仿生酶菌協(xié)同體系預(yù)處理木質(zhì)素機(jī)理及特性

唐亮，廖強(qiáng)，夏奡，黃云，朱賢青，朱恂

（1 重慶大學(xué)低品位能源利用技術(shù)及系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400044；2 重慶大學(xué)工程熱物理研究所，重慶 400044）

化石能源的過量使用導(dǎo)致日趨過量的溫室氣體排放，嚴(yán)重影響全球氣候。為此，我國已宣布將于2030 年前實(shí)現(xiàn)“碳達(dá)峰”，2060 年前實(shí)現(xiàn)“碳中和”[1]。我國是農(nóng)業(yè)大國，生物質(zhì)儲(chǔ)量大，生物質(zhì)可通過酶解糖化及發(fā)酵制備生物燃料，對(duì)實(shí)現(xiàn)“碳中和”目標(biāo)具有重要意義。生物質(zhì)中木質(zhì)纖維素類廢棄物年產(chǎn)量達(dá)9.8 億噸[2]，折合標(biāo)準(zhǔn)煤約為4.9 億噸，相當(dāng)于2020年我國能源消費(fèi)總量的9.8%[3]，因此，開發(fā)和利用木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)資源尤為重要[4]。木質(zhì)纖維素中纖維素含量為35%～50%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）[5-6]，纖維素是由β-D-葡萄糖連接的高分子化合物[7]，纖維素經(jīng)過酶解糖化及發(fā)酵可轉(zhuǎn)化為生物燃料[8]，但木質(zhì)素的致密結(jié)構(gòu)和對(duì)酶的無效吸附限制了纖維素酶對(duì)纖維素的可及性，降低酶解效率[9-10]，因此需要預(yù)處理打破木質(zhì)素結(jié)構(gòu)[11]。

生物質(zhì)預(yù)處理技術(shù)主要包括機(jī)械破碎、蒸汽爆破、酸堿處理等方式，但通常存在能耗高、成本高等缺點(diǎn)，導(dǎo)致生物燃料商業(yè)化生產(chǎn)難以實(shí)現(xiàn)[12]。自然界中高等培菌白蟻降解木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)效率高，在一些干旱的熱帶地區(qū)，高等培菌白蟻能降解90%以上植物殘?bào)w[13-15]，該過程由腸道的酶和蟻巢內(nèi)真菌協(xié)同作用實(shí)現(xiàn)[16]?；诖?，本研究提出利用漆酶和真菌分步降解木質(zhì)素新體系。以蟻巢內(nèi)提取的蟻巢傘菌和典型的木質(zhì)纖維素降解菌黃孢原毛平革菌為研究對(duì)象，研究酶菌體系對(duì)木質(zhì)素模型化合物堿木素的預(yù)處理效果，分析堿木素理化特性的改變，以及經(jīng)酶菌體系處理后的堿木素對(duì)后續(xù)酶解的影響特性，為實(shí)現(xiàn)木質(zhì)纖維素高效轉(zhuǎn)化提供思路。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究采用來源于云芝的漆酶（Laccase fromTrametes versicolor）、總濾紙酶活為70FPU/g 的混合纖維素酶（Cellic CTec2）、堿木素（Alkali lignin）來自于美國Sigma-Aldrich 試劑公司，蟻巢傘菌（Termitomycessp.）來自于德國微生物菌種保藏中心（DSMZ），黃孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）來自于廣東微生物菌種保藏中心。保種以凍干粉形式，置于4℃環(huán)境保存。將凍干粉加入無菌水搖勻，使用滅菌后的移液槍將稀釋后的黃孢原毛平革菌凍干粉溶液接種到PDA培養(yǎng)基中，將稀釋后蟻巢傘菌凍干粉溶液接種到麥芽提取物蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基。直至兩個(gè)培養(yǎng)基表面長(zhǎng)滿白色絲狀真菌，之后用無菌水洗刷培養(yǎng)基表面，并用接種環(huán)刮下表面的菌絲。待大部分菌絲脫落后，用移液槍吸取固體培養(yǎng)基表面的液體滴入漏斗中，濾紙過濾掉固體，收集液體于離心管中，完成真菌孢子液制備，以O(shè)D600表示菌液的濃度，初始濃度為OD600=0.13左右。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 漆酶對(duì)木質(zhì)素降解實(shí)驗(yàn)

稱取0.1g 漆酶和1g 堿木素，加入裝有20mL、pH為4.8的檸檬酸鈉緩沖液的錐形瓶中，在溫度為25℃、轉(zhuǎn)速為170r/min 搖床中反應(yīng)24h[17]。隨后離心、棄置上清液，用去離子水沖洗3次，將堿木素殘?jiān)湃牒嫦浜娓桑^100目篩網(wǎng)備用。

1.2.2 真菌對(duì)木質(zhì)素降解實(shí)驗(yàn)

將0.2g堿木素和經(jīng)漆酶處理后的堿木素分別加入裝有40mL降解培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中[18]，之后將真菌的孢子液100μL加入到錐形瓶中，用橡膠塞密封，在溫度為28℃、轉(zhuǎn)速為160r/min的搖床中反應(yīng)15 天。降解培養(yǎng)基配置方法如下：精確稱取2g葡萄糖、0.1g MgSO4·7H2O、0.1g CaCl2、0.4g酒石酸銨、0.5mL 吐溫80、1g KH2PO4和0.57mL 藜蘆醇于500mL去離子水中，充分溶解后，添加1mL微量元素溶液并定容至1L，放入高壓滅菌鍋在121℃滅菌20min。微量元素溶液配制如下：0.01g H3BO3、0.01g CuSO4·5H2O、 0.02g Al(K(SO4)2) ·12H2O、0.1g CoCl2·6H2O、0.1g FeSO4·7H2O、0.1g ZnSO4·7H2O和0.5g MnSO4充分溶解于1L去離子水中。

1.2.3 木質(zhì)素對(duì)真菌生物量影響實(shí)驗(yàn)

將堿木素和經(jīng)漆酶處理后的堿木素各0.1g分別加入裝有20mL 降解培養(yǎng)基的錐形瓶中，之后加入200μL 的真菌孢子液，在溫度為28℃、轉(zhuǎn)速為160r/min 的搖床中培養(yǎng)，每種真菌各做14 個(gè)平行樣。每隔一段時(shí)間取2個(gè)樣，將錐形瓶中的菌液全部倒入烘干后的離心管（烘干后的離心管質(zhì)量已測(cè)）中，之后用去離子水沖刷錐形瓶以保證錐形瓶?jī)?nèi)沒有殘留，再將沖刷后的去離子水倒入烘干后的離心管，將裝有菌液的離心管用離心機(jī)在7500r/min條件下離心10min，倒掉上清液，放入溫度為80℃的烘箱中烘干，測(cè)量離心管和固體的總質(zhì)量，減去之前烘干后離心管的質(zhì)量，即得生物量干重。

1.2.4 木質(zhì)素降解酶活測(cè)定實(shí)驗(yàn)

使用滅菌的移液槍頭移取降解過程中的上清液，用去離子水適當(dāng)稀釋搖勻后用離心機(jī)在7500r/min 條件下離心10min，離心后的上清液即為粗酶液。

漆酶的酶活測(cè)定方法：在1mL 待測(cè)的粗酶液中先后加入1mL 的0.1mol/L 乙酸鈉緩沖液（pH=4.5）及1mL 的0.5mmol/L ABTS 溶液，混合后于25℃恒溫培養(yǎng)箱中反應(yīng)5min，用紫外光分光光度計(jì)測(cè)定420nm處反應(yīng)前后的吸光度變化[19]。

木質(zhì)素過氧化物酶的酶活測(cè)定方法：將1mL粗酶液加入1.9mL 0.24mmol/L藜蘆醇溶液中，加入6mmol/L過氧化氫溶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，反應(yīng)3min，用紫外光分光光度計(jì)測(cè)定310nm 處反應(yīng)前后的吸光度變化[20]。

錳過氧化物酶的酶活測(cè)定方法：反應(yīng)體系取為2.4mL 50mmol/L 乙酸鈉緩沖液、0.1mL 1.6mmol/L硫酸錳溶液、0.1mL 1.6mmol/L 2,6-DMP 溶液和0.4mL 粗酶液，加入1.6mmol/L 過氧化氫溶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，反應(yīng)3min，用紫外光分光光度計(jì)測(cè)定468nm處反應(yīng)前后的吸光度變化[20]。

酶活單位（U）定義為在上述條件下，每分鐘氧化1μmol ABTS、藜蘆醇和2,6-DMP 所需要的酶量，計(jì)算公式如式(1)。

式(1)中，E為樣品酶活，U/L；ΔOD為反應(yīng)前后吸光度的變化值；V為反應(yīng)總體積，mL；N為粗酶液稀釋倍數(shù)；V1為粗酶液體積，mL；t為反應(yīng)時(shí)間，min；ε為消光系數(shù)，L/(mol·cm)，ε420=36000L/(mol·cm)，ε310=9300L/(mol·cm)，ε468=49600L/(mol·cm)。

1.2.5 木質(zhì)素對(duì)微晶纖維素水解影響實(shí)驗(yàn)

使用Cellic CTec2 復(fù)合纖維素酶進(jìn)行微晶纖維素的酶促糖化反應(yīng)。糖化過程使用的酶量為30FPU/g。將裝有20mL檸檬酸鈉緩沖液（0.1mol/L，pH=4.8）的100mL 錐形瓶置于溫度為50℃、轉(zhuǎn)速為160r/min 的搖床中反應(yīng)72h，堿木素的負(fù)載率為1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），堿木素與微晶纖維素的質(zhì)量比為2∶1。實(shí)驗(yàn)通過DNS法確定水解過程中還原糖的產(chǎn)量[21]。為了明晰酶菌處理后堿木素對(duì)酶的非生產(chǎn)吸附作用的影響[22]，研究酶菌處理后堿木素上酶的吸附等溫曲線，不同酶蛋白的濃度為0.1～2mg/mL[23]。將堿木素和酶裝有10mL檸檬酸鈉緩沖液（0.1mol/L，pH=4.8）的100mL 錐形瓶中于50℃（160r/min）反應(yīng)3h 以達(dá)到平衡[24]。使用Bio-Rad 蛋白測(cè)定法（Bradford 的比色法）測(cè)定游離蛋白濃度，并將牛血清蛋白（Sigma-Aldrich）用作標(biāo)準(zhǔn)品[25]。堿木素對(duì)纖維素酶的吸附通過以下朗繆爾方程描述，如式(2)[23]。

式中，Eads是木質(zhì)素吸附的酶量，mg/g木質(zhì)素；Efree是懸浮液中游離酶的濃度，mg/mL；Emax是木質(zhì)素的最大酶吸附量，mg/g木質(zhì)素；K為L(zhǎng)angmuir吸附常數(shù)，mL/mg酶。

1.3 分析測(cè)試方法

將酶菌處理前后的堿木素放入60℃烘箱中干燥24h 后，使用配備有DTGS 檢測(cè)器的Thermo Scientific Nicolet iN10 FTIR 顯微鏡（Thermo Nicolet Corporation） 進(jìn)行FTIR 光譜分析，掃描在400～4000cm-1進(jìn)行。將堿木素放在60℃烘箱中干燥24h后，然后涂上金-鈀層，然后使用掃描電子顯微鏡（VEGA 3 LMH，捷克TESCAN）在電壓為10kV 的條件下拍攝樣品的顯微照片。用壓汞法對(duì)酶菌處理堿木素前后的孔徑信息進(jìn)行測(cè)試，實(shí)驗(yàn)通過Micromertics Instruments Corporation AutoPore IV 9500 進(jìn) 行， 測(cè) 量 壓 力 為33000psia （1psia=6.890kPa）。用德國布魯克公司生產(chǎn)的Bruker AVANCE III 600M核磁共振儀測(cè)試酶菌預(yù)處理前后堿木素的二維碳?xì)浜舜?，將堿木素樣品溶于二甲基亞砜-d6進(jìn)行測(cè)試。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶菌預(yù)處理木質(zhì)素特性

2.1.1 漆酶預(yù)處理前后的木質(zhì)素對(duì)真菌干重的影響以漆酶預(yù)處理前后的堿木素為底物，黃孢原毛平革菌、蟻巢傘菌降解堿木素過程中真菌干重的變化規(guī)律如圖1所示。以漆酶（La）處理后的堿木素為底物，兩種真菌初期的生長(zhǎng)速率均高于未處理的樣品，這是由于經(jīng)漆酶預(yù)處理后，堿木素被部分降解，表面形成突起，堿木素的比表面積增加，與菌的接觸面積增大，有利于真菌初期的生長(zhǎng)。以未處理的堿木素為底物的蟻巢傘菌生物量在第7天要高于以漆酶處理后的堿木素為底物的蟻巢傘菌生物量，原因在于兩種真菌會(huì)分泌La、錳過氧化物酶（Mnp）和木質(zhì)素過氧化物酶（LiP）來協(xié)同降解堿木素，有部分堿木素只能被漆酶所降解，La+Te體系前期漆酶的酶活要高于單一Te，造成以未處理堿木素為底物的蟻巢傘菌前期對(duì)這部分堿木素降解很少，隨著單一Te 分泌的漆酶的酶活不斷升高，在生長(zhǎng)后期達(dá)到最高值，使得這部分堿木素被降解，進(jìn)而生物量高于以漆酶處理后的堿木素為底物的蟻巢傘菌。以漆酶處理后的堿木素為底物的真菌衰亡速率明顯降低，可能在于接觸面積增大，菌更多的附著在堿木素上，菌絲會(huì)沿著孔隙生長(zhǎng)，使得堿木素的緊密結(jié)構(gòu)解聚，相比于未處理過的堿木素更易被菌利用，從而降低了真菌的衰亡速率。而未經(jīng)漆酶處理的堿木素大孔徑少，導(dǎo)致了真菌較難利用堿木素碳源，同時(shí)后期營養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡，造成真菌大量死亡，真菌殘?bào)w溶解于溶液中，導(dǎo)致衰亡期生物量顯著下降。

圖1 漆酶預(yù)處理對(duì)真菌干重的影響

2.1.2 漆酶預(yù)處理對(duì)降解過程中木質(zhì)素濃度的影響

圖2為真菌降解堿木素過程中堿木素濃度變化的趨勢(shì)。在第一天，La+PC體系的堿木素降解速率最快，24h內(nèi)堿木素濃度下降了7.6%，這主要是因?yàn)殄i過氧化物酶會(huì)產(chǎn)生Mn3+，通過脂質(zhì)過氧化反應(yīng)分解木質(zhì)素的酚類和非酚類單元，將堿木素結(jié)構(gòu)破壞，進(jìn)而將其降解為小分子化合物[26]。四組實(shí)驗(yàn)堿木素的濃度變化基本不大，原因是前期分泌的漆酶作用有限，只能作用于堿木素酚類單體，能夠?qū)⒎恿u基氧化成活性基團(tuán)苯羥自由基，從而使芳香基裂解。但是，酚類單體僅僅占木質(zhì)素總結(jié)構(gòu)單元的10%～15%[27]，并且漆酶除了能夠催化解聚木質(zhì)素，亦可導(dǎo)致木質(zhì)素聚合，所以對(duì)木質(zhì)素的去除效果有限[28]。從第7 天開始，由于錳過氧化物酶和木質(zhì)素過氧化物酶的酶活升高，堿木素的降解速率變快。直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，單一Te對(duì)堿木素的降解率最大，為25.3%，而這一過程中錳過氧化物酶的活性是四組實(shí)驗(yàn)中最高的，最低的為L(zhǎng)a+Te 體系，為12.7%，同時(shí)La+Te 體系中錳過氧化物酶活性是最低的，錳過氧化物酶由于其對(duì)酚類和非酚類單元的降解作用，與漆酶和木質(zhì)素過氧化物酶相比對(duì)堿木素的降解效果更好，從而在堿木素降解過程中占主導(dǎo)作用。

圖2 漆酶預(yù)處理對(duì)降解過程中木質(zhì)素濃度的影響

2.1.3 漆酶預(yù)處理對(duì)真菌木質(zhì)素降解酶活性的影響圖3反映的是La的活性，可知以漆酶處理后的堿木素為底物的兩種真菌漆酶的酶活都比以未處理的堿木素高，其中La+Te 體系La 活性最高，是單一Te最高漆酶活性的1.43倍，并且在第5天就達(dá)到最高值，之后略微下降，到第13 天酶活仍保持6.3U/L。而單一Te 的La 活性雖一直上升，直到第13 天達(dá)到最高，但在時(shí)間上酶活的最高點(diǎn)具有滯后性，并且La 處理后的堿木素較未處理的堿木素對(duì)蟻巢傘菌分泌的La 活性有明顯的提升效果。對(duì)于PC，以漆酶處理后的堿木素為底物對(duì)其分泌的La 活性也有提升作用，但改善效果沒有Te 那么明顯，并且對(duì)活性變化趨勢(shì)沒有影響。

圖3 漆酶預(yù)處理對(duì)漆酶活性的影響

堿木素降解過程中MnP 的活性變化如圖4 所示。單一Te 的MnP 活性要比La+Te 體系的酶活高21.0%，原因在于La與MnP對(duì)堿木素的降解效果相似，都能降解酚類單元，并且La 氧化過程不需要H2O2和Mn2+的參與，但MnP 降解堿木素需要H2O2和Mn2+參與[29]，因此MnP降解堿木素需要消耗真菌更多能量，真菌在La 活性過高時(shí)可能會(huì)減少M(fèi)nP分泌來減少能量消耗。La+PC體系在前3天MnP酶活增長(zhǎng)最快，堿木素降解率在前3天也最高，表明錳過氧化物酶對(duì)堿木素的降解至關(guān)重要。La+PC體系的MnP 活性比單一PC 提升了31.6%，表明經(jīng)La處理后的堿木素更利于被MnP所降解。

圖4 漆酶預(yù)處理對(duì)錳過氧化物酶活性的影響

真菌降解堿木素過程中LiP 活性變化如圖5 所示。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行5 天后，PC 分泌的LiP 活性高于Te，表明PC 降解非酚類單元的能力強(qiáng)于Te。同時(shí)因?yàn)長(zhǎng)a 預(yù)處理，PC 分泌LiP 活性出現(xiàn)最高峰的時(shí)間比單一PC 的最高峰提前2 天。La+Te 體系的LiP 活性的最大值高于單一Te 最大值，并且在第13 天時(shí)，單一Te 分泌的LiP 的活性已經(jīng)開始下降，而La+Te體系的LiP活性達(dá)到最高值，表明漆酶的預(yù)處理提高了Te分泌的LiP活性。值得注意的是，兩種真菌的LiP活性的最大值都出現(xiàn)在降解過程后期，表明這兩種真菌降解堿木素非酚類單元主要是在后期完成的。

圖5 漆酶預(yù)處理對(duì)木質(zhì)素過氧化物酶活性的影響

2.2 酶菌預(yù)處理對(duì)木質(zhì)素物化結(jié)構(gòu)的影響

2.2.1 傅里葉轉(zhuǎn)換紅外光譜分析

酶菌處理堿木素前后的FTIR 如圖6 所示，譜帶分布如表1 所示。La、Te、La+Te 體系以及La+PC 體系處理后的堿木素在指紋區(qū)域（1300～1000cm-1）發(fā)生了顯著的變化，但PC 處理后的堿木素變化不大，僅在1125cm-1[30]處吸收峰強(qiáng)度顯著下降，該吸收峰代表紫丁香基木素C—H 面內(nèi)變形，PC 降解堿木素過程中木質(zhì)素三大基本單元之一紫丁香基木素減少，PC 處理后的堿木素羥基吸收峰（3222cm-1），CH2、CH3、CH3O 基團(tuán)的C—H 拉伸振動(dòng)的吸收峰（2935cm-1）[31]，苯酚的C—O 拉伸振動(dòng)的吸收峰（1213cm-1）略微升高，醇類（1081cm-1）[32]吸收峰下降，表明醇類被破壞，新的酚羥基生成，造成羥基吸收峰升高，新的甲基、亞甲基、甲氧基生成，木質(zhì)素發(fā)生解聚。由此可見，PC 對(duì)堿木素作用有限，主要降解紫丁香基木素，斷裂與苯環(huán)連接的醚鍵生成酚羥基和降解醇類。但La+PC 體系處理后的堿木素在4000～1000cm-1范圍內(nèi)的吸收峰較未處理的堿木素樣品的吸收峰有顯著的降低，表明La預(yù)處理對(duì)PC 降解堿木素效果有顯著的提升。同時(shí)將La+PC 體系處理后的堿木素與只經(jīng)La 處理過的堿木素相比較，La+PC 體系處理后的堿木素在指紋區(qū)域吸收峰強(qiáng)度比La 處理過的堿木素低，但在吸收峰為3222cm-1的位置卻是前者比后者高，這個(gè)位置是羥基吸收峰，進(jìn)一步表明PC 對(duì)酚類單元的降解能力較弱，而La 可以降解酚類單元，提升PC 對(duì)堿木素的降解效果。單一Te、La+Te 體系處理后的堿木素在4000～1000cm-1范圍內(nèi)的吸收峰是最低的兩組。這兩組的吸收峰差別不大，吸收峰的值幾乎重合，但其中La+Te 體系處理后的堿木素在波數(shù)為3222cm-1、2935cm-1處比經(jīng)單一Te 處理的略低，表明酚類單元減少，堿木素化學(xué)鍵被破壞。

圖6 酶菌預(yù)處理堿木素的FTIR光譜

表1 堿木素FTIR譜帶分布

2.2.2 掃描電鏡分析

掃描電鏡結(jié)果顯示（圖7），未處理的堿木素樣品表面平整棱角分明且沒有孔隙。經(jīng)La處理后，表面趨于光滑，且表面形成許多小的突起，增加了后續(xù)菌處理的表面積。經(jīng)Te 處理后，樣品表面變得光滑，有裂縫生成。La+Te 體系處理后的堿木素，表面更加光滑，凹凸不平，有微米級(jí)孔形成。PC 處理后的堿木素表面粗糙，有不規(guī)則的、大小不一孔隙形成，La+PC體系處理后的堿木素表面粗糙，凹凸不平，表面結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，形成大量3μm以下大小的堿木素顆粒。

圖7 堿木素的SEM圖像

2.2.3 孔徑分析

酶菌處理后的堿木素的孔徑分布如表2 所示，未經(jīng)處理的堿木素樣品平均孔徑最小，僅有841.41nm，而平均孔徑最大的是La+PC處理后的堿木素，是未經(jīng)處理堿木素樣品的2.13倍，是單一PC處理后堿木素的1.81倍，是La處理后堿木素的1.44倍。La+Te體系處理后堿木素樣品的平均孔徑較單一酶和單一菌都有顯著的擴(kuò)大，說明漆酶對(duì)真菌擴(kuò)大堿木素孔徑有促進(jìn)作用。但總孔容卻是未經(jīng)處理的堿木素樣品最大，其原因可能是酶菌處理時(shí)堿木素發(fā)生了解聚，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性變差，出現(xiàn)了小孔坍塌，造成處理后的總孔容較未處理的堿木素樣品小。經(jīng)漆酶和真菌分步處理后堿木素的總孔容要大于單一真菌處理后堿木素的總孔容，說明酶菌協(xié)同體系處理較單一真菌處理對(duì)堿木素結(jié)構(gòu)的破壞作用更大。

表2 酶菌預(yù)處理堿木素的孔徑信息

2.2.4 二維碳?xì)浜舜抛V圖分析

酶菌預(yù)處理前后的堿木素二維碳?xì)浜舜抛V圖如圖8 所示，13C—1H 相關(guān)信號(hào)分布表如表3 所示。由圖可知，經(jīng)漆酶、單一PC 和La+PC 體系預(yù)處理后的堿木素樣品在苯環(huán)上和側(cè)鏈區(qū)的的碳?xì)浠瘜W(xué)鍵的峰強(qiáng)度相較于未處理的堿木素樣品均有所下降，其中漆酶預(yù)處理后的苯環(huán)上和側(cè)鏈區(qū)的碳?xì)浠瘜W(xué)鍵峰強(qiáng)度低于單一PC，表明漆酶對(duì)堿木素的化學(xué)鍵破壞效果要強(qiáng)于單一PC，與FTIR 結(jié)果相吻合。La+PC 體系預(yù)處理后的堿木素樹脂醇結(jié)構(gòu)中β—β 鍵的Cβ—Hβ峰強(qiáng)度沒有檢測(cè)到，表明堿木素中大量的β—β 鍵發(fā)生了斷裂，β—β 鍵一般也由紫丁香基木素所組成，進(jìn)一步說明La+PC體系可以破壞紫丁香基木素。在苯環(huán)區(qū)域，對(duì)羥基苯基木素上的C2—H2和C6—H6鍵的峰強(qiáng)度也未檢測(cè)到，表明在漆酶強(qiáng)化了PC 對(duì)對(duì)羥基苯基木素的破壞。

2.3 酶菌預(yù)處理對(duì)木質(zhì)素吸附纖維素酶與酶解特性的影響

2.3.1 酶菌預(yù)處理對(duì)木質(zhì)素的纖維素酶吸附特性的影響

圖8是堿木素對(duì)纖維素酶的吸附曲線。隨著游離酶濃度的增加，吸附量趨于飽和。隨著纖維素酶的濃度升高，未處理堿木素樣品和經(jīng)單一La 處理的堿木素樣品對(duì)酶的吸附量自低濃度（0.2mg/mL）就開始趨于飽和，而經(jīng)菌和酶菌分步預(yù)處理的堿木素樣品對(duì)酶的吸附量達(dá)到飽和狀態(tài)時(shí)所對(duì)應(yīng)的纖維素酶量濃度大約為1mg/mL，表明真菌預(yù)處理對(duì)減少堿木素對(duì)酶的吸附所起的作用比漆酶的作用要大，真菌預(yù)處理可以顯著減少堿木素對(duì)纖維素酶的吸附。

圖8 酶菌預(yù)處理前后堿木素的二維碳?xì)浜舜抛V圖

表3是堿木素對(duì)纖維素酶吸附曲線的參數(shù)。由表可知，未處理的堿木素樣品最大酶吸附量最高，La 處理后堿木素最大酶吸附量較未處理的堿木素樣品下降了15.9%，經(jīng)真菌處理后的堿木素樣品的最大吸附量較未處理的堿木素樣品顯著下降，其中La+Te 體系處理后的堿木素的最大酶吸附量最少，為9.94mg/g，比未經(jīng)處理的堿木素樣品的最大酶吸附量降低了51.5%。PC處理后的堿木素對(duì)纖維素酶的吸附強(qiáng)于Te處理，原因在于PC處理后的堿木素酚羥基數(shù)量比Te處理的多[33]。

表3 13C—1H相關(guān)信號(hào)分布表

2.3.2 酶菌預(yù)處理木質(zhì)素對(duì)纖維素酶酶解特性的影響

酶菌預(yù)處理堿木素前后，堿木素對(duì)微晶纖維素的酶促水解實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖9所示。經(jīng)酶菌處理后的堿木素對(duì)纖維素酶的非生產(chǎn)吸附減少，使得溶液中酶活跟對(duì)照組比起來更高，水解微晶纖維素所得到的還原糖增多。其中，從圖10 及Langmuir 吸附等溫曲線（表4）可知，La+Te 體系處理后的堿木素對(duì)纖維素酶的非生產(chǎn)吸附最少，使得游離的酶濃度更高，水解微晶纖維素所產(chǎn)生的還原糖濃度最高，在72h后濃度為3.11g/L，剩下的實(shí)驗(yàn)組還原糖濃度從高到低依次為：2.63g/L（單一Te處理）、2.58g/L（La+PC 體系處理）、2.08g/L（單一PC 處理）以及1.81g/L（未經(jīng)處理的堿木素樣品），La+Te 體系降解后的堿木素較未經(jīng)處理的堿木素樣品的還原糖濃度提升了71.5%。

圖9 酶菌預(yù)處理堿木素對(duì)纖維素酶吸附特性的影響

圖10 酶菌預(yù)處理堿木素對(duì)纖維素酶酶解特性的影響

表4 Langmuir吸附等溫線參數(shù)

3 結(jié)論

（1）受高等培菌白蟻降解生物質(zhì)的酶菌體系啟發(fā)，構(gòu)建酶菌降解堿木素的新體系。漆酶預(yù)處理后的堿木素對(duì)真菌生長(zhǎng)代謝的影響研究表明，經(jīng)漆酶預(yù)處理后的堿木素提升了真菌生長(zhǎng)初期的生長(zhǎng)速率，使真菌提前進(jìn)入靜止期，并且減緩了真菌的衰亡速率。同時(shí)漆酶預(yù)處理后的堿木素也改變了真菌木質(zhì)素降解酶系的活性，使Te 分泌的漆酶和LiP 活性分別顯著提升43.3%和58.5%，將PC 分泌的漆酶和MnP 活性分別提升35.9% 和31.6%。

（2）通過測(cè)試酶菌預(yù)處理過程中堿木素降解率的變化以及對(duì)酶菌預(yù)處理后堿木素物化性質(zhì)的表征，發(fā)現(xiàn)La+PC 體系對(duì)堿木素的降解率較單一PC提升6.7%。FTIR 分析結(jié)果表明，經(jīng)酶菌協(xié)同體系預(yù)處理后的堿木素在指紋區(qū)域官能團(tuán)吸收峰顯著減少，其中La+Te體系處理后的堿木素各官能團(tuán)吸收峰最低，但與單一Te 官能團(tuán)吸收峰相差不大，表明漆酶對(duì)Te 在堿木素官能團(tuán)改性作用方面的提升有限。但漆酶的預(yù)處理使PC 對(duì)堿木素官能團(tuán)的改性效果顯著提升。SEM 和孔徑分析表明，酶菌協(xié)同體系預(yù)處理后的堿木素表面結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，表面孔隙增多，堿木素平均孔徑顯著增大。

（3）通過酶菌協(xié)同作用的方式強(qiáng)化堿木素的降解，同時(shí)削弱堿木素對(duì)后續(xù)酶吸附的影響。其中La+Te體系處理后的堿木素對(duì)纖維素酶的最大吸附量較對(duì)照組降低了51.5%，對(duì)酶的非生產(chǎn)性吸附量最少，從而使還原糖的產(chǎn)量較對(duì)照組提高了71.5%。