備的混合對照品溶液25 mL、70%乙醇25 mL，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補充減失的重量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，作為加樣回收樣品試液。按照上述色譜條件及上述檢測方法，計算這5個組分的回收率及RSD，結(jié)果見表2。

2.4樣品的測定取三批冠心蘇合滴丸，按上述制備方法制備供試品溶液，在上述的色譜條件下進樣測定，結(jié)果見表3。

表3　含量測定結(jié)果/mg·g-1

3　討論

本實驗首次建立了 HPLC 梯度洗脫法同時測定冠心蘇合滴丸中5 個成分含量的方法，該方法操作簡便、靈敏度高、準確性好。

本文作者在研究供試品的制備方法時，提取方法分別考察了加熱回流提取與超聲提取兩種方法，結(jié)果顯示兩種方法的提取率差異無統(tǒng)計學意義，選擇操作簡便的超聲提取法為實驗提取方法；對不同溶劑下(60%、70%、80%、90%乙醇)樣品超聲提取法所測各成分馬兜鈴酸Ⅰ、葒草苷、異葒草苷、牡荊苷和異牡荊苷含量的提取率進行考察，結(jié)果70%乙醇提取效率略高，故將70%乙醇確定為實驗提取溶劑。提取時間分別選擇超聲20、30、40 min進行考察，結(jié)果超聲處理30 min和40 min,所測各成分馬兜鈴酸Ⅰ、葒草苷、異葒草苷、牡荊苷和異牡荊苷差異不大，但明顯高于20 min的提取效果。最終確定為“2.1.1”項下的制備方法，即70%乙醇超聲處理30 min作為供試品溶液制備的最佳提取方案。

注：樣品(A)、對照品(B)、青木香陰性(C)、檀香陰性(D)

表2　馬兜鈴酸Ⅰ、葒草苷、異葒草苷、牡荊苷和異牡荊苷回收率

4　小結(jié)及展望

為提高對冠心蘇合滴丸中所測5個成分馬兜鈴酸Ⅰ、葒草苷、異葒草苷、牡荊苷和異牡荊苷檢測的靈敏度和準確度,本文采用波長切換聯(lián)合梯度洗脫法實現(xiàn)對所測5個成分的同時測定,為冠心蘇合滴丸的質(zhì)量控制增加了方法手段，研究結(jié)果為控制冠心蘇合滴丸的質(zhì)量和藥品標準的進一步提高提供了數(shù)據(jù)支持。本方法測定需要使用5個組分對照品，用量相對較大，為簡化檢測方法，降低檢驗成本，一測多評法在本樣品中的可行性還有待進一步研究。

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Simultaneous determination of contents of five components in Guanxin Suhe Dripping Pills by HPLC with gradient elution method

YUAN Jie1,ZHANG Xinyan2

(1.MedicalCenterAgents,TheAffiliatedHospitalofLiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shenyang,Liaoning110032,China;2.HealthClinic,ShenyangFirstSanatoriumforRetiredOfficersofLiaoningMilitaryRegion,Shenyang,Liaoning110032,China)

ObjectiveTo develop an HPLC with gradient elution method for determination of the contents of aristolochic acid Iorientin,isoorientin,vitexin and isovitexin in Guanxin Suhe Dripping Pills simultaneously.MethodsThe Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm) chromatographic column was adopted;the mobile phase was methanol(A)-0.5% glacial acetic acid solution(B) with gradient elution at a flow rate of 0.9 mL·min-1.Sample quantity was 10 μL,the column temperature was set at 30 ℃,and the detection wavelengths were 390 nm(0～21 min,aristolochic acid I),338 nm(21～60 min,orientin,isoorientin,vitexin and isovitexin).ResultsGood linear relationships of aristolochic acid I,orientin,isoorientin,vitexin and isovitexin,were found in the ranges of 4.16～83.20 mg·L-1(r=0.999 6),6.35～127.00 mg·L-1(r=0.999 8),4.98～99.60 mg·L-1(r=0.999 2),14.33～286.60 mg·L-1(r=0.999 7),and 16.37～327.40 mg·L-1(r=0.999 4),respectively.The average recoveries and the corresponding RSD were 98.26%(1.40%),99.23%(1.35%),97.90%(1.58%),96.97%(1.14%),and 99.11%(1.58%),respectively.ConclusionsThis method is consistent with the method validation requirements,and can simultaneously determine the above 5 index components of Guanxin Suhe Dripping Pills．

Drugs,Chinese herbal/analysis;Drop pills;Angina pectoris;Chromatography,high pressure liquid

10.3969/j.issn.1009-6469.2016.09.010

2016-4-11，

2016-07-09)