家兔日糧添加小花棘豆黃酮的安全性研究

王帥，楊玲，賈琦珍，陳根元，張玲

（塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾843300）

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科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究

家兔日糧添加小花棘豆黃酮的安全性研究

王帥，楊玲，賈琦珍，陳根元，張玲*

（塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾843300）

為研究小花棘豆黃酮對(duì)家兔采食及代謝指標(biāo)的影響，探討小花棘豆黃酮作為飼料添加劑使用的前景，本試驗(yàn)將24只家兔隨機(jī)分為4組，對(duì)照組和3個(gè)試驗(yàn)組，其中對(duì)照組僅飼喂配合飼料，試驗(yàn)組飼料中分別添加10、30、50 mg/kg劑量的黃酮，試驗(yàn)期60 d。每10 d測(cè)定一次家兔采食量和體質(zhì)量，第60天屠宰后測(cè)定臟器系數(shù)及形態(tài)學(xué)變化，并檢測(cè)血液學(xué)指標(biāo)與血清生化指標(biāo)。結(jié)果顯示，家兔采食小花棘豆黃酮后未見(jiàn)異常臨床癥狀，鏡檢家兔器官正常；試驗(yàn)組家兔臟器系數(shù)和血液生理生化指標(biāo)均無(wú)異常變化，其中試驗(yàn)Ⅱ組和試驗(yàn)Ⅲ組家兔血清丙二醛（MDA）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL-C）和極低密度脂蛋白（VLDL-C）含量顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）含量均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。結(jié)果表明適量添加小花棘豆黃酮不會(huì)導(dǎo)致家兔中毒，還可降低血脂和自由基含量，提高血清抗氧化酶活性，具有一定保肝作用。

小花棘豆；黃酮；家兔；利用

小花棘豆（Oxytropis glabra DC）又名醉馬草、馬絆腸、絆腸草等，在新疆分布廣泛。據(jù)哈薩克藥典記載，小花棘豆具有鎮(zhèn)痛、抗炎等作用，可用于治療牙痛、關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)衰弱，具有良好的研究前景（王帥等，2014）。小花棘豆化學(xué)成分復(fù)雜，目前研究表明，黃酮是其活性成分之一。王帥等（2012）測(cè)定發(fā)現(xiàn)小花棘豆黃酮含量顯著高于傳統(tǒng)藏藥“達(dá)夏”（鐮形棘豆），進(jìn)一步試驗(yàn)證實(shí)其具有較好的抗脂質(zhì)氧化作用，可開(kāi)發(fā)為天然抗氧化劑。賈琦珍等（2014）研究表明，小花棘豆黃酮可提高肉仔雞總抗氧化能力及血清抗氧化酶活力，并降低血清自由基含量，有效抑制熱應(yīng)激對(duì)肉仔雞造成的損傷。王帥等（2015）研究發(fā)現(xiàn)，綿羊適量飼喂小花棘豆黃酮可適當(dāng)提高纖維素利用率，而且對(duì)瘤胃原蟲(chóng)數(shù)量及纖維素降解菌群無(wú)不良影響。本試驗(yàn)擬在家兔日糧中添加不同劑量的小花棘豆黃酮，通過(guò)分析試驗(yàn)家兔血液指標(biāo)及內(nèi)臟組織形態(tài)學(xué)的變化，研究小花棘豆黃酮對(duì)家兔機(jī)體的影響，探討小花棘豆黃酮作為抗氧化飼料添加劑的安全性。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料小花棘豆黃酮，由實(shí)驗(yàn)室自行提取，有效成分含量＞95%。

血液生化指標(biāo)谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、乳酸脫氫酶（LDH）、堿性磷酸酶（AKP）、肌酐（CR）、尿素氮（BUN）、甘油三酯（TG）、葡萄糖（GLU）、總膽固醇（TC）、總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）和極低密度脂蛋白（VLDL-C）檢測(cè)試劑及配套校準(zhǔn)品，購(gòu)自北京利德曼生化股份有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）、過(guò)氧化氫酶（CAT）和丙二醛（MDA）檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自南京建成生物技術(shù)公司，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

7180型全自動(dòng)生化儀（日立儀器蘇州公司）、CelltacEMEK-7222K型全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀（日本光電工業(yè)株式會(huì)社）、T6型紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)（北京普析通用儀器公司）、CX31型生物顯微鏡（日本奧林巴斯株式會(huì)社）、BSA124S型電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）、5427R型高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)艾本德公司）。

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)將24只家兔隨機(jī)分為對(duì)照組、試驗(yàn)Ⅰ組、試驗(yàn)Ⅱ組和試驗(yàn)Ⅲ組，每組6只家兔。對(duì)照組僅飼喂配合飼料，試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組分別飼喂含有小花棘豆黃酮10、30、50 mg/kg的混合飼料，自由飲水。試驗(yàn)期60 d。

1.3試驗(yàn)日糧與管理對(duì)照組家兔日糧參考王帥等（2013）的研究，結(jié)合本地飼草料資源，再補(bǔ)充食鹽、添加劑、賴氨酸、蛋氨酸等配制而成，精料組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。試驗(yàn)組日糧將小花棘豆黃酮按10、30、50 mg/kg的比例與原料充分混合后制備顆粒飼料。所有家兔均自由采食和飲水，每天記錄家兔的飲食狀況、精神狀態(tài)、采食量及體質(zhì)量的變化。

表1　精料配方及營(yíng)養(yǎng)水平

1.4家兔血清生化指標(biāo)的測(cè)定末次飼喂3 h后所有試驗(yàn)家兔采血，部分3000 r/min離心分離血清。其中ALT、AST、LDH、AKP、CR、BUN、TG、TC、GLU、TP和ALB使用生化儀檢測(cè)；SOD、GSHPx、CAT和MDA按照試劑盒說(shuō)明書(shū)采用分光光度計(jì)檢測(cè)。部分通過(guò)改良哈貝爾序列超速離心分離法分離血脂蛋白，測(cè)定指標(biāo)包括：HDL-C、LDL-C和VLDL-C。

1.5家兔血液學(xué)指標(biāo)的測(cè)定血液學(xué)指標(biāo)使用全血測(cè)定，檢測(cè)指標(biāo)有：白細(xì)胞數(shù)（WBC）、淋巴細(xì)胞數(shù)（LYM）、嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)（EOS）、嗜堿性粒細(xì)胞數(shù)（BASO）、嗜中性粒細(xì)胞數(shù)（NEU）、單核細(xì)胞數(shù)（MONO）、紅細(xì)胞數(shù)（RBC）、血紅蛋白質(zhì)量濃度（HGB）、紅細(xì)胞壓積（HCT）、平均紅細(xì)胞體積（MCV）、平均紅細(xì)胞血紅蛋白質(zhì)量（MCH）、平均紅細(xì)胞血紅蛋白質(zhì)量濃度（MCHC）、紅細(xì)胞分布寬度（RDW）、血小板數(shù)（PLT）、血小板壓積（PCT）、血小板平均體積（MPV）、血小板平均分布寬度（PDW）。

1.6家兔臟器系數(shù)測(cè)定及器官組織學(xué)觀察取家兔內(nèi)臟，準(zhǔn)確稱量記錄各臟器重量，計(jì)算臟器系數(shù)。將取出的內(nèi)臟置于10%的中性甲醛溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋，間隔連續(xù)切片，HE染色，顯微鏡觀察試驗(yàn)家兔器官的組織學(xué)變化。臟器系數(shù)計(jì)算公式為：

1.7數(shù)據(jù)分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)SPSS16.0的One-Way ANOVA進(jìn)行單因素方差分析及Duncan’s多重比較，檢驗(yàn)誤差分別為5%和1%。

2　結(jié)果與分析

2.1試驗(yàn)期家兔采食量的變化試驗(yàn)期內(nèi)對(duì)照家兔和試驗(yàn)家兔均未見(jiàn)異常，沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的中毒癥狀。由表2可見(jiàn)，隨著小花棘豆黃酮添加量的增大，試驗(yàn)家兔采食量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，第60天時(shí)，試驗(yàn)Ⅲ組家兔采食量較對(duì)照組提高38.25%（P＜0.05）。說(shuō)明小花棘豆黃酮長(zhǎng)期飼喂可有效提高家兔的采食量。

表2　小花棘豆黃酮對(duì)家兔采食量的影響g

2.2試驗(yàn)期家兔體質(zhì)量的變化由表3可見(jiàn)，試驗(yàn)前期（0～30 d）小花棘豆黃酮飼喂組家兔體質(zhì)量與對(duì)照家兔差異不明顯，但從第40天起小花棘豆黃酮飼喂組家兔體質(zhì)量均高于對(duì)照家兔，但整個(gè)試驗(yàn)期內(nèi)試驗(yàn)組體質(zhì)量與對(duì)照組家兔體質(zhì)量無(wú)顯著差異（P＞0.05）。表明日糧中適量添加小花棘豆黃酮可促進(jìn)家兔增重，原因可能與采食量增加有關(guān)。

表3　小花棘豆黃酮對(duì)家兔體質(zhì)量的影響

2.3家兔血液生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果由表4可知，試驗(yàn)組家兔血清AST、ALT、AKP、HDL、CAT、BUN、CR、GLU、TG、HDL-C、TP和ALB含量均與對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05）。表明日糧中適量添加小花棘豆黃酮不會(huì)影響家兔的肝功與腎功指標(biāo)。另外試驗(yàn)Ⅱ組家兔血清MDA、TC、LDL-C和VLDL-C含量分別下降19.06%、19.21%、30.02%和27.54%，試驗(yàn)Ⅲ組家兔血清MDA、TC、LDL-C和VLDL-C含量分別下降了25.81%、21.37%、34.16%和35.53%（P＜0.05），試驗(yàn)Ⅱ、Ⅲ組家兔血清SOD和GSH-Px活性分別升高了21.26%和28.01%、27.01%和36.45%（P＜0.05），表明日糧中添加一定量的小花棘豆黃酮可以提高家兔機(jī)體的抗氧化物酶活性，降低血液中的自由基水平，并可改善家兔對(duì)脂肪的利用情況。

表4　家兔血清生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

2.4家兔血液學(xué)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果由表5可知，試驗(yàn)Ⅲ組家兔血液中LYM、RBC、HGB、HCT、MCV和MCH值分別升高了21.52%、21.43%、23.63%、26.21%、23.30%和31.37%（P＜0.05），但其余指標(biāo)均與對(duì)照家兔差異不顯著（P＞0.05）。試驗(yàn)Ⅰ組和試驗(yàn)Ⅱ組家兔各項(xiàng)血液學(xué)指標(biāo)均與對(duì)照家兔差異不顯著（P＞0.05）。試驗(yàn)結(jié)果表明家兔日糧中添加小花棘豆黃酮對(duì)血液學(xué)指標(biāo)無(wú)不良影響，50 mg/kg的劑量還可有效增強(qiáng)家兔機(jī)體免疫力，并改善家兔血液的運(yùn)氧能力。

2.5家兔臟器系數(shù)及器官組織學(xué)檢測(cè)結(jié)果由表6可知，試驗(yàn)組家兔肝臟指數(shù)、腎臟指數(shù)、心臟指數(shù)、脾臟指數(shù)、胰臟指數(shù)、腦指數(shù)、胃指數(shù)和腸道指數(shù)與對(duì)照家兔均差異不顯著（P＞0.05）；鏡檢觀察未發(fā)現(xiàn)家兔組織器官出現(xiàn)細(xì)胞空泡變性，細(xì)胞核壞死、溶解、消失等異常變化。

3　討論

3.1小花棘豆黃酮對(duì)家兔采食量及體質(zhì)量的影響研究發(fā)現(xiàn)小花棘豆黃酮主要為黃酮苷，苷元包括鼠李素、異鼠李素、鼠李檸檬素、甲基鼠李素、槲皮素、芹菜素、木犀草素、山柰酚、白楊素等。本試驗(yàn)在家兔日糧中添加了不同劑量的小花棘豆黃酮，通過(guò)60 d的飼喂試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)小花棘豆黃酮長(zhǎng)期飼喂可提高家兔的采食量，高劑量組可顯著提高家兔的采食量，并有效提高了試驗(yàn)家兔的體質(zhì)量，試驗(yàn)期內(nèi)未見(jiàn)家兔發(fā)生明顯的中毒反應(yīng)。表明適量飼喂小花棘豆黃酮不會(huì)導(dǎo)致家兔中毒。飼喂小花棘豆黃酮未引起試驗(yàn)家兔和對(duì)照家兔體質(zhì)量的顯著差異。其原因可能是小花棘豆黃酮的飼喂劑量較小，可能沒(méi)有達(dá)到使家兔體質(zhì)量發(fā)生明顯變化的劑量。

表5　家兔血液學(xué)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

表6　家兔主要臟器指數(shù)測(cè)定結(jié)果%

3.2小花棘豆黃酮對(duì)家兔血液生化指標(biāo)的影響AST和ALT是衡量肝功的重要檢測(cè)指標(biāo)，AKP和HDL可用于檢測(cè)動(dòng)物機(jī)體實(shí)質(zhì)性內(nèi)臟器官的損傷；TP和ALB反映了機(jī)體血液中蛋白質(zhì)的含量，而B(niǎo)UN和CR是機(jī)體蛋白質(zhì)的代謝產(chǎn)物；GLU可用于檢測(cè)機(jī)體糖代謝水平；TG、TC、HDL-C、LDLC和VLDL-C反映了動(dòng)物機(jī)體的血脂情況（Martens和Mithofer，2005）。SOD、GSH-Px和CAT是機(jī)體重要的抗氧化酶，MDA是氧自由基的主要代謝產(chǎn)物，這4個(gè)指標(biāo)可用于評(píng)價(jià)機(jī)體抗氧化能力的變化。試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，小花棘豆黃酮飼喂組家兔血清AST、ALT、AKP、BUN、LDH、GLU、CR、TG、TP、HDL-C和ALB含量均與對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05），表明飼喂小花棘豆黃酮未引起動(dòng)物肝功、腎功等異常變化，與張玲等（2013）研究結(jié)果一致；另外中劑量和高劑量試驗(yàn)家兔血清MDA、TC、LDL-C和VLDL-C含量均顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），SOD和GSH-Px活性均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），表明日糧中添加一定量的小花棘豆黃酮可以提高家兔機(jī)體的抗氧化物酶活性，降低血液中的自由基水平，并可改善家兔對(duì)脂肪的利用情況，具有較好的研究前景和價(jià)值。

3.3小花棘豆黃酮對(duì)家兔血液學(xué)指標(biāo)的影響LYM主要在機(jī)體免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用，是機(jī)體免疫力的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)。MCV和MCH主要反映紅細(xì)胞的形態(tài)，可用于檢測(cè)血紅蛋白的生成與紅細(xì)胞分化增生；RBC和HGB反映了血液中紅細(xì)胞和血紅蛋白的數(shù)量，可用于評(píng)價(jià)血液運(yùn)氧能力與抗氧化能力（Mitsuyoshi等，2005）。本試驗(yàn)表明，高劑量的小花棘豆黃酮可顯著提高家兔血液中淋巴細(xì)胞、紅細(xì)胞及血紅蛋白數(shù)量值，說(shuō)明小花棘豆黃酮具有提高免疫力和改善血液攜氧能力的作用。

3.4小花棘豆黃酮對(duì)家兔臟器系數(shù)的影響臟器系數(shù)可反映受試物臟器的損害程度（張玲等，2013）。但臟器系數(shù)的變化只能說(shuō)明動(dòng)物的某個(gè)臟器可能受到損傷，確診仍需進(jìn)一步的病理組織學(xué)和相關(guān)生理生化指標(biāo)的檢查。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)家兔和對(duì)照組家兔各實(shí)質(zhì)性臟器及消化器官系數(shù)均無(wú)顯著差異，鏡檢未發(fā)現(xiàn)異常。說(shuō)明小花棘豆黃酮可被家兔安全吸收利用。

4　結(jié)論

在60 d的家兔飼喂試驗(yàn)中，通過(guò)臨床癥狀觀察及體質(zhì)量增重情況、血液生化指標(biāo)和血液學(xué)指標(biāo)以及臟器系數(shù)比較，未發(fā)現(xiàn)飼喂小花棘豆黃酮的家兔出現(xiàn)中毒癥狀。結(jié)果表明，小花棘豆黃酮可有效提高家兔血液抗氧化酶活性，降低血脂和自由基含量，具有增強(qiáng)免疫力和一定的保肝作用，可作為飼料添加劑應(yīng)用。

［1］賈琦珍，陳根元，王帥，等.小花棘豆黃酮對(duì)熱應(yīng)激肉仔雞抗氧化能力的影響［J］.中國(guó)飼料，2014，17：14～17.

［2］王帥，蔣慧，陳根元，等.小花棘豆總黃酮體內(nèi)抗氧化作用的研究［J］.中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2012，39（10）：133～136.

［3］王帥，陳根元，張玲，等.小花棘豆對(duì)家兔血液生化指標(biāo)的影響［J］.中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2013，43（2）：190～196.

［4］王帥，張玲，陳根元，等.小花棘豆生態(tài)學(xué)研究概況［J］.家畜生態(tài)學(xué)報(bào)，2014，35（3）：85～88.

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［6］張玲，陳根元，吳書(shū)奇，等.小鼠日糧中添加小花棘豆黃酮的安全性試驗(yàn)［J］.中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2013，40（1）：99～102.

［7］Martens S，Mithofer A.Flavones and flavone synthases［J］.Phytochemistry，2005，66（20）：2399～2407.

［8］Mitsuyoshi M，Naoko S，Kotaro S，et al.Cytotoxicity of flavornoids toward cultured normal human cells［J］.Bio Pharm Bull，2005，28（2）：253.

The main goal of this experiment was to investigate the clinical safety on feeding flavonoid from Oxytropis glabra DC for rabbit，then reveal the utilization of flavonoid from O.glabra DC in future.A total of 24 rabbits were randomly and equally divided into control group and experimental groupⅠ，Ⅱ，Ⅲ.There were 6 rabbits in each group（3 male rabbits and 3 female rabbits）.The control group were fed complete feed，different amounts of flavonoid from O.glabra DC（10，30，50 mg/kg）were mixed with the feeds in three experimental groups，the trial period was 60 d.Every 10 d the feed intake and body quality of rabbits were measured，the pathomorphological changes and coefficient of organ in rabbits were also observed，finally the hematological indices and serum biochemical indicators were tested after slaughter.The result showed that fed flavonoid from O.glabra DC didn’t show any abnormal clinical diseases，toxic symptom hadn’t been observed in organ by microscopic examination，the serum biochemical indicators，hematological indices and quots of organ was in normal limits.The contents of maleic dialdehyde（MDA），total cholesterol（TC），LDL-cholesterol（LDL-C）and VLDL-cholesterol（VLDL-C）in experimental groupⅡ，Ⅲwere significantly lower than those of control group（P＜0.05）. The contents of superoxide dismutase（SOD）and glutathione peroxidase（GSH-Px）in experimental groupⅡ，Ⅲwere significantly higher than those of control group（P＜0.05）.It showed that flavonoid from O.glabra DC in forage had no subchronic toxicity and good safety to rabbit，and was good to reduce free radical and blood fat in rabbit.It had liver protection of feeding flavonoid from O.glabra DC in forage for rabbit.

Oxytropis glabra DC；flavonoid；rabbit；utilization

S816.7

A

1004-3314（2016）07-0009-04

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20160702

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2011BAD17B05）；新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題（HS201402）