7F型肺炎鏈球菌多糖競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法的建立

曾華英張偉林宏輝

（1.四川大學(xué)生命科學(xué)院 四川成都 610064；2.成都生物制品研究所有限責(zé)任公司 四川成都 610023）

7F型肺炎鏈球菌多糖競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法的建立

曾華英1，2張偉2林宏輝1

（1.四川大學(xué)生命科學(xué)院 四川成都 610064；2.成都生物制品研究所有限責(zé)任公司 四川成都 610023）

目的：建立檢測(cè)7F型肺炎鏈球菌莢膜多糖的方法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA），檢測(cè)發(fā)酵過(guò)程中多糖的濃度。方法：包被物為7F型肺炎鏈球菌多糖，競(jìng)爭(zhēng)物為待測(cè)多糖，建立間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，并驗(yàn)證其準(zhǔn)確性和精密度。結(jié)果：最佳多糖包被質(zhì)量濃度為2.5ug/ml，多糖抗體血清稀釋度為1：8×104。在檢測(cè)范圍為2.5～30μg/mL時(shí)呈線(xiàn)性相關(guān)，7F的最低檢測(cè)限為1.5μg/mL。回歸方程為B/B0=-0.4075 Pn7F+0.7632，R2=0.9952.樣品加標(biāo)回收率為95.13%-105%。結(jié)論：本研究新建的ELISA方法準(zhǔn)確性和精密度較好，能特異性地檢測(cè)7F型肺炎球菌多糖。

肺炎鏈球菌 多糖 競(jìng)爭(zhēng)ELISA 硫酸蒽酮法

肺炎鏈球菌是革蘭氏陽(yáng)性菌,是社區(qū)獲得性肺炎最常見(jiàn)的病因,并引起腦膜炎、敗血癥、中耳炎等疾病。目前抗生素耐藥性日益加劇,研發(fā)相關(guān)疫苗顯得尤為重要。肺炎鏈球菌的主要致病因子為莢膜多糖,其具有良好的免疫原性和安全性。在已分離得到的90個(gè)血清型肺炎鏈球菌中,約有20多個(gè)血清型涵蓋了大約90%的致病原。已上市的23價(jià)肺炎莢膜多糖疫苗對(duì)小于2 周歲及大于60 周歲的高危人群的保護(hù)性較差,而7價(jià)肺炎結(jié)合疫苗具有很好的免疫效果,但由于血清型覆蓋范圍有限而影響其在更廣的范圍應(yīng)用。13價(jià)結(jié)合疫苗血清型覆蓋更廣,為國(guó)內(nèi)的肺炎球菌性疾病的預(yù)防帶來(lái)很大的幫助。7F血清型在13價(jià)肺炎結(jié)合疫苗內(nèi),根據(jù)相關(guān)資料,制備出7F型莢膜多糖。

硫酸蒽酮法是檢測(cè)肺炎莢膜多糖的常規(guī)方法。糖在濃硫酸作用下生成糠醛或羥甲基糠醛,與蒽酮反應(yīng)生成藍(lán)綠色糠醛衍生物。在一定波長(zhǎng)范圍內(nèi),顏色的深淺與糖的含量成正比。硫酸蒽酮方法只能測(cè)定總碳水化合物,不適合于細(xì)菌發(fā)酵過(guò)程的培養(yǎng)。因?yàn)榧?xì)菌培養(yǎng)中含有大量的葡萄糖等雜質(zhì)會(huì)干擾多糖測(cè)定結(jié)果,而且其靈敏性欠佳,部分血清型多糖在較高濃度才能被檢出。應(yīng)用速率比濁法和火箭免疫電泳法也可以檢測(cè)培養(yǎng)中的多糖含量,但是這些方法需要特殊的設(shè)備和大量的血清,不利于生產(chǎn)成本的控制。

表1 方陣法確定肺炎鏈球菌7F型多糖最適包被濃度

表2 方正法確定肺炎鏈球菌7F型多糖最適血清工作濃度

表3 不同多糖濃度Pn7F抑制率

本研究通過(guò)建立競(jìng)爭(zhēng)ELISA法對(duì)培養(yǎng)過(guò)程中的7F多糖濃度檢測(cè),監(jiān)控多糖發(fā)酵和純化,提高多糖收率有著重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料和設(shè)備

7F肺炎鏈球菌莢膜多糖及標(biāo)準(zhǔn)品（ATCC）,低溫保存；7F血清購(gòu)自丹麥血清研究所；酶標(biāo)二抗為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔血清、四甲基聯(lián)苯胺顯色液（TMB）購(gòu)自美國(guó)KPL公司。酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Molecular Devices公司,型號(hào)為Versamax。96孔酶標(biāo)板購(gòu)自丹麥Nunc公司。

1.2建立檢測(cè)方法

表4 7F血清型肺炎鏈球菌多糖競(jìng)爭(zhēng)ELlSA的準(zhǔn)確性和批內(nèi)精密度

圖1 肺炎鏈球菌7F型多糖包被濃度確定

圖2 肺炎球菌7F多糖血清工作濃度確定

圖3 肺炎球菌7F多糖競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

1.2.1 確定最適包被抗原濃度和多糖抗血清工作濃度

系列稀釋7F肺炎球菌多糖標(biāo)準(zhǔn)品和多糖抗體血清,采用方陣滴定法確定最適抗原包被濃度和血清濃度。在96孔酶標(biāo)板中用PBS（PH7.4）溶液橫向倍比稀釋包被抗原,100ul/孔,2-8°過(guò)夜。次日取出洗板,用3%BSA的PBS封閉液300ul/孔室溫封閉1小時(shí)。洗板加入待測(cè)多糖樣品和多糖抗體血清,分別為50ul/孔,室溫1小時(shí)；洗板后加入二抗,100ul/孔,室溫45分鐘；洗板,加入TMB顯色,室溫15min后加入0.5mol/LH2S04終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀讀取450nm波長(zhǎng)的吸光度,確定最適包被濃度和多糖抗體血清工作濃度。

1.2.2 建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

最適包被濃度包被酶標(biāo)板,利用建立的競(jìng)爭(zhēng)ELISA法對(duì)7F多糖標(biāo)準(zhǔn)品不同濃度進(jìn)行檢測(cè)。以多糖濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo),以各標(biāo)準(zhǔn)品濃度吸光度值為縱坐標(biāo)繪制曲線(xiàn),該曲線(xiàn)在一定自變量范圍內(nèi)呈線(xiàn)性相關(guān),計(jì)算出回歸方程和相關(guān)系數(shù)（R2）。

1.3 驗(yàn)證方法

圖4肺炎球菌7F多糖競(jìng)爭(zhēng)ELISA特異性驗(yàn)證

1.3.1 特異性驗(yàn)證

將7F型肺炎球菌標(biāo)準(zhǔn)多糖高濃度（200ug/ml）與其他型肺炎多糖（1,6B,9V型20ug/ml

）等體積混合.用建立的競(jìng)爭(zhēng)ELISA法檢測(cè)7F型肺炎球菌多糖的質(zhì)量濃度,對(duì)照加入同體積的PBS（7.4）和7F型標(biāo)準(zhǔn)多糖,比較兩者的結(jié)果。

1.3.2 準(zhǔn)確度驗(yàn)證

用建立的競(jìng)爭(zhēng)ELISA法檢測(cè)已知樣品及在該樣品中添加高中低三個(gè)濃度的7F型多糖標(biāo)準(zhǔn)品的加標(biāo)樣品。每個(gè)樣品測(cè)定3次,計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差和加標(biāo)回收率。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 最適抗原包被濃度和多糖抗體血清工作濃度

根據(jù)每個(gè)血清稀釋度最大反應(yīng)對(duì)應(yīng)的包被濃度,確定最適抗原包被濃度為2.5ug/ml,見(jiàn)表1和圖1。

綜合考慮靈敏度與反應(yīng)值,當(dāng)抗多糖血清稀釋度為1：8×104時(shí),靈敏度較高,見(jiàn)表2與圖2。

2.2 檢測(cè)范圍及標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的確定

包被濃度2.5ug/ml,血清稀釋度為1：8×104進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定,制備標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。將不同濃度Pn7F對(duì)應(yīng)的A450轉(zhuǎn)換為B/B0,無(wú)多糖抑制時(shí)的A450為B0,各質(zhì)量濃度的肺炎球菌多糖抑制時(shí)的A450為B。由表3可知,當(dāng)多糖質(zhì)量濃度大于1.25ug/ml 時(shí),有明顯抑制作用。最低檢測(cè)限為1.25 ug/ml 。B/B0與lg［Pn7F］ 在一定自變量范圍內(nèi)呈線(xiàn)性相關(guān)。圖3可知Pn7F在2.5-30ug/ml的質(zhì)量濃度范圍內(nèi),具有良好的線(xiàn)性,回歸方程y = -0.4075x + 0.7632和相關(guān)系數(shù)R2=0.9952。

2.2 特異性驗(yàn)證

將肺炎球菌7F型標(biāo)準(zhǔn)多糖高濃度（200ug/ml）與若干其他型肺炎多糖（1,6B,9V,14,19F型40ug/ml）等體積混合.用建立的競(jìng)爭(zhēng)ELISA法檢測(cè)Pn7F的多糖質(zhì)量濃度,對(duì)照加入同體積的Pn7F型標(biāo)準(zhǔn)多糖與PBS（PH7.4）混合,比較兩者的結(jié)果,P＞0.05二者無(wú)明顯差異,見(jiàn)圖4。

2.3 準(zhǔn)確性和批內(nèi)精密度

用建立的競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法做加樣回收,在已知多糖濃度A中分別加入高中低三個(gè)濃度B（5ug/ml）,C（15ug/ml）,D（20ug/ml）的7F多糖標(biāo)準(zhǔn)品的樣品,在A450nm測(cè)得吸光度,A值為11.48ug/ml,回收率在95.13%-105%,批內(nèi)RSD在0.98%-1.28%,結(jié)果見(jiàn)表4。

3 討論

肺炎球菌多糖培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生多樣雜質(zhì),如果要采用硫酸咔唑、硫酸蒽酮等化學(xué)方法是檢測(cè)培養(yǎng)過(guò)程中的莢膜多糖含量,就需要對(duì)樣品進(jìn)行超濾離心等多步預(yù)處理來(lái)除去雜質(zhì)。步驟不僅繁瑣,而且會(huì)損失多糖,無(wú)法真實(shí)反映發(fā)酵過(guò)程的多糖表達(dá)量。速率比濁法和火箭免疫電泳法需要大量的血清和特殊設(shè)備,生產(chǎn)成本增加。競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附法有直接法和間接法兩種,前者需要預(yù)先制備酶標(biāo)抗原或抗體,步驟繁瑣且重復(fù)性不佳。本方法研究間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法檢測(cè)多糖,利用多糖抗體（一抗）與多糖結(jié)合后,加入廣譜抗兔抗體酶標(biāo)二抗,與第一抗體反應(yīng)有信號(hào)放大作用,其靈敏度明顯高于化學(xué)法。本研究通過(guò)優(yōu)化多糖包被濃度及多糖抗血清稀釋度,在保證較大檢測(cè)范圍且良好線(xiàn)性的情況下,有效減少了多糖抗血清的用量（稀釋度為1∶8×104）,降低了檢測(cè)成本。同時(shí)驗(yàn)證了該法的特異性和準(zhǔn)確度、精密度,結(jié)果表明該法穩(wěn)定,適用于監(jiān)控多糖培養(yǎng)過(guò)程中的濃度變化。

［1］李雪蓮，汪麗.七價(jià)肺炎球菌結(jié)合疫苗預(yù)防嬰幼兒肺炎的臨床分析［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2011，40（5）：1523.

［2］李巖松，柳增善，周玉等.伏馬菌素FB2間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法的建立［J］.中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2009，29（9）：1204-1207.

Q3-3

A

1674-2060（2016）03-0019-03

曾華英（1981—），四川大學(xué)生命科學(xué)院2012級(jí)碩士研究生，研究方向：生物工程。林宏輝，四川大學(xué)生命科學(xué)院教授，研究方向：植物逆境分子生物學(xué)及植物代謝工程。