地椒揮發(fā)油提取工藝及GC-MS成分分析

路立峰，李赫宇，張曉林，胡高升

（1.山東藥品食品職業(yè)學(xué)院，山東威海264210；2.天津市益倍建生物技術(shù)有限公司，天津300457；3.沈陽藥科大學(xué)中藥學(xué)院，遼寧沈陽110015）

地椒揮發(fā)油提取工藝及GC-MS成分分析

路立峰1，李赫宇2，張曉林1，胡高升3，*

（1.山東藥品食品職業(yè)學(xué)院，山東威海264210；2.天津市益倍建生物技術(shù)有限公司，天津300457；3.沈陽藥科大學(xué)中藥學(xué)院，遼寧沈陽110015）

確定地椒揮發(fā)油的最佳提取工藝并對其進(jìn)行成分分析。通過單因素試驗，確定了影響揮發(fā)油提取的4個因素；選用L9（34）正交試驗，以揮發(fā)油得率為指標(biāo)，對影響揮發(fā)油收率的提取時間（A）、浸泡時間（B）、粉碎度（C）、加水量（D）4個因素進(jìn)行提取工藝條件優(yōu)選，并按最佳提取工藝提取的揮發(fā)油進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，地椒揮發(fā)油的最佳提取工藝為藥材粗粉加入10倍量的水、浸泡2h、提取4h，并鑒定出了63種揮發(fā)性化學(xué)成分。

地椒揮發(fā)油；提取工藝；氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）

地椒為唇形科（Labiatae）百里香屬植物地椒Thymus quinquecostatus Celak，與植物百里香Thymus mongolicus ronn、展毛地椒Thymus quinquecostatus Celak var przewalskii（kom.）ronn同屬百里香屬，親緣關(guān)系相近。地椒Thymus quinquecostatus Celak在國內(nèi)廣泛分布于山東、遼寧、河北、河南、山西、江蘇等省，具有祛風(fēng)解表，通氣止痛，止咳降壓的功效［1］。臨床主要用于治療感冒、頭痛、百日咳、濕疹瘙癢等病［2］。其屬植物中含有的揮發(fā)油亦可作化妝品、香皂的原料［3］，同時地椒在民間有著悠久的藥食兩用的歷史，因此進(jìn)一步開發(fā)地椒具有廣闊的前景。為了指導(dǎo)生產(chǎn)和保證產(chǎn)品的收率，本文選取地椒的揮發(fā)油得率為指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗優(yōu)選提取條件，并采用氣相色譜-質(zhì)譜（GCMS）分析技術(shù)鑒定揮發(fā)油中的化學(xué)成分，以期為地椒的生產(chǎn)和科研提供參考。

1材料與方法

1.1材料與試劑

地椒采于山東威海與煙臺交界處的峒嶺山，經(jīng)鑒定為唇形科百里香屬植物地椒的地上部分，將藥材除去雜質(zhì)，陰涼處晾干，備用。

1.2儀器與設(shè)備

LK-2000A粉碎機(jī)：浙江彰誠機(jī)械設(shè)備有限公司；FA2004型電子分析天平：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；揮發(fā)油測定儀器、ZNHW型電熱套：上?；ゼ褍x器設(shè)備有限公司；Aglient 7890 GC/5795 MS machine，色譜柱：Agilent 19091s-433UIHP-5MS capillary column（30 m×320 μm，0.25 μm）。

1.3方法

1.3.1地椒揮發(fā)油的提取方法

精密稱取地椒100.0 g，參照《中國藥典》2010年版一部附錄XD揮發(fā)油測定法，提取揮發(fā)油，精確讀數(shù)計量，計算揮發(fā)油得率，以考察提取時間、浸泡時間、藥材細(xì)度、加水量4個因素對地椒揮發(fā)油提取率的影響。

具體操作是：稱取不同規(guī)格的地椒樣品，置于揮發(fā)油提取器中，加入一定量的水浸泡一定時間，水蒸氣蒸餾一定時間，收集淡黃色油狀液體，加入無水硫酸鈉脫水，讀取揮發(fā)油的量，計算揮發(fā)油含量。

1.3.2地椒揮發(fā)油的GC-MS分析色譜條件

對最佳工藝提取的地椒揮發(fā)油，運用GC-MS技術(shù)分析，獲取總離子流圖，將得到的數(shù)據(jù)運用NIST10標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，峰面積比例計算方法為面積歸一化法。

色譜柱：Agilent 19091s-433UIHP-5MS capillary column（30 m×320 μm，0.25 μm）；升溫程序：40℃保持2 min，5℃/min提高到260℃，維持260℃1 min。載氣（He）流速1.2 mL/min，壓力2.4 kPa，進(jìn)樣量1 μL；分流比：5∶1。

1.3.3地椒揮發(fā)油的GC-MS分析質(zhì)譜條件

電子轟擊離子源；電離模式為EI+；電離能為70eV；離子源溫度℃；質(zhì)荷比范圍為50～1 000。

2結(jié)果與分析

2.1地椒揮發(fā)油提取的單因素試驗

2.1.1加水量對揮發(fā)油提取率的影響

準(zhǔn)確稱取粉碎至一定程度的地椒樣品100 g，分別加入4、6、8、10、12、14倍量水，室溫下浸泡2 h后，水蒸氣蒸餾提取3 h，稱量并計算提取率。結(jié)果見圖1。

圖1表明，加水量在12倍時，地椒揮發(fā)油的提取率為最高，但與10倍加水量提取率變化不大，故確定8、10、12倍為因素A的3個水平。

圖1　加水量對地椒揮發(fā)油提取率的影響Fig.1Effects of water amount on the extraction yield of volatile oil from Thymus quinquecostatus Celak

2.1.2浸泡時間對揮發(fā)油提取率的影響

準(zhǔn)確稱取粉碎至一定程度的地椒樣品100 g，各加入10倍量水，分別浸泡1、2、3、4、5、6、7 h，水蒸氣蒸餾提取6 h后，收集揮發(fā)油，稱重并計算提取率。結(jié)果見圖2。

圖2　浸泡時間對地椒揮發(fā)油提取率的影響Fig.2Effects of soaking time on the extraction yield of volatile oil from Thymus quinquecostatus Celak

圖2顯示地椒的最佳浸泡時間為3、4 h之后的提取率基本變化不大，故確定提取因素B的3個水平為1、2、3 h。

2.1.3蒸餾提取時間對揮發(fā)油提取率的影響

準(zhǔn)確稱取粉碎至一定程度的地椒樣品100 g，加1 000 mL水，浸泡2 h，分別蒸餾提取1、2、3、4、5、6、7 h，收集揮發(fā)油，稱重，計算提取率。結(jié)果見圖3。

圖3　蒸餾時間對地椒揮發(fā)油提取率的影響Fig.3Effects of extracting time on the extraction yield of volatile oil from Thymus quinquecostatus Celak

圖3顯示蒸餾提取1 h～7 h，7個梯度中4 h時地椒揮發(fā)油提取率最大，5 h之后揮發(fā)油含量變化不大，故設(shè)計蒸餾時間C的3個水平為3、4、5 h。

2.1.4藥材粉碎度對揮發(fā)油提取率的影響

取不同粉碎度的地椒樣品100 g，加1 000 mL水浸泡2 h后，蒸餾提取，保持微沸6 h，收集揮發(fā)油，稱重，計算提取率。結(jié)果見圖4。

圖4　粉碎度對地椒揮發(fā)油提取率的影響Fig.4Effects of comminution granularity on the extraction yield of volatile oil from Thymus quinquecostatus Celak

圖4顯示最佳粉碎度為10目～20目，確定粉碎度因素D的3個水平為1.5 cm段，10目～20目，20目～40目。

2.2正交試驗設(shè)計

2.2.1因素水平的確定

根據(jù)影響揮發(fā)油的提取因素，在預(yù)試驗的基礎(chǔ)上，選取加水量（A）、浸泡時間（B）、提取時間（C）、粉碎度（D）作為考察因素，每個因素設(shè)計3個水平，以揮發(fā)油得率（mL/100 g）為考察指標(biāo)，設(shè)計L9（34）正交試驗，見表1。

表1　地椒揮發(fā)油提取工藝正交試驗因素水平表Table 1The orthogonal factor table of extraciton process of volatile oil from Thymus quinquecostatus Celak

2.2.2正交試驗

正交試驗結(jié)果見表2。

表2　正交試驗結(jié)果Table 2The results of orthogonal array test

續(xù)表2正交試驗結(jié)果Continue table 2The results of orthogonal array test

由表2直觀分析可知R1＞R4＞R3＞R2，說明加水量是影響提取地椒揮發(fā)油的最主要因素，其次是樣品的粉碎度和提取時間，而浸泡時間的影響則不明顯，即A、B、C、D 4個因素的影響依次是A＞D＞C＞B，確定A2D3C2B2為最佳提取工藝，即取粉碎至20～40目地椒樣品，加入10倍量水，浸泡2 h，蒸餾提取4 h。

2.2.3方差分析

對表2的揮發(fā)油得率進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

表3　方差分析表Table 3The table of ariance analysis

2.2.4驗證試驗

取地椒樣品3份，按確定的最佳工藝條件，進(jìn)行驗證性試驗，3次揮發(fā)油提取率分別是1.23%、1.21%、1.23%，重復(fù)性良好，說明工藝條件穩(wěn)定可靠。

2.2.5GC-MS分析結(jié)果

地椒揮發(fā)油GC-MS分析圖見圖5，63種組分成分見表4。

圖5　地椒揮發(fā)油GC-MS分析圖Fig.5The GC-MS analysis diagram of volatile oil from Thymus quinquecostatus Celak

表4　地椒揮發(fā)油成分分析結(jié)果Table 4The result of chemical component analysis of volatile oil from Thymus quinquecostatus Celak

續(xù)表4地椒揮發(fā)油成分分析結(jié)果Continue table 4The result of chemical component analysis of volatile oil from Thymus quinquecostatus Celak

3結(jié)論與討論

地椒揮發(fā)油中鑒定的63種成分中，含量超過1%的有：莰烯（1.780%）、蘑菇醇（4.213%）、β-蒎烯（1.444%）、3-辛醇（1.442%）、鄰傘花烴（2.004%）、D-香芹烯（4.116%）、桉樹腦（13.104%）、γ-松油烯（2.353%）、二環(huán)［3.1.0］己烷-2-醇，2-甲基-5-（1-甲基乙基）-，（1α，2β，5α）（13.684%）、α-甲基-α-［4-甲基-3-戊烯基］環(huán)氧乙烷甲醇（11.721%）、芳樟醇或沉香醇（11.474%）、4-萜烯醇（6.410%）、莰酮（8.648%）、香芹蒎酮（1.448%）、合成右旋龍腦（4.595%），主要化學(xué)成分為：二環(huán)［3.1.0］己烷-2-醇，2-甲基-5-（1-甲基乙基）-，（1α，2β，5α）（13.684%）、桉樹腦（13.104%）、α-甲基-α-［4-甲基-3-戊烯基］環(huán)氧乙烷甲醇（11.721%）、芳樟醇或沉香醇（11.474%）、莰酮（8.648%）、4-萜烯醇（6.410%）、合成右旋龍腦（4.595%）、蘑菇醇（4.213%），多為單萜及其衍生物。但與文獻(xiàn)報道［4-6］的揮發(fā)油成分及含量均有較大區(qū)別，究其原因，可能與地椒的生長環(huán)境、采收季節(jié)、加工方式以及提取處理方法有關(guān)。

本文通過對山東產(chǎn)地椒進(jìn)行揮發(fā)油提取工藝優(yōu)化，并對按最佳提供工藝提取的揮發(fā)油進(jìn)行GC-MS分析，結(jié)果表明，山東產(chǎn)地椒在桉樹腦、芳樟醇、莰酮等成分含量方面較突出。而芳樟醇目前除廣泛應(yīng)用于洗化用品、食用香精外，還具有明顯的藥理活性如鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛、抗焦慮、催眠、抗菌消炎、抗腫瘤；桉樹腦和莰酮對昆蟲具有較好的驅(qū)避、熏蒸作用。因此，綜合開發(fā)利用地椒，尤其是對地椒進(jìn)行深層次的加工利用，具有廣闊的開發(fā)前景。

［1］陳漢斌，鄭亦津，李法曾.山東植物志［M］.青島：青島出版社，1992：1058-1059

［2］國家中醫(yī)藥管理局中華本草編委會.中華本草［M］.第7分冊.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1999：234-235

［3］孫寶國.香精概論［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，1996：58-59

［4］陳光英，袁藝，艾克蕙，等.地椒揮發(fā)油化學(xué)成分研究［J］.藥學(xué)學(xué)報，2001，36（3）：233-234

［5］陳建英，張可煒，程傳格，等.五脈地椒揮發(fā)油化學(xué)成分的研究［J］.中國藥學(xué)雜志，2001，36（1）：16-18

［6］楊成俊，周偉慶，劉濤，等.煙臺百里香揮發(fā)油的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析［J］.時珍國醫(yī)國藥，2011，22（4）：931-933

Extraciton Process of Volatile Oil from Thymus quinquecostatus Celak and Analysis of Chemical Components by GC-MS

LU Li-feng1，LI He-yu2，ZHANG Xiao-lin1，HU Gao-sheng3，*
（1.Shandong Drug and Food Vocational College，Weihai 264210，Shandong，China；2.Tianjin Ubasichealth Nutrition Co.，Ltd.，Tianjin 300457，China；3.College of Traditional Chinese Medicine，Shenyang Pharmaceutical University，Shenyang 110015，Liaoning，China）

To study the optimum extraction technology and the chemical constituents of volatile oil from Thymus quinquecostatus Celak.Single factor test method was used for studying the effects of four extracting factors. With the yield of volatile oil as index，orthogonal experimental design L9（34）was used for studying the effects of four extracting factors these were extracting time（A），soaking time（B），crushing degree（C）and the amount of water（D）.Constituents of volatile oil extracted were identified by the application of GC-MS techniques.The optimal condition for the extraction of volatile oil from Thymus quinquecostatus Celak was：powdery medicinal materials，ten times water，soaked for 2 hours and extracting time at four hours.63 kinds the chemical constituent of volatiles were identified.

volatile oil from Thymus quinquecostatus Celak；extraction process；gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS）

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.19.038

2015-11-18

路立峰（1980—），男（漢），講師，碩士，研究方向：中藥質(zhì)量控制。

胡高升（1982—），男（漢），講師，博士，研究方向：中藥資源學(xué)。