結(jié)核分枝桿菌 Rv2986c T、B細(xì)胞表位分析

孫　妍，王心倩，占衛(wèi)紅，雷　航，陳高瞻，余曉麗

(武漢輕工大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023)

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結(jié)核分枝桿菌 Rv2986c T、B細(xì)胞表位分析

孫妍，王心倩，占衛(wèi)紅，雷航，陳高瞻，余曉麗

(武漢輕工大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023)

預(yù)測(cè)并分析結(jié)核分枝桿菌Rv2986c的 CD4+T 、CD8+T 和B細(xì)胞表位分布情況。方法在NCBI數(shù)據(jù)庫上查詢并獲得Rv2986c的氨基酸序列，用 BLAST分析其與結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群及人類蛋白的同源性。利用NetMHC數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)并分析目的蛋白的CD4+T細(xì)胞表位的分布情況；利用SYFPEITHI、NetMHC、BIMAS和IEDB數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)并分析目的蛋白的CD8+T 細(xì)胞表位的分布情況。然后，綜合CD4+T與CD8+T細(xì)胞表位預(yù)測(cè)情況，篩選出優(yōu)勢(shì)T細(xì)胞表位肽段。利用IEDB和ABCpred數(shù)據(jù)庫分析目的蛋白的B細(xì)胞抗原表位，篩選出優(yōu)勢(shì)B細(xì)胞表位肽段。通過預(yù)測(cè)與分析，初步篩選出CD4+T細(xì)胞的強(qiáng)結(jié)合候選表位10個(gè)，弱結(jié)合候選表位245個(gè)，CD8+T 細(xì)胞候選表位3個(gè)；綜合CD4+T與CD8+T細(xì)胞表位預(yù)測(cè)結(jié)果，最終篩選出1個(gè)優(yōu)勢(shì)T細(xì)胞表位肽段。綜合IEDB和ABCpred數(shù)據(jù)庫分析得出8條優(yōu)勢(shì)B細(xì)胞抗原表位。預(yù)測(cè)出來的T、B細(xì)胞候選表位將為結(jié)核病的特異性診斷及新的抗結(jié)核多表位疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。

結(jié)核分枝桿菌；Rv2986c；T細(xì)胞表位；B細(xì)胞表位

1　引言

結(jié)核病是一種嚴(yán)重危害人類身體健康的慢性傳染病，由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)感染所致[1]。據(jù)2015年WHO報(bào)[2]，全球有960萬新發(fā)結(jié)核病病例，其中包括48萬耐藥結(jié)核病(multiple drug resistant tuberculosis，MDR-TB)病例。我國2014年的新發(fā)肺結(jié)核人數(shù)為93萬，僅次于印度(220萬)和印度尼西亞(100萬)而位居全球第三位。但是有研究發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)在唯一用來預(yù)防結(jié)核病的疫苗——卡介苗(bacilluscalmette-guerinvaccine，BCG)只能預(yù)防嬰兒和兒童肺外血源播散性結(jié)核[3]，對(duì)成年人的保護(hù)作用效力不確定(0%—80%)[4]，這說明有些人在接種卡介苗后仍然有患結(jié)核病的風(fēng)險(xiǎn)。除此之外，對(duì)多重耐藥結(jié)核病而言其治療失敗率比一般敏感性結(jié)核病高出80倍[5]，這表明多重耐藥結(jié)核病在今后的治療中存在無藥可治的風(fēng)險(xiǎn)。面對(duì)如此嚴(yán)峻的結(jié)核病形勢(shì)我們迫切的需要尋找一種能代替BCG來預(yù)防結(jié)核病感染的新型疫苗。

對(duì)傳統(tǒng)疫苗來說，我們往往是將病原微生物或者完整的外源物質(zhì)作為抗原來激發(fā)機(jī)體的免疫應(yīng)答。但實(shí)際上僅僅只是外源物的一小段區(qū)域(抗原表位)在發(fā)揮免疫應(yīng)答作用。由此可見在表位水平篩選特定的優(yōu)勢(shì)B細(xì)胞表位與T細(xì)胞表位，對(duì)設(shè)計(jì)開發(fā)新型表位疫苗和抗體，和對(duì)疾病的預(yù)防和診斷有重要意義。目前尚未有關(guān)于Rv2986c的研究報(bào)道，旨在分析Rv2986c作為免疫標(biāo)志物對(duì)結(jié)核病的診斷檢測(cè)方面作用的可行性。

2　材料與方法

2.1材料

通過NCBI數(shù)據(jù)庫獲得MTB的Rv2986c蛋白序列(Gene ID: 888166；214aa)。

2.2同源性分析

通過NCBI數(shù)據(jù)庫中的BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)程序，將Rv2986c蛋白序列與結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群蛋白序列和人類蛋白序列分別進(jìn)行同源比對(duì)。

2.3CD4+T細(xì)胞表位預(yù)測(cè)

用在線軟件NetMHCⅡpan3.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services /NetMHC -IIpan/ )對(duì)目的蛋白的CD4+T細(xì)胞表位進(jìn)行預(yù)測(cè)，設(shè)定表位多肽長度為15個(gè)氨基酸殘基，選取經(jīng)典人白細(xì)胞抗原II類基因(HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR，包括A、B兩個(gè)基因座)中的HLA-DRB1-0101、0301、0401、0701、0802、0901、1101、1302、1501亞型為限定條件[6]，表位多肽與等位基因的結(jié)合性能評(píng)價(jià)值設(shè)定為50 nm，預(yù)測(cè)結(jié)果以結(jié)合值由強(qiáng)到弱次序排列輸出(強(qiáng)結(jié)合親和值<50 nm ，50 nm<弱結(jié)合親和值<500 nm )。

2.4CD8+T細(xì)胞表位預(yù)測(cè)

2.4.1SYFPEITHI對(duì)目的蛋白CD8+T細(xì)胞表位預(yù)測(cè)

用在線軟件SYFPEITHI(http://www.syfpeithi.de/bin/MHCServer.dll/Epitope Predic-tion.htm)對(duì)目的蛋白的CD8+T細(xì)胞表位進(jìn)行預(yù)測(cè)，選取經(jīng)典人白細(xì)胞抗原I類基因(HLA-A、HLA-B、HLA-C)HLA- A* 02: 01和HLA- A* 03: 01等位基因作為限定條件，設(shè)定表位多肽長度為9個(gè)氨基酸殘基，選取前2%的氨基酸表位進(jìn)行分析[7]。

2.4.2NetMHC對(duì)目的蛋白CD8+T細(xì)胞表位預(yù)測(cè)

用在線軟件NetMHC ( http://www.cbs.dtu.dk/service/NetMHC/)對(duì)目的蛋白的CD8+T細(xì)胞表位進(jìn)行預(yù)測(cè)。選取人類可能性最大的HLA-A 02 :01(A2 )和HLA-A0301(A3 )等位基因作為預(yù)測(cè)表位肽段的限定條件[8]，設(shè)定表位多肽長度為9個(gè)氨基酸殘基，結(jié)果以結(jié)合值由強(qiáng)到弱次序排列輸出(強(qiáng)結(jié)合親和值<50 nm ，50 nm<弱結(jié)合親和值<500 nm )。

2.4.3BIMAS對(duì)目的蛋白CD8+T細(xì)胞表位預(yù)測(cè)

用在線軟件BIMAS ( http://www- bimas.cit.nih.gov/molbio /hla_bind / )對(duì)目的蛋白的蛋白的CD8+T細(xì)胞表位進(jìn)行預(yù)測(cè)。選取HLA-A_0201及A3作為限定條件，設(shè)定表位多肽長度為9個(gè)氨基酸殘基。

2.4.4IEBD對(duì)目的蛋白CD8+T細(xì)胞表位預(yù)測(cè)

用在線軟件IEBD(http://tools.iedb.org/mhci/)對(duì)目的蛋白的CD8+T細(xì)胞表位進(jìn)行預(yù)測(cè)。選取HLA-0201、HLA-0301亞型作為限定條件，設(shè)定表位多肽長度為9個(gè)氨基酸殘基。選定親和值為0—500 nm的序列進(jìn)行分析。

2.5B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)

2.5.1IEDB對(duì)目的蛋白B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)

用在線軟件IEBD(http://tools.immuneepitope.org/tools/bcell/iedb_input)對(duì)目的蛋白進(jìn)行B細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)。分別用IEBD提供的五種參數(shù)方案(親水性方案、表面可及性方案、柔韌性方案、抗原性方案、二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)方案)進(jìn)行抗原表位預(yù)測(cè)。

2.5.2ABCpred對(duì)目的蛋白B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)

在線軟件ABCpred(http://www.imtech.res.in/raghava/abcpred/ABC _submis -sio n.html)是通過遞歸神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練得到的分?jǐn)?shù)對(duì)目的蛋白的B細(xì)胞表位進(jìn)行預(yù)測(cè)。提交目的蛋白序列，設(shè)定臨界值為0.51，選定表位肽段長度為16個(gè)氨基酸序列。

3　結(jié)果

3.1同源性分析結(jié)果

通過同源比對(duì)發(fā)現(xiàn)目的蛋白與MTB復(fù)合群(人型MTB、牛型MTB、非洲分枝桿菌和田鼠分枝桿菌和減毒牛分枝桿菌菌株，BCG)的同源性均為100% ，與非MTB的同源性有所降低(80%—60%，平均70% )，與其他細(xì)菌的同源性更低(最高80%，平均65%)，抗原序列與人類蛋白無同源性，該蛋白具有特異性抗原的潛質(zhì)，并不會(huì)出現(xiàn)與人類自身蛋白交叉感染的情況，具有較高的安全性[9]。

3.2CD4+T細(xì)胞表位預(yù)測(cè)結(jié)果

利用在線數(shù)據(jù)庫NetMHCⅡpan Server對(duì)目的蛋白表位進(jìn)行預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)結(jié)果見表1。從預(yù)測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同等位基因所結(jié)合的短肽數(shù)目相差比較顯著。其中目的蛋白僅在DRB1-0101和DRB1-1101等位基因處有強(qiáng)結(jié)合位點(diǎn)，分別為7個(gè)和3個(gè)。預(yù)測(cè)結(jié)果中，9個(gè)HLA-DRB1等位基因處均有弱結(jié)合位點(diǎn)，其中DRB1-1101結(jié)合位點(diǎn)最多，DRB1-1302結(jié)合位點(diǎn)最少。與CD8+T 細(xì)胞表位預(yù)測(cè)方法相比，CD4+T細(xì)胞表位預(yù)測(cè)更為復(fù)雜一些，NetMHCⅡpan Server是目前預(yù)測(cè)效果較好的在線工具。將NetMHCⅡpan Server 預(yù)測(cè)出來的15個(gè)氨基酸的表位肽與CD8+T細(xì)胞的表位肽綜合起來分析才能找到更可靠的表位肽段，然后再合成驗(yàn)證。

3.3CD8+T細(xì)胞表位預(yù)測(cè)結(jié)果

綜合4個(gè)不同的在線預(yù)測(cè)工具( SYFPEITHI、NetMHC、BIMAS和IEBD)對(duì)目的蛋白的CD8+T細(xì)胞表位進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果見表2。綜合4種工具預(yù)測(cè)出來結(jié)合能力都較強(qiáng)的九肽共3條，其表位氨基酸序列起始位點(diǎn)為94—102、105—113和113—121。

表1Rv2986c抗原CD4+T 細(xì)胞表位分布情況

HLA分子亞型Rv2986c的總肽段數(shù)為199強(qiáng)結(jié)合肽段數(shù)弱結(jié)合肽段數(shù)DRB1-0101762DRB1-0301016DRB1-040106DRB1-0701031DRB1-0802033DRB1-0901023DRB1-1101363DRB1-130204DRB1-150107總計(jì)10245

表2Rv2986c抗原CD8+T 細(xì)胞表位的綜合分析結(jié)果

氨基酸位點(diǎn)氨基酸序列SYFPEITHINetMHCBIMASIEDB得分親和值結(jié)合區(qū)強(qiáng)弱得分親和值94—102RLPAEGPAV22156.2弱結(jié)合69.552175.00105—113GVGASAAKK28294.74弱結(jié)合6.000151.00113—121KVAKKAPAK2923.16強(qiáng)結(jié)合6.00038.00

注：親和值越低表明結(jié)合能力越強(qiáng)；得分越高表示結(jié)合能力越強(qiáng)。

3.4CD4+T和CD8+T細(xì)胞表位綜合分析結(jié)果

將在線軟件預(yù)測(cè)得到的CD4+T和CD8+T細(xì)胞表位進(jìn)行整理分析。將預(yù)測(cè)得到的8條CD4+T細(xì)胞抗原和3條CD8+T細(xì)胞抗原綜合分析根據(jù)CD4+T細(xì)胞表位15肽覆蓋CD8+T細(xì)胞表位的9肽篩選出共同的優(yōu)勢(shì)肽段(表3)。通過綜合分析共得到1條優(yōu)勢(shì)抗原肽段，其起始位點(diǎn)為105—113，其序列為GVGASAAKK。

表3Rv2986c抗原CD4+T和CD8+T表位綜合分析結(jié)果

蛋白序列CD8+T表位肽段CD4+T表位肽段103-117GVGASAAKKKRGVGASAAKKVAKK

注：表中劃線部分即為優(yōu)勢(shì)抗原表位。

3.5B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)結(jié)果

綜合兩種在線軟件分析共篩選出8條優(yōu)勢(shì)B細(xì)胞抗原表位，見表4。由于B細(xì)胞處理抗原時(shí)不需要抗原提呈細(xì)胞(APC)處理，其抗原表位為構(gòu)象型表位具有一定的空間構(gòu)象，B抗原表位是由那些空間上鄰近但實(shí)際上不連續(xù)的氨基酸組成，因此其表位肽段長度不一。

表4B細(xì)胞優(yōu)勢(shì)表位

氨基酸起始位點(diǎn)表位肽序列29—44DTIVRAVHKGDSVTIT60—65ARNPRT84—95QFKAVVSGAQRL97—109AEGPAVKRGVGAS111—118AKKVAKKA117—123KAPAKKA161—168TKSPAKKV193—200AAAKRPAT

4　討論

研究表明人體在對(duì)抗結(jié)核分枝桿菌的過程中主要依賴于特異性免疫和非特異性免疫反應(yīng)[10-12]。但是結(jié)核分枝桿菌與其他革蘭氏陽性菌不同，存在宿主逃逸現(xiàn)象[13]。這給我們利用結(jié)核分枝桿菌自身抗原來作為免疫標(biāo)志物誘導(dǎo)其產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)以及新型疫苗的開發(fā)帶來挑戰(zhàn)。在機(jī)體特異性免疫應(yīng)答過程中主要是T、B兩類淋巴細(xì)胞參與免疫應(yīng)答，因此對(duì)抗原T、B細(xì)胞表位的分析篩選顯得尤為重要。

具體來說，CD4+T細(xì)胞結(jié)合MHC-I類分子提呈的抗原表位，有輔助型和調(diào)節(jié)型兩類，主要產(chǎn)生IFN-γ，IL-2，IL-12，TNF-β/α這幾類細(xì)胞因子[14]，研究發(fā)現(xiàn)CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ不僅在控制結(jié)核分枝桿菌感染也在誘導(dǎo)強(qiáng)大CD8+T細(xì)胞方面發(fā)揮作用[15]。CD8+T細(xì)胞結(jié)合MHC-II類分子提呈的抗原表位，主要產(chǎn)生IFN-γ和TNF-α等細(xì)胞因子[16]。有研究報(bào)道，由于基因缺失無CD8+T細(xì)胞功能的小鼠更容易感染結(jié)核分枝桿菌[17]。且有研究發(fā)現(xiàn)少量的記憶CD8+T細(xì)胞也能發(fā)揮強(qiáng)大的免疫作用，分泌IFN-γ的CD8+T細(xì)胞在對(duì)抗結(jié)核分枝桿菌的過程中發(fā)揮重要作用[18]。B細(xì)胞表面的抗原表位能識(shí)別和輔助呈遞抗原，且其在免疫過程中能產(chǎn)生抗體殺滅細(xì)菌。

本研究利用生物信息學(xué)方法，通過表位分析數(shù)據(jù)庫對(duì)MTB的Rv2986c蛋白抗原的CD4+T、CD8+T細(xì)胞以及B細(xì)胞進(jìn)行表位預(yù)測(cè)分析，找出與等位基因結(jié)合比較強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)肽段。通過對(duì)比4種在線預(yù)測(cè)工具預(yù)測(cè)的結(jié)果，得出了抗原指數(shù)和表位較強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)抗原集中區(qū)103—117。通過B細(xì)胞抗原表位分析篩選出了8條優(yōu)勢(shì)抗原表位。通過預(yù)測(cè)結(jié)果說明用Rv2986c蛋白作為抗體可以刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，可作為免疫標(biāo)志物用于結(jié)核病的診斷，也可以與現(xiàn)有已知的診斷抗原組合使用，從而提高對(duì)結(jié)核病患者的檢測(cè)敏感性。

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Prediction and analysis of T,B cell epitopes’s distribution of theMycobacteriumtuberculosisRv2986c

SUNYan，WANGXin-qian，ZHANWei-hong，LEIHang，ChENGao-zhan，YUXiao-li

(School of Biology and Pharmaceutical Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China)

To predict and analyze the distribution of CD4+T cell CD8+T-cell and B-cell epitopes encoded by the Rv2986c of Mycobacterium tuberculosis. Obtaining the amino acid sequences by online NCBI database and analyzing the homology between Mycobacterium tuberculosis complex and human proteins by BLAST.NetMHC databases was used to predict CD4+Tcell epitopes.Pre- dicting the distribution of CD8+T cell epitopes by SYFPEITH- I, NetMHC,BIMASand IEDB dat-abases．IEDB and ABCpreddatabases was used to predict Bcell epitopes. After the prediction，we can select the superior epitopes . For the results，there are 10 strong and 245 weak candidates CD4+T cell epitopes candidates3 CD8+T cell epitopes candidates. In the end，1 superiorT-cell epitopecan be selected. 8 superior B-cell epitopes can be selected .Prediction of T and B cell epitopes will be the basis diagnosis of tuberculosis and the study of new tuberculosis vaccine.

Mycobacteriumtuberculosis; Rv2986c;T-cell epitope; B-cell epitope

2016-03-20.

孫妍(1992-)，女，碩士研究生，E-mail：1928125710@qq.com.

余曉麗(1963-)，女，教授，E-mail：yxll268@126.com.

武漢輕工大學(xué)研究生創(chuàng)新基金項(xiàng)目(2014cx019).

2095-7386(2016)03-0045-04

10.3969/j.issn.2095-7386.2016.03.008

Q 93

A