尾葉香茶菜揮發(fā)油的提取工藝及其抗菌和抗氧化作用

王　霞，許菊香,于曉明,徐亞維

(1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，吉林　吉林　132101；2.長(zhǎng)白山動(dòng)植物資源利用與保護(hù)吉林省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林　吉林　132101；3.磐石市農(nóng)民科技教育中心，吉林　磐石　132300)

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尾葉香茶菜揮發(fā)油的提取工藝及其抗菌和抗氧化作用

王霞1,2，許菊香3,于曉明1，2,徐亞維1,2

(1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，吉林吉林132101；2.長(zhǎng)白山動(dòng)植物資源利用與保護(hù)吉林省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林吉林132101；3.磐石市農(nóng)民科技教育中心，吉林磐石132300)

研究尾葉香茶菜揮發(fā)油的最佳提取方法、提取工藝及其抗菌和抗氧化能力。采用水蒸氣蒸餾法(SD法)和CO2超臨界流體萃取法(SFE-CO2法)提取尾葉香茶菜揮發(fā)油，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，采用體外抑菌試驗(yàn)和對(duì)DPPH自由基的清除能力試驗(yàn)研究其抗菌和抗氧化能力。結(jié)果表明，SD法的最佳提取工藝是浸泡時(shí)間8 h，料液比1∶6，蒸餾時(shí)間7 h，平均得油率為0.186%；SFE-CO2法的最佳提取工藝是萃取壓力30 MPa，萃取溫度50℃，萃取時(shí)間80 min，平均得油率為0.440%；2種方法所提揮發(fā)油均具有一定的抑菌和DPPH自由基的清除能力，且SFE-CO2法所提揮發(fā)油的抗菌和抗氧化能力均高于SD法所提揮發(fā)油，同種方法所提揮發(fā)油的抑菌效果：枯草芽孢桿菌>金黃色葡萄球菌>大腸桿菌；對(duì)DPPH自由基的清除能力強(qiáng)弱：SFE-CO2法提取揮發(fā)油>SD法提取揮發(fā)油>Vc。優(yōu)化的2種提取方法穩(wěn)定性好，其中SFE-CO2法周期短、工藝流程簡(jiǎn)單、得油率高、抗菌和抗氧化性能好，適宜在工業(yè)生產(chǎn)中推廣。

尾葉香茶菜；揮發(fā)油；提取工藝；抗菌；抗氧化

尾葉香茶菜Isodonexcisa(Maxim.) Hara，系多年生草本植物，主要分布于我國吉林、甘肅、山西等省以及日本、朝鮮、俄羅斯的遠(yuǎn)東地區(qū)[1]。尾葉香茶菜全草入藥，具有清熱解毒、健胃、活血等功效，可用于治療胃炎、膀胱脹痛和感冒發(fā)熱等疾病[2]。目前，對(duì)尾葉香茶菜的研究主要集中在化學(xué)成分方面，尤其是二萜類化合物的分離、結(jié)構(gòu)鑒定及藥理活性等方面，藥理研究表明，這些化合物可以顯著抑制人體宮頸癌細(xì)胞、黑色素瘤細(xì)胞、肺癌細(xì)胞等腫瘤細(xì)胞的增殖[3]。

揮發(fā)油是存在于植物中的可隨水蒸蒸汽蒸餾出來的油狀液體，多具有抗菌、殺蟲、抗氧化等生物活性，不同植物的揮發(fā)油組成成分不同，生物活性也不相同[4]。目前，對(duì)尾葉香茶菜揮發(fā)油的研究較少，僅見那微、南敏倫對(duì)尾葉香茶菜揮發(fā)油的化學(xué)成分進(jìn)行了分析[1,5]，而關(guān)于尾葉香茶菜揮發(fā)油的提取工藝及生物活性方面的研究則尚無報(bào)道。目前香茶菜屬植物的揮發(fā)油都是從陰干后的材料中提取的，由于揮發(fā)油易揮發(fā)，陰干耗時(shí)長(zhǎng)，因此很容易流失一些揮發(fā)油成分，降低得油率。本試驗(yàn)首次以新鮮尾葉香茶菜為材料，利用水蒸氣蒸餾法(SD法)和CO2超臨界流體萃取法(SFE-CO2法)提取揮發(fā)油，借助正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝條件，并對(duì)2種方法提取揮發(fā)油進(jìn)行抗菌和DPPH自由基清除能力測(cè)定與分析，為尾葉香茶菜的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論指導(dǎo)。

1　材料與方法

1.1材料與菌株

材料：野生尾葉香茶菜，于2015年7月采自吉林市龍?zhí)渡剑?jīng)吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院孫倉教授鑒定為尾葉香茶菜。

供試菌株：金黃色葡萄球菌Staphyloccocusaureus、大腸桿菌Escherichiacoli和枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis，均由吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2設(shè)備與試劑

HA121-50-1型超臨界萃取裝置設(shè)備(江蘇南通華安超臨界萃取有限公司)，R210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士步琪)，電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海鑫福電子科技有限公司)，723型可見分光光度計(jì)(上海光學(xué)儀器一廠)。

DPPH自由基(Sigma公司)；無水乙醚，無水硫酸鈉、LB培養(yǎng)基等，均為分析純。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1揮發(fā)油的提取

(1)SD法：稱取新鮮尾葉香茶菜1 000 g，剪碎，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中浸泡一段時(shí)間(表1)，然后提取揮發(fā)油，提取溫度100℃，提取液用無水乙醚萃取，無水硫酸鈉干燥[6]，收集揮發(fā)油，計(jì)算得油率。

得油率/%=(揮發(fā)油質(zhì)量/原材料質(zhì)量)×100%[7]

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)，考查浸泡時(shí)間、料液比和蒸餾時(shí)間對(duì)尾葉香茶菜得油率的影響，每個(gè)因素設(shè)3個(gè)水平，按照L9(33)正交表進(jìn)行試驗(yàn)，考查因素表如表1所示。

(2)SFE-CO2法：稱取新鮮尾葉香茶菜200 g，剪碎，放入萃取釜中提取。調(diào)節(jié)萃取壓力和萃取溫度，同時(shí)設(shè)置分離釜I：壓力8 MPa，溫度50℃；分離釜：壓力10 MPa,溫度55℃，待壓力平衡后計(jì)算萃取時(shí)間，一段時(shí)間后收集萃取物。

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)，考查萃取壓力、萃取時(shí)間和萃取溫度對(duì)尾葉香茶菜得油率的影響，每個(gè)因素設(shè)3個(gè)水平，按照L9(33)正交表進(jìn)行試驗(yàn)，考查因素表如表3所示。

1.3.2抑菌活性試驗(yàn)

(1)供試菌液的制備：利用LB斜面培養(yǎng)基分別活化3種供試菌株，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌株于生理鹽水中，制成含量約為1×108cfu·mL-1的供試菌液，備用[8]。

(2)抑菌圈直徑的測(cè)定：將用SFE-CO2法在最佳工藝條件下提取的揮發(fā)油和SD法提取的揮發(fā)油分別與無水乙醚按1∶1體積比混勻，用濾紙片擴(kuò)散法測(cè)定抑菌效果：將3種供試菌液分別涂布在平板上，將直徑為6 mm的無菌濾紙浸于揮發(fā)油溶液中，10 min后取出晾干，置于含菌平板上，每皿3片，1片為含揮發(fā)油濾紙，1片為只浸有乙醚的濾紙(空白對(duì)照)，1片為浸有0.1 mg·mL-1慶大霉素的濾紙(陽性對(duì)照)，重復(fù)試驗(yàn)4次，37℃培養(yǎng)24 h，測(cè)定抑菌圈直徑[9]。

(3)最小抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)的測(cè)定：采用2倍連續(xù)梯度稀釋法，用無水乙醚稀釋揮發(fā)油原液，使揮發(fā)油的體積分?jǐn)?shù)依次為64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25 μL·L-1，將無菌濾紙片分別浸泡于不同濃度的揮發(fā)油稀釋液中，使之充分吸收并晾干后，置于含菌平板上，每皿3片，其中1片為只浸有乙醚的濾紙(空白對(duì)照)，重復(fù)試驗(yàn)4次，37℃培養(yǎng)24 h，測(cè)定尾葉香茶菜揮發(fā)油的MIC，將低于揮發(fā)油MIC的未長(zhǎng)菌的平板，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，仍無菌生長(zhǎng)的最低濃度即為揮發(fā)油的MBC[10]。

1.3.3DPPH自由基清除試驗(yàn)參照鄧大貴等[11]的方法并改良，取2 mL不同質(zhì)量濃度的揮發(fā)油(5、15、30、45 μg·mL-1)和2 mL 0.2 mmol·L-1DPPH自由基強(qiáng)烈震蕩混勻，避光靜置30 min，在517 nm處測(cè)定吸光值，乙醇代替DPPH自由基為對(duì)照組，乙醇代替揮發(fā)油樣品為空白組，維生素C(Vc)為陽性對(duì)照，試驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算DPPH自由基清除率。

清除率/%={[1-(A樣品-A對(duì)照)]/A空白}×100%[11]

2　結(jié)果與分析

2.1SD法提取尾葉香茶菜揮發(fā)油

正交試驗(yàn)及極差分析結(jié)果如表1所示，可以看出RC>RA>RB，極差越大對(duì)尾葉香茶菜揮發(fā)油得油率的影響越大，反之影響越小，因此各因素對(duì)得油率的影響次序是：C(蒸餾時(shí)間)>A(浸泡時(shí)間)>B(料液比)，由方差分析結(jié)果(表2)可以看出，A(浸泡時(shí)間)因素和C(蒸餾時(shí)間)因素對(duì)得油率有顯著影響(P<0.05)，B(料液比)因素對(duì)得油率無顯著影響，影響程度排序與極差分析結(jié)果一致。綜上，SD法提取尾葉香茶菜揮發(fā)油的最佳工藝為A3B2C2，即浸泡時(shí)間8 h，料液比1：6，蒸餾時(shí)間7 h，在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，重復(fù)3次，得油率依次為0.183%、0.188%、0.187%，平均得油率為0.186%，該最佳工藝條件重復(fù)性良好。

表1　SD法正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表2　SD法方差分析

注：R2=0.991(調(diào)整R2=0.966)。

2.2SFE-CO2法提取尾葉香茶菜揮發(fā)油

正交試驗(yàn)及極差分析結(jié)果如表3所示，可以看出RA>RB>RC，各因素對(duì)尾葉香茶菜揮發(fā)油得油率的影響次序是：A(萃取壓力)>B(萃取溫度)>C(萃取時(shí)間)，方差分析結(jié)果如表4所示，可以看出，萃取壓力和萃取溫度對(duì)得油率影響顯著(P<0.05)，萃取時(shí)間對(duì)得油率影響不顯著，影響程度排序與極差分析結(jié)果一致。綜上，SFE-CO2法提取尾葉香茶菜揮發(fā)油的最佳工藝條件為A2B2C2，即萃取壓力30 MPa，萃取溫度50℃，萃取時(shí)間80 min，但是由于萃取時(shí)間對(duì)得油率影響不大，縮短時(shí)間又可以縮短工業(yè)生產(chǎn)周期，故筆者認(rèn)為應(yīng)選擇的最佳工藝條件是A2B2C1，在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，重復(fù)3次，得油率依次為0.438%、0.440%、0.443%，平均得油率為0.440%，該最佳工藝條件重復(fù)性良好。

表3SFE-CO2法正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

Table 3Orthogonal test and analysis on results for SFE extraction

表4　SFE-CO2 法方差分析

注：R2=0.992(調(diào)整R2=0.966)。

2.3抑菌活性試驗(yàn)

抑菌圈是揮發(fā)油在培養(yǎng)基中擴(kuò)散抑制菌株生長(zhǎng)形成的透明圈，最低抑菌濃度(MIC)是能夠抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低抑菌劑濃度，最低殺菌濃度(MBC)是能夠殺死99.9%以上菌株的抑菌劑濃度，因此抑菌圈越大，MIC和MBC越小，抑菌活性就越強(qiáng)。尾葉香茶菜揮發(fā)油的抑菌活性試驗(yàn)結(jié)果如表5所示，可知SFE-CO2法和SD法所提揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌均具有較強(qiáng)的抑殺作用，同種方法所提揮發(fā)油對(duì)枯草芽孢桿菌抑殺效果最好，金黃色葡萄球菌次之，對(duì)大腸桿菌抑殺效果較弱。對(duì)于同一種供試菌株，SFE-CO2法提取揮發(fā)油比SD法提取揮發(fā)油對(duì)供試菌株的抑菌圈直徑大，MIC小，MBC也小于或等于SD法所提揮發(fā)油，因此SFE-CO2法所提揮發(fā)油對(duì)3種供試菌的抑菌活性高于SD法所提揮發(fā)油。

表5　尾葉香茶菜揮發(fā)油的抑菌活性

注：A為金黃色葡萄球菌，B為大腸桿菌，C為枯草芽孢桿菌, -表示無抑菌圈。

2.4對(duì)DPPH自由基的清除試驗(yàn)

DPPH自由基，全稱1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，是一種含有3個(gè)苯環(huán)的穩(wěn)定性較好的自由基，醇溶液為紫色，在517 nm處有最大吸收峰，DPPH自由基具有單電子，可與抗氧化劑配對(duì)使其吸收減少，因此吸光值越小，對(duì)自由基的清除率就越大，抗氧化性也就越強(qiáng)[12]。尾葉香茶菜揮發(fā)油對(duì)DPPH自由基的清除率如圖1所示，可知SD法和SFE-CO2法所提揮發(fā)油對(duì)DPPH自由基均具有顯著的清除作用，在測(cè)定濃度范圍內(nèi)，對(duì)DPPH自由基的清除能力均隨揮發(fā)油濃度升高而增強(qiáng)，SD法曲線回歸方程為Y=1.713X+13.720，R2=0.994，半數(shù)清除率EC50為21.179 μg·mL-1，SFE-CO2法曲線回歸方程為Y=1.822X+16.211，R2=0.982，半數(shù)清除率EC50為18.545 μg·mL-1，以半數(shù)清除率EC50為評(píng)價(jià)指標(biāo)，兩種方法所提揮發(fā)油與陽性對(duì)照Vc相比差別顯著，結(jié)果為SFE-CO2法提取揮發(fā)油(18.545 μg·mL-1)SD法提取揮發(fā)油>Vc。

3　討論與結(jié)論

作為植物揮發(fā)油提取的傳統(tǒng)方法，SD法的優(yōu)點(diǎn)是設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便、成本低廉和不污染環(huán)境，缺點(diǎn)是提取時(shí)間長(zhǎng)、成分易揮發(fā)、提取率低、揮發(fā)油長(zhǎng)時(shí)間受熱易焦化變質(zhì)[13]。試驗(yàn)中SD法提取尾葉香茶菜揮發(fā)油的最佳蒸餾時(shí)間是7 h，得油率為0.186%。SFE-CO2法是20世紀(jì)70年代末發(fā)展起來的一種新型物質(zhì)分離技術(shù)，SFE-CO2具有優(yōu)良的溶劑能力，能夠有效分離基質(zhì)和萃取物[14]。SFE-CO2法提取植物揮發(fā)油具有得油率高、雜質(zhì)少、提取時(shí)間短、操作方便等優(yōu)點(diǎn)，本試驗(yàn)利用該法提取尾葉香茶菜揮發(fā)油的最佳萃取溫度是50℃，系統(tǒng)封閉和低溫可以避免熱敏性和易氧化成分的破壞，最佳萃取時(shí)間是80 min，低于SD法提取時(shí)間的1/5，大大縮短了生產(chǎn)周期，該條件下的得油率為0.440%，是SD法的2.366倍。抑菌活性試驗(yàn)表明SD法和SFE-CO2法提取的揮發(fā)油均能顯著抑殺2種革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌)和1種革蘭陰性菌(大腸桿菌)，DPPH自由基清除試驗(yàn)表明2種方法提取揮發(fā)油均具有較顯著的抗氧化作用， SFE-CO2法提取揮發(fā)油的抗菌、殺菌和抗氧化活性均高于SD法提取揮發(fā)油，因此筆者認(rèn)為利用SFE-CO2法提取尾葉香茶菜揮發(fā)油值得推廣應(yīng)用。

綜上可知SFE-CO2法提取的揮發(fā)油具有顯著的體外抑菌和抗氧化能力，但對(duì)揮發(fā)油中發(fā)揮作用的具體活性成分并不清楚，下一步將對(duì)尾葉香茶菜揮發(fā)油的活性成分進(jìn)行分離和鑒定，為尾葉香茶菜的開發(fā)應(yīng)用以及新藥的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

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(責(zé)任編輯：黃愛萍)

Extraction and Antibacterial and Antioxidative Properties of Volatile Oil fromIsodonexcia

WANG Xia1,2, XU Ju-xiang3, YU Xiao-ming1,2，XU Ya-wei1,2

(1.CollegeofJilinAgricultureScienceAndTechnology,Jilin,Jilin132101,China;2.KeyLaboratoryofChangbaiMountainAnimalandPlantRescources′UtilizationandProtectionofUniversitiesinJilinProvince,Jilin,Jilin132101,China;3.Farmers′ScienceandTechnologyEducationCenterofPanshiCity,Panshi,Jilin132300,China)

Extraction, as well as the antibacterial and antioxidative properties, of the volatile oil fromIsodonexciawere studied. The volatile oil was extracted by means of the steam distillation (SD)and supercritical CO2(SFE)method. The processes were optimized by an orthogonal test and the results were compared.Aninvitroantibacterial test and a para-DPPH-radical scavenging ability determination were conducted on the oil samples obtained. The results showed that the optimized extraction conditions for the SD method included substrate soaking for 8 h, a substrate:solvent ratio of 1∶6, and distillation for 7 h to get an oil yield of 0.186%.Whereas, those for the SFE method consisted of a processing pressure of 30 MPa and extract at 50℃ for 80 min to achieve an oil yield of 0.440%. The antibacterial and antioxidation properties of the volatile oil extracted by SFE were higher than those of the oil extracted by SD method. The bacteriostatic efficacies against various pathogens of the oils were in the order of:Bacillussubtilis>Staphyloccocusaureus>Escherichiacoli. The para-DPPH-radical scavenging ability of the oil extracted by SFE was the greatest, followed by that of SD and vitamin C. Both optimized processes were stable, however, the SFE method was considered more suitable for the extraction because its process cycle was shorter, oil yield higher,andantibacterial and antioxidant efficacies of the extracted volatile oil greaterthan the SD method.

Isodonexcia;volatile oil;extractionprocess;antibacterial; antioxidative

2016-03-12初稿；2016-04-14修改稿

王霞(1978-)，女，碩士，講師，研究方向：植物分子生物學(xué)及天然產(chǎn)物分離(E-mail：wangxhangj@126.com)

長(zhǎng)白山重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育項(xiàng)目(吉農(nóng)院合字[2013]第s016 號(hào))

R 284

A

1008-0384(2016)07-747-05

王霞，許菊香,于曉明，等.尾葉香茶菜揮發(fā)油的提取工藝及其抗菌和抗氧化作用[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2016，31(7)：747-751.

WANG X，XU J-X，YU X-M，et al.Extraction and Antibacterial and Antioxidative Properties of Volatile Oil fromIsodonexcia[J].FujianJournalofAgriculturalSciences，2016，31(7)：747-751.