茯苓β-tubulin基因?qū)崟r熒光定量PCR體系的建立和評估

吳亞運，趙小龍，胡炳雄，陳　平，張紹鵬

(武漢輕工大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023)

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茯苓β-tubulin基因?qū)崟r熒光定量PCR體系的建立和評估

吳亞運，趙小龍，胡炳雄，陳平，張紹鵬

(武漢輕工大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023)

旨在以不同生長時期茯苓為材料，β-tubulin基因為內(nèi)參基因，建立實時熒光定量PCR體系。根據(jù)GenBank上同為真菌的黃曲霉菌β-tubulin基因保守區(qū)域設(shè)計內(nèi)參引物，以茯苓菌絲體、初期菌核和成熟期菌核cDNA為模版，檢測內(nèi)參引物的特異性和穩(wěn)定性；并對PCR反應(yīng)體系中的引物濃度和模板濃度進(jìn)行優(yōu)化；最后利用茯苓轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中6個顯著差異表達(dá)基因?qū)?yōu)化后的反應(yīng)體系進(jìn)行表達(dá)分析與驗證。結(jié)果顯示，綜合擴(kuò)增曲線和溶解曲線分析，在茯苓不同生長發(fā)育時期，β-tubulin基因表達(dá)水平基本恒定；對比內(nèi)參引物在不同濃度條件下的擴(kuò)增效率，得到模板和引物的最優(yōu)濃度分別為80 ng/μL和1 μmol/L。在優(yōu)化后的反應(yīng)體系中，6個差異表達(dá)基因的表達(dá)變化趨勢與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果基本一致，得到的線性相關(guān)系數(shù)r值均大于0.9，呈顯著性正相關(guān)。成功地建立了以β-tubulin基因為內(nèi)參基因的茯苓實時熒光定量PCR體系。

茯苓；β-tubulin；實時熒光定量PCR；SYBRGreen I；轉(zhuǎn)錄組

1　引言

實時熒光定量PCR(real-time fluorescence quantitativePCR，RT-PCR)是一種興起于上世紀(jì)90年代的核酸定量分析技術(shù)。它集合了PCR靈敏度高、DNA雜交特異性強(qiáng)和光譜技術(shù)高精度定量的特點，通過探測PCR反應(yīng)中熒光信號的變化，獲得特定區(qū)段中擴(kuò)增產(chǎn)物的定量結(jié)果，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)及醫(yī)藥檢疫等研究領(lǐng)域[1-3]。RT-PCR分為絕對定量和相對定量，絕對定量是根據(jù)已知標(biāo)準(zhǔn)曲線來測定目的基因在樣本中的精確拷貝數(shù)[4]。相對定量是測定目的基因在2個或多個樣本中含量的相對比例，不對基因的表達(dá)水平進(jìn)行精確拷貝數(shù)計算。相對定量常需內(nèi)參基因作為基準(zhǔn)，利用內(nèi)參基因在樣品不同發(fā)育時期和不同組織細(xì)胞中表達(dá)水平趨于恒定的特點，對供試基因進(jìn)行校正和標(biāo)準(zhǔn)化[5]。常用的內(nèi)參基因有β-tubulin、Tub、GAPDH、β-actin、rRNA等[6-7]，其中β-tubulin基因是細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)元件微管的基本結(jié)構(gòu)單位，具有序列高度保守、mRNA表達(dá)量高且穩(wěn)定等特點，廣泛運用于真核生物研究中[8-9]。

茯苓Wolfiporiacocos隸屬于擔(dān)子菌門Basidiomycetes，多孔菌科Polyporaceae，的高等真菌，其菌核是一種傳統(tǒng)中藥，《中國藥典》2015版收錄有茯苓與茯苓皮兩味藥材[10]。茯苓味甘、淡、性平，具有利尿滲濕、健脾寧心之功效，是我國珍貴的中藥資源[11-12]。目前對茯苓的藥用研究主要集中于其有效成分、化學(xué)結(jié)構(gòu)、藥理作用等宏觀層面，但在微觀的分子領(lǐng)域，即通過研究茯苓差異表達(dá)基因的結(jié)構(gòu)和功能，對茯苓代謝產(chǎn)物的合成條件與途徑的調(diào)控方面卻少有報道。

本研究根據(jù)GenBank上同為真菌的黃曲霉菌β-tubulin基因保守區(qū)域設(shè)計內(nèi)參引物，以茯苓菌絲體、初期菌核和成熟菌核的cDNA為模版，基于Applied Biosystems 7500實時熒光定量PCR系統(tǒng)，采用SYBR Green I 作為熒光染料，并對引物濃度和模板濃度2個反應(yīng)因子進(jìn)行優(yōu)化，建立實時熒光定量PCR反應(yīng)體系。利用Illumina Hiseq 2000高通量測序獲得茯苓菌絲體、初期菌核和成熟菌核的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，使用Trinity和TGICL軟件實現(xiàn)Unigene的de novo拼接，基于BLAST完成Unigene的蛋白質(zhì)功能注釋、KOG功能注釋、GO分類和KEGG代謝通路分析。并從中選取6個差異表達(dá)基因：Comp12014-c0-seq1、Comp16737-c0-seq5、Comp13512-c0-seq1、Comp17073-c0-seq1、Comp19942-c1-seq2、Comp18048-c0-seq9，對優(yōu)化后的PCR反應(yīng)體系進(jìn)行評測，均得到理想結(jié)果。為以β-tubulin基因作為內(nèi)參基因進(jìn)行茯苓代謝產(chǎn)物生物合成相關(guān)功能基因的差異表達(dá)驗證奠定基礎(chǔ)。

2　材料與方法

2.1材料

茯苓樣品Wolfiporiacocos菌核于2015年采自湖北省羅田縣九資河茯苓種植基地。根據(jù)Shu等[13]報道，將菌核接種至PDA培養(yǎng)基，經(jīng)分離純化得到純種茯苓菌種，通過菌種培養(yǎng)進(jìn)一步得到茯苓菌絲。

真菌RNA提取試劑盒(RN53 EASYspin Plus)，購自北京艾德萊生物公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT reagent Kit)、DNA標(biāo)志物(DL2000 DNA Marker)、實時熒光定量PCR試劑盒(SYBR Premix ExTaq)、PCR試劑盒(PrimeScript?RT Master Mix)，均購自TaKaRa公司。PCR儀：Eppendorf公司；超微量紫外分光光度計：Merinton公司；ABI7500實時熒光定量PCR儀：美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；Tanon Gis2010凝膠成像系統(tǒng)：天能科技(上海)公司。

2.2方法

2.2.1總RNA提取、質(zhì)量檢測與反轉(zhuǎn)錄

茯苓菌絲體、初期菌核和成熟菌核總RNA的提取按照試劑盒說明書操作，總RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝聚膠電泳檢測完整性、超微量紫外分光光度計檢測濃度和純度。以提取的茯苓菌絲體、初期菌核和成熟菌核總RNA為模版，Oligo-dT為引物，分別反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，保存于-20 ℃。

2.2.2引物設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank上同為真菌的黃曲霉菌β-tubulin基因保守區(qū)域為參照，依據(jù)RT-PCR引物設(shè)計原則，利用NoePrimer2.03和Primer5.0引物設(shè)計軟件設(shè)計引物β-tubulin-F、R，用于擴(kuò)增茯苓β-tubulin基因片段，推測目的片段長度為130 bp左右。引物由上海桑尼生物科技有限公司合成，β-tubulin-F：5’- GCATATCAATAAGCGGAGGA-3’，β-tubulin-R：5’- GCACTTCTCCAGACTACAAC-3’。

2.2.3β-tubulin基因目的片段擴(kuò)增及鑒定

以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模版，β-tubulin-F、R為引物，進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μL：ddH2O 8.5μL，2×Tap PCR Mastermix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，cDNA 2 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，進(jìn)行35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。分別取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝聚膠電泳檢測目的片段擴(kuò)增長度及內(nèi)參引物退火溫度的特異性。

2.2.4模版濃度的優(yōu)化

選用茯苓菌絲體cDNA為模版，通過超微量紫外分光光度計檢測其濃度，在所得cDNA濃度范圍內(nèi)依次設(shè)置0.5 ng/μL,5 ng/μL,20 ng/μL,60 ng/μL,80 ng/μL，5個模版濃度梯度，在β-tubulin內(nèi)參引物濃度相同的前提下，從RT-PCR反應(yīng)后得到的擴(kuò)增曲線從中選取最優(yōu)模版濃度。

2.2.5引物濃度的優(yōu)化

選取最優(yōu)濃度的茯苓菌絲體cDNA為模版，通過超微量紫外分光光度計檢測β-tubulin內(nèi)參引物濃度，在所得濃度范圍內(nèi)依次設(shè)置0.1 μmol/L,0.5 μmol/L,1 μmol/L,5,10 μmol/L，5個引物濃度梯度，從RT-PCR反應(yīng)后得到的擴(kuò)增曲線從中選取最優(yōu)引物濃度。

2.2.6β-tubulin內(nèi)參基因適用性驗證

以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模版，β-tubulin-F、R為引物，選取最優(yōu)反應(yīng)條件，由RT-PCR反應(yīng)后得到的溶解曲線和擴(kuò)增曲線分別檢測內(nèi)參引物的特異性和目的基因的表達(dá)水平。

2.2.7優(yōu)化后反應(yīng)體系的評測

從茯苓轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中選取6個顯著差異表達(dá)基因：Comp12014-c0-seq1、Comp16737-c0-seq5、Comp13512-c0-seq1、Comp17073-c0-seq1、Comp19942-c1-seq2、Comp18048-c0-seq9。通過對比差異表達(dá)基因的RPKM值(表1)與其在反應(yīng)過程中實際表達(dá)水平的變化趨勢，對優(yōu)化后的RT-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行重復(fù)性和穩(wěn)定性檢測。根據(jù)茯苓轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，利用NoePrimer2.03和Primer5.0引物設(shè)計軟件，分別對6個差異表達(dá)基因設(shè)計特異性引物(表1)，引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。

表1差異表達(dá)基因信息

基因名稱引物序列RPKM(菌絲體/初期菌核/成熟菌核)值功能Comp12014-c0-seq1正:5’-ACGGAGGTTGTGTATC-3’反:5’-CTGGTGAGAGTCTTGTGTG-3’0.13/204.117/96.6633Dihydroxy-acidde-hydrataseComp16737-c0-seq5正:5’-CGCCTGCTCACTATCT-3’反:5’-GCTTTGGTGATGTTCG-3’5.31/14.9367/26.43G-proteincoupledreceptorsignalingpathwayComp13512-c0-seq1正:5’-GATTTTGTGTTTGGTGG-3’反:5’-GGTACTGTCCGCTGAT-3’415.067/56.5567/302.547CysteineproteinaseComp17073-c0-seq1正:5’-TGGTCGGTAAGGTTCA-3’反:5’-CGATTATCTTGATTGCG-3’6.39333/2.46667/0.45CytochromeP450monoox-ygenaseComp19942-c1-seq2正:5’-AGCCAGTAAAGGGTCC-3’反:5’-ATCCGTCTGTCGTCGT-3’9.54667/26.62/9.1467Mitogen-activatedproteinkinaseComp18048-c0-seq9正:5’-GTCCAGTGGCATTTAG-3’反:5’-CTTTGTCTGCTGTGTCT-3’13.7033/4.83/2.67G-proteincoupledreceptorsignalingpathway

3　結(jié)果

3.1總RNA質(zhì)量檢測

采用1%瓊脂糖凝膠電泳對茯苓菌絲體、初期菌核和成熟菌核總RNA的完整性進(jìn)行檢測(圖1)。結(jié)果顯示總RNA中28S、18S和5S三條特征條帶清晰明亮，無DNA和其它雜質(zhì)的污染。表明總RNA未發(fā)生降解，完整性良好。

采用超微量紫外分光光度計對茯苓菌絲體、初期菌核和成熟菌核總RNA的濃度和純度進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示茯苓菌絲體、初期菌核和成熟菌核總RNA濃度分別為1 053 ng/μL、779 ng/μL和845 ng/μL，A260/A280值介于1.9—2.0之間，A260/A230值介于2.0—2.2之間。表明總RNA中無蛋白質(zhì)或酚類等有機(jī)物污染，具有較高的純度及濃度，滿足反轉(zhuǎn)錄和PCR實驗要求。

1-茯苓菌絲體總RNA　2-茯苓初期菌核總RNA　3-茯苓成熟菌核總RNA圖1　茯苓不同生長發(fā)育時期總RNA電泳結(jié)果

3.2β-tubulin基因目的片段的PCR擴(kuò)增檢測

采用1.5%瓊脂糖凝聚膠電泳對β-tubulin基因普通PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(圖2)。結(jié)果顯示，在茯苓菌絲體、初期菌核和成熟菌核這3個生長時期，β-tubulin基因擴(kuò)增得到的目的片段長度均在130 bp左右且無雜帶，與預(yù)期結(jié)果一致。表明β-tubulin-F、R引物特異性強(qiáng)，PCR反應(yīng)選取的引物退火溫度適宜，無需再進(jìn)行引物退火溫度的優(yōu)化。

M-Marker　1-茯苓菌絲體　2-茯苓初期菌核 3-茯苓成熟菌核圖2　β-tubulin基因目的片段PCR擴(kuò)增結(jié)果

3.3模板濃度優(yōu)化檢測

采用超微量紫外分光光度計檢測茯苓菌絲體cDNA濃度，用EASY Dilution試劑依次稀釋為0.5 ng/μL,5 ng/μL,20 ng/μL,60 ng/μL,80 ng/μL 5個濃度梯度，選取相同濃度的β-tubulin-F、R引物進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，并設(shè)置陰性對照1例，對cDNA模板濃度進(jìn)行優(yōu)化檢測(圖3)。結(jié)果顯示在濃度梯度的擴(kuò)增曲線中，當(dāng)模版濃度為80 ng/μL時，得到的Ct最小，擴(kuò)增效率最高，因此模板的最優(yōu)濃度為80 ng/μL。

圖3　模板濃度優(yōu)化結(jié)果

3.4引物濃度優(yōu)化檢測

在模板最優(yōu)濃度確定后， 采用超微量紫外分光光度計檢測β-tubulin-F、R引物濃度，用EASY Dilution試劑依次稀釋為0.1μmol/L，0.5μmol/L，1μmol/L，5μmol/L，10 μmol/L 5個濃度梯度，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，并設(shè)置陰性對照1例，對引物濃度進(jìn)行優(yōu)化檢測(圖4)。結(jié)果顯示在濃度梯度的擴(kuò)增曲線中，當(dāng)引物濃度為1 μmol/L時，得到的擴(kuò)增曲線最好，擴(kuò)增效率最高，因此引物的最優(yōu)濃度為1 μmol/L。

圖4　引物濃度優(yōu)化結(jié)果

3.5β-tubulin內(nèi)參基因適用性檢測

圖5　β-tubulin基因擴(kuò)增曲線

分別以茯苓菌絲體、初期菌核和成熟菌核的cDNA為模板，β-tubulin-F、R為引物，選取最優(yōu)反應(yīng)條件，并設(shè)置陰性對照1例進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，對β-tubulin內(nèi)參基因的適用性進(jìn)行檢測(圖5—6)。結(jié)果顯示，在茯苓不同生長時期的擴(kuò)增曲線中，β-tubulin內(nèi)參基因CT值均在19個循環(huán)左右，且無較大差異，說明該基因在茯苓不同發(fā)育時期表達(dá)量穩(wěn)定；在3個不同時期的溶解曲線中，β-tubulin內(nèi)參基因均在84.5 ℃時出現(xiàn)單一特異峰，且峰形銳利，由此進(jìn)一步得知所用內(nèi)參引物擴(kuò)增出的目的條帶單一，無引物二聚體及非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，特異性強(qiáng)。

圖6　β-tubulin基因熔解曲線

3.6最優(yōu)RT-PCR反應(yīng)體系的確立與評測

通過對茯苓β-tubulin基因的實時熒光定量PCR反應(yīng)體系條件的摸索，成功建立了基于SYBR Green I為熒光染料的相對定量RT-PCR方法，其最優(yōu)反應(yīng)體系為20 μL體系：SYBR Premix Ex TaqTM II 10 μL，ROX Reference Dye II 0.4 μL，1 umol/L上、下游引物各1 μL，80 ng/μL的cDNA模板2 μL，RNase Free dd H2O 6 μL。最佳PCR反應(yīng)程序為：

95 ℃預(yù)變性30 s,95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，進(jìn)行40個循環(huán)。

選取茯苓轉(zhuǎn)錄組中6個差異表達(dá)基因：Comp12014-c0-seq1、Comp16737-c0-seq5、Comp13512-c0-seq1、Comp17073-c0-seq1、Comp19942-c1-seq2、Comp18048-c0-seq9，以茯苓菌絲體、初期菌核和成熟菌核的cDNA為模版，運用(表1)中引物，并設(shè)置陰性對照1例進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。通過比較差異表達(dá)基因在茯苓不同生長時期的RPKM值與其在RT-PCR反應(yīng)中實際表達(dá)量水平的變化趨勢，對優(yōu)化后的反應(yīng)體系進(jìn)行評測(圖7)。結(jié)果顯示，6個差異表達(dá)基因的表達(dá)量變化趨勢與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果基本一致，進(jìn)一步由6個差異表達(dá)基因的RPKM值和其在RT-PCR中得到的CT值，計算出2組數(shù)據(jù)間的線性相關(guān)系數(shù)，得到r值均大于0.9，表明為顯著性正相關(guān)。

4　討論

實時熒光定量PCR作為目前分析目的基因轉(zhuǎn)錄水平最為敏感的方法，以操作簡便、封閉無污染、重復(fù)性好、結(jié)果易于分析[14]而廣泛應(yīng)用于各學(xué)科研究中。但該方法所涉及前期準(zhǔn)備事項繁多，如內(nèi)參基因篩選、樣品RNA提取、模板和引物濃度的選擇及所用試劑等因素都會對最終的定量結(jié)果造成影響。因此，對比性的選取適用于供試樣品的最優(yōu)反應(yīng)條件，才能確保定量結(jié)果的準(zhǔn)確性[15-16]。

反應(yīng)體系中選用的SYBR Premix Ex Taq II是采用SYBR Green I嵌合熒光法進(jìn)行實時熒光定量PCR反應(yīng)的專用試劑， SYBR Premix Ex Taq II中已將DNA聚合酶、Buffer、dNTP、SYBR Green I等試劑混合均勻，實驗時PCR反應(yīng)液的配制十分方便。另外，SYBR Premix Ex Taq II中添加了耐熱性RNaseH，在以cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)時，可以最大限度抑制cDNA中殘存的mRNA對PCR反應(yīng)造成的阻害作用。SYBR Green I是一種脫氧核糖核酸結(jié)合染料，能與任意雙鏈DNA在任意反應(yīng)條件下結(jié)合并發(fā)出熒光[17-19]。所以當(dāng)RT-PCR中出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增時，同樣會出現(xiàn)熒光信號積累，在反應(yīng)過程中引物濃度過高或模板濃度過低都將導(dǎo)致PCR非特異性擴(kuò)增，進(jìn)而影響定量結(jié)果[20-21]。本研究中對引物和模板各設(shè)置5組濃度梯度進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。通過對比擴(kuò)增曲線在不同濃度條件下的擴(kuò)增效率，確定模板和引物的最佳反應(yīng)濃度，從而避免了非特異性擴(kuò)增及擴(kuò)增效率差異對定量結(jié)果的影響。

圖7　差異表達(dá)基因的表達(dá)量驗證

β-tubulin基因作為內(nèi)參基因常用于相對定量結(jié)果的校正，但尚未見到有關(guān)茯苓β-tubulin基因用于熒光定量PCR研究的報道。近年來，隨著基因克隆和測序技術(shù)的不斷發(fā)展，對個體在不同生長階段及各組織細(xì)胞中基因表達(dá)水平的定量分析，已成為探索生物體生命活動規(guī)律和調(diào)節(jié)機(jī)制的關(guān)鍵手段。本研究從茯苓轉(zhuǎn)錄組中選取參與調(diào)控細(xì)胞色素P450氧化酶、半胱氨酸蛋白酶、絲裂原活化蛋白酶等生物酶合成的6個顯著差異表達(dá)基因，以β-tubulin基因為內(nèi)參基因，在茯苓菌絲體、初期菌核和成熟菌核3個生長發(fā)育時期進(jìn)行表達(dá)差異驗證。得到的表達(dá)量變化趨勢與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果基本一致，由6個差異表達(dá)基因的RPKM值與其在RT-PCR中的CT值，得到2組數(shù)據(jù)間的線性相關(guān)系數(shù)r值均大于0.9，呈顯著性正相關(guān)。本研究建立的茯苓β-tubulin基因RT-PCR方法，經(jīng)實驗結(jié)果表明，操作簡單有效、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好，對進(jìn)一步闡明茯苓相關(guān)基因的功能和茯苓生長發(fā)育中物質(zhì)合成與代謝通路的分子作用機(jī)制提供了有效的方法學(xué)基礎(chǔ)。

5　結(jié)論

本研究以茯苓3個不同生長階段的cDNA為模板，β-tubulin基因作為內(nèi)參基因，通過對引物擴(kuò)增效率與特異性的檢測以及模板和引物濃度的優(yōu)化，建立了茯苓實時熒光定量PCR體系。并從茯苓轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中挑選出6個顯著差異表達(dá)基因，對比分析基因表達(dá)量變化趨勢，進(jìn)一步對PCR體系進(jìn)行實驗驗證。

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Development and evaluation of real-time PCR conditioningWolfiporiacocosusingβ-tubulingene

WUYa-yun,ZHAOXiao-long,HUBing-xiong,CHENPing,ZHANGShao-peng

(School of Biology and Pharmaceutical Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023,China)

The aim of this study is to develop a real-time flourescence quantitative PCR condition for theβ-tubulingene of Wolfiporia cocos in different growth stage. The specific primers ofβ-tubulingene were designed by the conserved sequence of Aspergillus flavus, cDNA of Wolfiporia cocos mycelia, early sclerotium and mature sclerotium were used to evaluate the specificity and stability ofβ-tubulingene; And optimize the reaction factors such as primers concentration and template concentration. Then, six significantly differentially expressed genes from Wolfiporia cocos transcriptome were used to validate our optimized PCR reaction system. The results showed as follows, according to the amplification curve and melting curve, the expression ofβ-tubulinwas showed stable during different developmental stages in Wolfiporia cocos; The optimum concentration of cDNA template and primers were respectivley 80 μg/uL and 1 μmol/L. And, the expression dynamics tendency between differentially expressed genes are basically consistent with transcriptome data Wolfiporia cocos, in which the liner correlation coefficient r was more than 0.9, showing a significant positive correlation. The real-time flourescence quantitative PCR system for Wolfiporia cocos was successfully established whichβ-tubulingene as reference gene.

Wolfiporiacocos；β-tubulin；real-time fluorescence quantitative PCR；SYBRGreen I；transcriptome

2016-06-01.

吳亞運(1990-)，男，碩士研究生， E-mail：282595491@qq.com.

張紹鵬(1982-)，男，博士， E-mail: zsp0106@qq.com.

武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院院立項目 (2015s4).

2095-7386(2016)03-0049-07

10.3969/j.issn.2095-7386.2016.03.009

Q 503

A