神經調節(jié)蛋白1對高糖損傷的心肌細胞的保護作用及其機制

羅明雄，陳小丹，魏玲

神經調節(jié)蛋白1對高糖損傷的心肌細胞的保護作用及其機制

羅明雄，陳小丹，魏玲

目的：研究神經調節(jié)蛋白1（NRG-1）對高糖損傷的心肌細胞的保護作用及其機制。

方法：培養(yǎng)大鼠胚胎期心臟組織H9c2心肌細胞，進行分組處理。分別為對照組（不加任何誘導藥物處理24 h）、高糖作用組（HG組，用含終濃度33 mmol/L的葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)心肌細胞處理24 h ）、不同濃度NRG-1作用組（分別在含有33 mmol/L高濃度葡萄糖的培養(yǎng)基中同時加入10、50、250 nmol/L的NRG-1培養(yǎng)心肌細胞處理24 h，設定為N1、N2、N3組）。細胞計數(shù)（CCK-8）方法檢測各組心肌細胞存活率；流式細胞術檢測各組心肌細胞胞內活性氧（ROS）水平和細胞凋亡情況；同時測定各組心肌細胞中肌酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH）、超氧化物歧化酶（SOD）活力和丙二醛（MDA）含量；蛋白免疫印跡（Western-blot）方法檢測各組心肌細胞中NRG-1的受體，即表皮生長因子受體-2（ErbB2）和表皮生長因子受體-4（ErbB4）的表達；原位缺口末端標記法（Tunel）染色檢測2型糖尿病心肌病模型大鼠經NRG-1處理后的心肌細胞凋亡。

結果：N1組至N3組心肌細胞的存活率由（63.33±3.56）%上升至（85.88±4.55）%；心肌細胞中ROS含量由（33.57±4.23）%下降至（15.88±4.55）%；細胞凋亡率由（36.44±4.86）%下降至（14.77±4.21）%；心肌細胞中ErbB2和ErbB4受體表達隨之分別由（0.26±0.04）、（0.39±0.03）上升至（0.84±0.03）、（0.72±0.04），與HG組比差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；CK、LDH酶活力和MDA含量逐漸下降而SOD活性逐漸回升，與HG組比差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。NRG-1作用的2型糖尿病心肌病模型大鼠心肌組織細胞凋亡也顯著下降。

結論：NRG-1能夠提升高糖作用下心肌細胞存活率，減輕高糖對心肌細胞氧化應激損傷和細胞凋亡，可能通過與心肌細胞中ErbB2/ErbB4受體結合發(fā)揮作用。

神經調節(jié)蛋白-1；肌細胞，心臟；氧化應激；細胞凋亡；糖尿病心肌病

Abstract

Objective: To study the protective roll of neuregulin-1 （NRG-1） on high glucose caused myocardial cell injury in rat’s embryo H9c2 myocardial cells with its mechanism.

Methods: Cultured rat’s embryo H9c2 myocardial cells were divided into 5 groups:① Control group，② High glucose（HG） group， containing glucose 33 mmol/L，③ HG+NRG-1 10 nmol/L （N1） group，④ HG+NRG-1 50 nmol/L （N2） group and⑤HG+NRG-1 250 nmol/L （N3） group. All cells were treated for 24 hours. Myocardial cell survival rate was measured by CCK-8 method， intracellular reactive oxygen species （ROS） level and the apoptosis rate were detected by flow cytometry， enzymes activities of CK， LDH， SOD and MDA content were examined， proteins expressions of NRG-1 receptor as ErbB2 and ErbB4 were assessed by Western blot analysis. NRG-1 treated myocardial cell apoptosis in type II diabetic cardiomyopathy rats was observed by Tunel staining.

Results: Compared with HG group， from N1 group to N3 group， myocardial cell survival rates were increased from （63.33±3.56） %to （85.88±4.55） %， ROS levels decrease form （33.75±4.23） % to （15.88±4.55） %， apoptosis rates reduced from （36.44±4.86） % to（14.77±4.21） %， receptor expressions of ErbB2 was elevated from （0.26±0.04） to （0.84±0.03） and ErbB4 was elevated from （0.39±0.03）to （0.72±0.04）， all P＜0.05； enzymes activities of CK， LDH and MDA content were gradually decreased and SOD activity was gradually increased， all P＜0.05. NRG-1 treated myocardial cell apoptosis in type II diabetic cardiomyopathy rats was also obviously reduced.

Conclusion: NRG-1 could increase the survival rate and reduce the oxidative stress injury and apoptosis of cultured rat’s embryo H9c2 myocardial cells in HG condition which might be related to NRG-1 binding to ErbB2/ErbB4 molecules in the cells.

（Chinese Circulation Journal， 2016，31: 902.）

有研究表明高血糖能夠導致糖尿病性心肌病和心力衰竭，是糖尿病性心肌損傷疾病的獨立危險因素［1］。但糖尿病引起心肌損傷疾病不容易被診治，常導致糖尿病心血管并發(fā)癥患者死亡率升高。預防并減輕高血糖引起的心肌或血管損傷對于防治心血管疾病具有重要價值，但目前關于糖尿病性心肌病的發(fā)病機制尚不完全清楚［2］。神經調節(jié)蛋白-1（NRG-1）是類表皮生長因子家族成員，在心臟發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用［3］。研究表明NRG-1基因缺失的胎鼠心臟發(fā)育會出現(xiàn)缺陷，表明NRG-1在胎鼠心肌發(fā)育中發(fā)揮作用［4］。有研究發(fā)現(xiàn)高糖可抑制心肌微血管細胞中NRG-1的表達，當加入胰島素治療后細胞中NRG-1表達能夠回升，因此推測NRG-1可能在減輕高血糖引起心肌損傷中發(fā)揮重要作用［5］。為了揭示NRG-1在糖尿病性心肌疾病中發(fā)揮的作用，本研究利用高糖直接作用于H9c2心肌細胞模擬臨床上高血糖引起糖尿病性心肌損傷疾病狀態(tài)，觀察NRG-1對高糖作用下心肌細胞損傷的影響，并揭示其是否能夠通過抗氧化應激和細胞凋亡發(fā)揮作用。

1　材料與方法

1.1材料及試劑

H9c2心肌細胞株購自中國科學院上海生科院細胞資源中心；DMEM/F-12細胞培養(yǎng)基、胎牛血清、含0.25%EDTA的胰酶購自美國Hyclone公司；NRG-1購自美國R&D公司；細胞計數(shù)試劑盒8（CCK-8）購自北京鼎國生物公司；肌酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH）、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒購自南京建成生物公司；丙二醛（MDA）酶聯(lián)免疫標記試劑盒購自武漢華美生物工程公司；雙氫羅丹明123、Annexin-V/PI細胞凋亡試劑盒購自美國BD公司；多克隆兔抗鼠表皮生長因子受體2（ErbB2）、表皮生長因子受體4（ErbB4）、β肌動蛋白（β-actin）一抗購自美國Abcam公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG二抗、增強化學發(fā)光（ECL）試劑盒購自北京中杉金橋公司。30只Wistar大鼠，質量160～180 g，無特定病原體（SPF）級別，合格證號SCXK-2012-0031，由南京醫(yī)科大學實驗動物中心提供。

1.2實驗方法

細胞培養(yǎng)及分組處理：將來源自大鼠胚胎期心臟組織的H9c2心肌細胞復蘇后，在含10%的胎牛血清的DMEM/F12細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并置于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中。待細胞貼壁生長至80%時，消化收集細胞進行后續(xù)實驗。實驗分為5組，分別為正常對照組：用正常DMEM/F12培養(yǎng)基，不加其他誘導藥物處理24 h；高糖作用組（HG組）：利用含終濃度33 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)處理24 h；不同濃度NRG-1作用組（分別設定為N1、N2、N3組）：在含有33 mmol/L高濃度葡萄糖的心肌細胞培養(yǎng)基中同時分別加入10、50、250 nmol/L的NRG-1培養(yǎng)處理24 h。

CCK-8方法檢測細胞存活率［6］: 將生長狀態(tài)良好的H9c2心肌細胞以5×104個/ml接種于96孔板中，待細胞貼壁生長后，按照上述分組處理24 h后在每孔中加入20 μl的CCK-8溶液，在37℃下繼續(xù)孵育培養(yǎng)4 h，用酶標儀測定各孔在450 nm處的吸光值（A值）。每組細胞設置6個復孔，并進行3次重復實驗。按照下公式計算各組心肌細胞的存活率：細胞存活率（%）=處理組A值/對照組A值×100%。

流式細胞術檢測ROS和細胞凋亡率［7，8］: 將H9c2心肌細胞等量接種于6孔板中，并按照相同的分組處理方法誘導處理24 h，后利用0.25%的胰酶消化離心收集各組細胞。用磷酸緩沖鹽溶液（PBS：137 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，10 mmol/ L Na2HPO4，2 mmol/L KH2PO4，pH7.2～7.4）洗滌細胞2次后，重懸細胞并分別加入1 μmol/L的雙氫羅丹明123孵育1 h，孵育完后離心收集細胞并用PBS洗滌1次。各組細胞中活性氧（ROS）能夠將雙氫羅丹明123氧化成羅丹明123而發(fā)出熒光，利用流式細胞儀可以檢測各組細胞中陽性熒光表達率反映心肌細胞中ROS含量變化。另外將消化重懸的各組心肌細胞，先用FITC標記的膜連蛋白V（Annexin-V）和碘化丙啶（PI）各5 μl混勻室溫避光孵育30 min，后用PBS洗滌兩次后離心，并用150 μl的PBS重懸細胞，立即用流式細胞儀上樣檢測各組心肌細胞經處理后的凋亡率。

檢測CK、LDH、SOD酶活力和MDA含量變化:將H9c2心肌細胞接種于6孔板中，按照上述分組處理方法處理24 h。培養(yǎng)結束后收集各組細胞的上清，按照文獻［9］建立標準曲線，分光光度計比色法測定各組心肌細胞經不同處理后細胞上清中漏出的LDH、CK酶活力。同時消化收集各組細胞，PBS洗滌1次后利用強蛋白提取試劑（50 mM Tris，150 mM NaCl，pH7.4）提取各組心肌細胞中總蛋白。同樣分光光度計比色法測定各組細胞中SOD酶活力［9］。按照文獻［10］中酶聯(lián)免疫標記法測定各組心肌細胞中MDA含量。

蛋白免疫印跡（Western-blot）檢測受體分子ErbB2和ErbB4表達：按照上述相同方法分組培養(yǎng)處理H9c2心肌細胞24 h，后用0.25%的胰酶消化離心收集各組心肌細胞。PBS洗滌2次后用RAPI強細胞裂解蛋白提取試劑提取各組心肌細胞中總蛋白。按照文獻［7］中利用BCA試劑盒測定各組細胞中總蛋白濃度。每組上樣總蛋白30 μg，12%的SDS-PAGE凝膠電泳1.5 h，半干法轉聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，并用含5%脫脂奶粉的TBST溶液（20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，0.05% Tween20，pH7.5）封閉30 min，后分別孵育多克隆兔抗鼠ErbB2、ErbB4、β-actin一抗（1:1000稀釋）4℃過夜，后用TSBT溶液振蕩洗滌3次，再室溫下孵育HRP標記的山羊抗兔IgG二抗（1:5000稀釋）2 h，TBST溶液洗滌3次后，加入ECL化學發(fā)光試劑顯影曝光并拍照。利用Quantity One軟件分析各目的蛋白的相對表達含量變化。

原位缺口末端標記法（Tunel）檢測Ⅱ型糖尿病心肌病模型大鼠心肌細胞凋亡情況：將Wistar大鼠30只隨機分成三組，在溫度（23±2）℃，相對濕度（55±2）%的環(huán)境下自由飲水進食。10只大鼠為健康對照組；其余20只用高脂高糖飼料（基礎飼料66.6%、葡糖糖20.0%、豬油10.0%、膽固醇0.4%、蛋白粉3.0%）連續(xù)喂4周后，按照45 mg/kg的比例腹腔注射新配制的鏈脲佐菌素（0.1%的檸檬酸緩沖液，pH4.5配制）部分破壞胰島β細胞功能。1周后大鼠尾部采血測大鼠空腹血糖持續(xù)3 d高于16.7 mmol/L，有多飲、多尿、多食現(xiàn)象，且經檢測心功能均出現(xiàn)異常（每搏輸出量、心排血量降低、而心室最大舒張速度升高）即為2型糖尿病大鼠造模成功，為糖尿病心肌病組，糖尿病心肌病大鼠繼續(xù)高糖高脂喂食4周；NGR-1處理組：糖尿病心肌病大鼠繼續(xù)高糖高脂喂食外每天尾靜脈注射1 ml的250 nmol/（kg·ml）的NGR-14周。結束后麻醉處死各組大鼠，取心肌組織切片，后按照文獻［9］Tunel方法染色檢測各組大鼠心肌組織細胞凋亡情況。

1.3統(tǒng)計學方法

2　結果

2.1NRG-1能夠抑制高糖對心肌細胞的毒性作用（圖1）

CCK-8檢測: 與正常對照組比，HG組中H9c2心肌細胞存活率顯著下降（P＜0.05）；與HG組相比，N1、N2、N3組中H9c2心肌細胞存活率均顯著上升，并具有濃度效應（P＜0.05）。

圖1　 神經調節(jié)蛋白1對高糖作用下H9c2心肌細胞存活率的影響（n=3）

2.2NRG-1減少高糖誘導心肌細胞中ROS的產生（圖2）

流式細胞術檢測: 與正常對照組比，HG組ROS含量顯著上升（P＜0.05）；N1、N2、N3組細胞中ROS含量較HG組均下降，并隨著NRG-1作用濃度的升高，ROS含量下降越明顯，與HG組比差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。

圖2　神經調節(jié)蛋白1對高糖作用下心肌細胞中ROS含量的影響

2.3NRG-1降低高糖引起的心肌細胞凋亡（圖3）

流式細胞術檢測各組心肌細胞凋亡: 與正常對照組比，HG組中H9c2心肌細胞凋亡率顯著增加（P＜0.05）；與HG組比，N1、N2、N3組中H9c2心肌細胞凋亡率則逐漸下降（P均＜0.05）。

2.4NRG-1促進心肌細胞抵抗高糖引起氧化應激反應（表1）

與正常對照組相比，HG組中H9c2心肌細胞中LDH、CK酶活力和MDA含量均顯著增加，而SOD酶活力顯著下降（P均＜0.05）；N1、N2、N3組中H9c2心肌細胞中LDH、CK酶活力和MDA含量逐漸下降，而SOD酶活力則隨之逐漸上升，與HG組比差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。

圖3　神經調節(jié)蛋白1對高糖作用下心肌細胞凋亡的影響 （n=3）

表1　NRG-1對高糖作用下培養(yǎng)的H9c2心肌細胞上清液中CK和LDH活力以及心肌細胞的SOD活力和MDA含量的影響

表1　NRG-1對高糖作用下培養(yǎng)的H9c2心肌細胞上清液中CK和LDH活力以及心肌細胞的SOD活力和MDA含量的影響

注：CK：肌酸激酶；LDH：乳酸脫氫酶；MDA：丙二醛；SOD：超氧化物歧化酶；HG組：高糖作用組；N1組：10 nmol/L NRG-1和高糖同時作用組；N2組：50 nmol/L NRG-1和高糖同時作用組；N3組：250 nmol/L NRG-1和高糖同時作用組。與正常對照組比*P＜0.05；與HG組比△P＜0.05

SOD（U/mg·pro）正常對照組　0.54±0.11　0.36±0.06　1.33±0.25　243.55±11.43 HG組　1.87±0.18*　0.99±0.05*　7.55±0.45*　55.46±12.85*N1組　1.23±0.14△　0.73±0.03△　5.57±0.26△　99.55±10.45△N2組　0.94±0.09△　0.54±0.05△　3.67±0.28△142.66±8.69△N3組　0.65±0.11△　0.43±0.04△　2.19±0.26△189.98±8.95△組別　CK（U/ml）　LDH （U/ml）　MDA（μ mol/g·pro）

2.5NRG-1促進高糖作用下心肌細胞中ErbB2和ErbB4表達（圖4）

Western-blot檢測：與正常對照組比，HG組H9c2心肌細胞中ErbB2表達水平顯著降低（P＜0.05），而ErbB4表達水平變化不明顯；與HG組比N1、N2、N3組中H9c2心肌細胞中ErbB2和ErbB4表達水平均隨之顯著上升，并具有濃度效應（P均＜0.05）。

圖4　蛋白免疫印跡分析神經調節(jié)蛋白1對高糖作用下心肌細胞中ErbB2和ErbB4表達的影響 （n=3）

2.6NRG-1減少2型糖尿病心肌病模型大鼠心肌組織凋亡（圖5）

Tunel檢測：大鼠健康對照組心肌組織中基本未見凋亡心肌細胞；糖尿病心肌病組心肌組織中可見大量心肌細胞凋亡；而NRG-1處理組凋亡的心肌細胞顯著減少，說明NRG-1能夠對高糖損傷的2型糖尿病心肌病大鼠心肌組織發(fā)揮保護作用。

圖5　神經調節(jié)蛋白1對糖尿病心肌病模型大鼠心肌組織凋亡的影響

3　討論

臨床研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病能夠明顯增加心肌病、心力衰竭、先天性心臟病和冠心病等心血管疾病的發(fā)生率和致死率，糖尿病患者由于體內持續(xù)的高血糖水平，容易誘發(fā)并導致糖尿病性心肌病心血管并發(fā)癥［3］。而糖尿病性心肌疾病不容易發(fā)現(xiàn)并易被忽視，成為2型糖尿病患者心血管并發(fā)癥致死的主要誘因之一，但其明確的發(fā)病機制尚不完全明確。有研究表明，由循環(huán)系統(tǒng)中高血糖水平造成的氧化應激使心肌細胞受損發(fā)生細胞凋亡和功能減弱，與糖尿性心肌疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關［11］。近來研究發(fā)現(xiàn)，神經調節(jié)蛋白NRG-1在幼、成年人心臟心內膜、心肌微血管中均有較高表達，當心肌受到損傷時，NRG-1表達量會顯著減少［12］。施國祥等［13］研究表明高糖可抑制心肌微血管細胞中NRG-1蛋白和mRNA的表達，當加入胰島素后心肌細胞中NRG-1表達能夠回升，推測NRG-1在心肌細胞抵抗高糖損傷中可能發(fā)揮重要作用。而本研究利用高濃度葡萄糖作用于H9c2心肌細胞構建糖尿病性心肌損傷模型，發(fā)現(xiàn)高糖能夠顯著降低心肌細胞存活率，而NRG-1能夠逐漸提升心肌細胞的存活率，減輕高糖產生的細胞毒性作用，說明NRG-1能夠保護高糖損傷的心肌細胞，促進其存活。

目前，大多研究者認為糖尿病性心肌疾病與高血糖引起的心肌細胞氧化應激有關，而活性氧ROS積累引起的氧化應激在糖尿病心血管并發(fā)癥中發(fā)揮極其關鍵作用［14］。Niedowicz等［15］在糖尿病并發(fā)癥心力衰竭確診患者的心肌活檢中，能夠觀察發(fā)現(xiàn)ROS產生顯著增多。本研究中利用流式細胞術檢測同樣發(fā)現(xiàn)單獨高糖作用下，H9c2心肌細胞中產生ROS陽性率顯著上升，但在不同濃度NRG-1同時作用下，各組心肌細胞中ROS含量均顯著下降，說明NRG-1能夠減少或清除高糖誘導心肌細胞中積累產生的ROS。同時NRG-1促進心肌細胞抵抗氧化應激損傷并維持細胞功能也可以通過CK、LDH、SOD和MDA反映出來。CK是心肌細胞胞內酶，其能夠直接反映心肌細胞損傷程度，而LDH與細胞功能變化、結構完整性有關，研究表明高糖作用下乳鼠心肌細胞中CK和LDH酶活力都會顯著增加［16］。本研究中在NRG-1和高糖同時作用下，體外培養(yǎng)的心肌細胞上清液中CK和LDH酶活力均有所降低，并具有濃度效應，說明NRG-1能夠保護高糖作用下心肌細胞的完整性，并維持其細胞功能。MDA含量和SOD活性變化是反映機體抵抗氧化應激反應的重要指標，有研究證實高糖能夠刺激心肌細胞中MDA含量升高，使SOD活性下降，說明高糖損傷心肌細胞抗氧化系統(tǒng)［17］。本研究中發(fā)現(xiàn)NRG-1和高糖同時作用后，心肌細胞中MDA含量逐漸下降，而SOD活性逐漸上升，表明NRG-1能夠提升心肌細胞抗氧化應激能力和清除氧自由基以減輕高糖的損傷作用。

近來研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病各種心血管并發(fā)癥發(fā)生機制中，細胞凋亡均發(fā)揮著重要的調節(jié)作用［18］。賈強等［19］研究發(fā)現(xiàn)高糖能夠誘導乳鼠心肌細胞凋亡，而氧化應激是高糖誘導心肌細胞凋亡的一個重要機制。上述研究已發(fā)現(xiàn)NRG-1能夠促進心肌細胞抵抗氧化應激損傷，另利用流式細胞術檢測NRG-1對高糖作用下的心肌細胞凋亡的影響。研究發(fā)現(xiàn)在不同濃度NRG-1同時作用下，心肌細胞凋亡率逐漸下降，顯著低于單獨高糖作用組。同時本研究中建立的糖尿病心肌病大鼠模型，經NRG-1處理后其心肌組織凋亡細胞也顯著減少，從細胞和組織水平驗證NRG-1能夠降低高糖作用下心肌細胞凋亡發(fā)揮保護作用。有研究發(fā)現(xiàn)NRG-1主要通過與其心肌細胞膜上的受體蛋白ErbB2/ErbB4結合，使下游的具有轉錄激活功能的分子磷酸化而發(fā)揮作用［20］。本研究中發(fā)現(xiàn)單獨高糖作用下，心肌細胞中ErbB2和ErbB4表達水平有所下降；而當不同濃度NRG-1和高糖同時作用時，心肌細胞中ErbB2和ErbB4表達卻均升高，且顯著高于高糖單獨作用組，說明NRG-1減輕高糖作用下心肌細胞氧化應激和細胞凋亡可能通過與受體結合并激活NRG-1/ ErbB2/ErbB4信號通路發(fā)揮作用。

綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)神經調節(jié)蛋白NRG-1能夠提升高糖作用下心肌細胞存活率，減輕高糖對心肌細胞氧化應激損傷和細胞凋亡，并通過與心肌細胞中受體ErbB2/ErbB4結合發(fā)揮作用。通過本研究為臨床防治糖尿病性心肌病提供前期基礎和理論依據(jù)。

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Protective Roll of Neuregulin-1 on High Glucose Caused Myocardial Cell Injury in Rat’s Embryo H9c2 Myocardial Cells With its Mechanism

LUO Ming-xiong， CHEN Xiao-dan， WEI Ling.
Department of Cardiology， Suzhou Wuzhong People’s Hospital， Suzhou （215128）， Jiangsu， China
Corresponding Author: WEI Ling， Email: weiling43@163.com

Neuregulin-1； Myocytes， cardiac； Oxidative stress； Apoptosis； Diabetic cardiomyopathy

2015-10-20）

（編輯：常文靜）

215128 江蘇省，蘇州市吳中人民醫(yī)院 心內科（羅明雄），門診部（陳小丹）；云南省昆明市，成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院地方干部病房科（魏玲）

羅明雄 主治醫(yī)師 碩士研究生 研究方向為心血管疾病分子機制研究 Email：LMX750104@163.com 通訊作者：魏玲 Email：weiling43@163.com

R54

A

1000-3614（2016）09-0902-06 doi：10.3969/j.issn.1000-3614.2016.09.018