人工接種CMV后辣椒植株中病毒含量的時序變化及癥狀表型

王興興 張正海 曹亞從 王立浩 張寶璽

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

人工接種CMV后辣椒植株中病毒含量的時序變化及癥狀表型

王興興 張正海 曹亞從 王立浩 張寶璽*

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

以5份不同類型的辣（甜）椒為供試材料，人工接種CMV重花葉型株系，通過DAS-ELISA方法，分別檢測接種5、10、15、20、25、30 d后辣椒植株中CMV含量的時序變化，同時對供試材料進(jìn)行人工接種抗性鑒定，并對2種方法得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果顯示：不同類型供試材料接種5～15 d后的病毒含量逐漸增加，并于15 d時達(dá)到最高水平，之后略有回落；通過DAS-ELISA檢測得到的植株病毒含量與人工接種抗性鑒定得到的病情指數(shù)呈正相關(guān)，說明2種鑒定方法獲得的結(jié)果一致。

CMV；辣椒；DAS-ELISA；時序變化；癥狀表型

黃 瓜 花 葉 病 毒（Cucumber mosaic virus，CMV）屬于雀麥花葉病毒科（Bromorididae）黃瓜花葉病毒屬（Cucumovirus）。CMV首度在密歇根和紐約的黃瓜上發(fā)現(xiàn)（Doolittle，1916；Jagger，1916），該病毒可侵染茄科等多種作物，為害辣椒后，引起花葉、明脈、蕨葉、壞死斑、矮化和果實(shí)畸形等系統(tǒng)癥狀，損害果實(shí)的商品性狀，嚴(yán)重影響經(jīng)濟(jì)效益（Palukaitis et al.，1992；方中達(dá)，1998；鄒學(xué)校，2002），且寄主所表現(xiàn)出的病狀與體內(nèi)CMV的積累量有相關(guān)性。在為害辣椒生產(chǎn)的病毒病中，CMV已占到60%左右（毛愛軍和耿三省，2002），成為我國辣椒生產(chǎn)上的主要病毒病之一。

長期以來，植物對病毒的抗性鑒定主要依據(jù)植株本身的外觀癥狀或指示植物來進(jìn)行，但這種生物學(xué)方法費(fèi)時費(fèi)力，鑒定周期長，且易受環(huán)境條件的影響，還存在反應(yīng)不穩(wěn)定、重復(fù)性差等弊端（蘭玉菲 等，2006；杜琳 等，2007）。隨著血清學(xué)技術(shù)的發(fā)展，血清學(xué)方法在病毒檢測上的應(yīng)用也越來越廣泛，其中雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗（double antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay，DAS-ELISA）已成為常規(guī)的病毒檢測方法，即根據(jù)抗原與抗體的特異免疫反應(yīng)，使酶標(biāo)抗體和抗原結(jié)合形成復(fù)合物，結(jié)合酶催化反應(yīng)通過底物顯色進(jìn)行定量分析。在馬鈴薯病毒檢測中，該方法已被列為國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法（GB 18133—2012）（張志軍 等，2015），在CMV的鑒定方面也已得到應(yīng)用（王海河 等，1999；梁巧蘭 等，2006；Mahmoud，2011）。分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，也為病毒的檢測提供了高靈敏度、特異性強(qiáng)、應(yīng)用范圍廣、時空限制小的新方法（杜琳 等，2007），其中熒光定量技術(shù)檢測CMV已在花卉（Wei et al.，2012）、香蕉（孫潔，2014）、辣椒（黃婭，2015）等多種作物中應(yīng)用，并建立起成熟的應(yīng)用體系。雖然多種方法可以檢測植物中病毒的存在，但目前植物對病毒的抗性水平主要是依據(jù)病情分級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行劃分，而該方法受植物生物學(xué)性狀以及人為因素的影響較大。

CMV系統(tǒng)侵染寄主之后，表現(xiàn)出一定的時間效應(yīng)（陳集雙 等，2003）。目前關(guān)于系統(tǒng)侵染后植株中CMV含量隨時間的動態(tài)變化的研究還甚少（傅天珍 等，2006），通過ELISA鑒定辣椒對CMV抗性水平的研究也不多（Wang et al.，1997；Kang et al.，2010）。本試驗利用DAS-ELISA探究人工接種后辣椒植株內(nèi)CMV含量的時序變化，同時采用人工分級的方法對供試材料的抗性進(jìn)行鑒定，研究植物組織內(nèi)CMV負(fù)荷量的變化與植株癥狀之間的關(guān)系，以期為辣椒對CMV的抗性鑒定提供量化的鑒定標(biāo)準(zhǔn)。

1　材料與方法

1.1試驗材料

選用5份不同類型的一年生辣（甜）椒（Capsicum annuum L.）材料，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所辣椒課題組提供。Perennial：小果辣椒，葉片較小，葉色綠；Milord：中果甜椒，中型葉，葉色淺綠；茄門：中果甜椒，中型葉，葉色深綠；Yolo Wonder：大果甜椒，葉片較大，葉色綠；83-58：大果甜椒，葉片較大，葉色淺綠。

病原為CMV重花葉型株系，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所病害課題組提供。CMV擴(kuò)繁材料為三生煙（Nicotiana tabacum var.Samsun NN）。2015年5月于玻璃溫室中種植三生煙，6月種植上述5份供試材料，每份材料3個重復(fù)，每個重復(fù)15株。

1.2試驗方法

1.2.1人工接種及取樣 將保存的病葉鮮質(zhì)量（g）與0.03 mol·L-1pH值為8的PBS緩沖液體積（mL）按1∶5的比例，在冰浴中研磨成勻漿，3 000 r· min-1離心5 min（趙娟，2009），取上清液作為接種液。采用摩擦接種法，首先在煙草葉面上均勻撒上600目的金剛砂，再將接種液接種到具5～6片真葉的煙草幼苗上，以擴(kuò)繁CMV，溫度控制在28℃。將接種10 d后發(fā)病的煙草葉片按照上述方法制備接種液，轉(zhuǎn)接具有3～4片葉的辣椒植株的第1、2片真葉（田如燕 等，1989），用連續(xù)加樣器每片葉片接種20 μL接種液。用手指輕輕摩擦葉片，及時用水沖去葉面多余汁液；3 d后回接種1次。接種后溫度控制在28 ℃左右（趙娟，2009）。分別于接種后5、10、15、20、25、30 d取上部新葉進(jìn)行DAS-ELISA檢測。每份材料每個時期取3個重復(fù)，每份樣品取0.2 g，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2辣椒植株中CMV含量的DAS-ELISA檢測

參照美國Agdia公司DAS-ELISA檢測試劑盒說明及前人的方法（張志軍 等，2015），對人工接種CMV后辣椒植株中病毒含量進(jìn)行DAS-ELISA檢測。用酶標(biāo)儀在405 nm波長處讀取反應(yīng)結(jié)果，OD405代表病毒外殼蛋白（CP）含量，即辣椒植株中CMV的含量。

1.2.3人工接種抗性鑒定 于接種后第25天，參照國家“八五”辣椒抗病育種攻關(guān)組分級標(biāo)準(zhǔn)（李樹德，1995）（表1），對辣椒植株進(jìn)行CMV抗性鑒定。

表1　辣椒CMV抗性鑒定病情分級標(biāo)準(zhǔn)

病情指數(shù)（DI）=〔∑（各級發(fā)病株數(shù)×病級數(shù)）/（9×調(diào)查株數(shù)）〕×100

抗病性劃分標(biāo)準(zhǔn)：免疫（I）：DI=0；高抗（HR）：0＜DI≤5；抗?。≧）：5＜DI≤15；中抗（MR）：15＜DI≤30；感?。⊿）：30＜DI≤40；高感（HS）：DI＞40。

1.2.4不同抗性鑒定方法之間的相關(guān)性分析 利用SPSS軟件對人工接種后同一材料不同時期以及同一時期不同供試材料植株中病毒含量進(jìn)行單因素方差分析，并采用Bivariate功能對2種方法的抗性鑒定結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析。

2　結(jié)果與分析

2.1人工接種CMV后辣椒植株中的病毒含量

利用DAS-ELISA檢測辣椒植株中的病毒含量，結(jié)果表明（圖1），人工接種CMV后，5～15 d內(nèi)辣椒植株中的病毒含量逐漸升高，15 d時病毒含量達(dá)到最大值；之后病毒含量有所回落，接種25 d后趨于平穩(wěn)。不同材料的病毒含量與人工分級鑒定結(jié)果一致，但辣椒材料Milord的病毒含量值偏高。Perennial接種后各個時期植株中病毒含量差異不顯著，其他4份材料接種5、10 d和15 d后，不同時期的植株中病毒含量均差異顯著。

圖1　人工接種后辣椒植株中CMV含量的時序變化

2.2人工接種抗性鑒定

對上述5份供試材料人工接種CMV后，參照國家“八五”辣椒抗病育種攻關(guān)組分級標(biāo)準(zhǔn)（表1）調(diào)查植株的發(fā)病情況，結(jié)果顯示：接種前7 d大部分植株都未顯示病癥；10 d時出現(xiàn)輕微的癥狀，發(fā)病等級多為1、2級；15 d時發(fā)病癥狀明顯，供試材料在表型上出現(xiàn)明顯差異；20 d時病癥進(jìn)一步加強(qiáng)，25～30 d持續(xù)顯現(xiàn)發(fā)病癥狀。接種25 d后的抗性鑒定結(jié)果表明，Perennial病情指數(shù)為15.12，對CMV表現(xiàn)為抗病，Milord病情指數(shù)為32.58，對CMV表現(xiàn)為中抗，83-58、Yolo Wonder、茄門3個材料的病情指數(shù)分別為50.71、55.70和65.06，為高感CMV品種，其中茄門的抗性最差。

2.3不同抗性鑒定方法之間的相關(guān)性分析

對接種后同一時期不同供試材料的病毒含量進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果顯示（表2）：接種5 d后，各材料植株中病毒含量差異不顯著；接種10 d后，抗性最差的茄門與抗性最強(qiáng)的Perennial植株中病毒含量差異顯著；接種15 d后，抗CMV材料Perennial與其他材料植株中病毒含量差異顯著。

表2　同一時期不同辣椒材料植株中CMV含量的差異顯著性分析

利用SPSS軟件對不同時期的辣椒材料病毒含量與抗性鑒定結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示（表3）：接種后各調(diào)查時期植株病毒含量與病情指數(shù)呈正相關(guān)，相關(guān)性系數(shù)分布范圍為0.658～0.912，其中接種15 d后的相關(guān)系數(shù)最高，為0.912，且顯著相關(guān)。

表3　不同抗性鑒定方法的相關(guān)性分析

3　結(jié)論與討論

病毒在植株內(nèi)積累、轉(zhuǎn)移與植株的病癥有一定的相關(guān)性，積累量具有一定的時間效應(yīng)（陳集雙等，2003）。本試驗選取5份不同辣（甜）椒材料人工接種CMV后，5～30 d內(nèi)各材料植株中病毒含量隨時間變化表現(xiàn)出一致的趨勢，即前15 d持續(xù)增加，15 d時達(dá)到最高水平，之后病毒含量有所回落，接種25 d后趨于平穩(wěn)。并且，人工接種15 d后植株中病毒含量同病情分級抗性鑒定結(jié)果一致。該結(jié)果為病害防治及病毒檢測提供了有效參考時期的依據(jù)。但本試驗中人工接種CMV后，辣椒植株中的病毒含量變化趨勢與傅天珍等（2006）的研究結(jié)論不完全一致，可能與取樣方式存在差異有關(guān)。

通過DAS-ELISA檢測植株內(nèi)病毒含量與病情分級抗性鑒定均可反映寄主植物對CMV的抗性水平，本試驗中2種方法鑒定獲得的抗性結(jié)果基本一致。高病毒含量表示該品種的抗性弱，相反則表示抗性強(qiáng)。盡管不同時期病毒含量與病情分級抗性鑒定結(jié)果的相關(guān)性有差異，但這恰恰反映了供試材料在接種后的表型抗性滯后于病毒含量的表現(xiàn)，存在積累的過程。病情分級抗性鑒定的結(jié)果會因操作人的不同而有差異，同時，供試材料的植物學(xué)性狀對鑒定結(jié)果也有一定影響。因而本試驗嘗試采用在設(shè)有抗、感對照的情況下，通過DAS-ELISA檢測植株內(nèi)病毒含量來表示供試材料的抗性水平，以期為辣椒CMV的抗性鑒定提供有價值的參考。

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Temporal Change of CMV and Symptom Phenotype in Pepper after Artificial Inoculation

WANG Xing-xing，ZHANG Zheng-hai，CAO Ya-cong，WANG Li-hao，ZHANG Bao-xi*
（Institute of Vegetables and Flowers，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China）

Taking 5 pepper of different genotypes as experimental material，after artificial inoculating heavy mosaic strain CMV，we tested the temporal change of CMV content in 5，10，15，20，25，30 days by DASELISA.At the same time，the artificial classification method was used，and we carried out analysis on the correlation of data gained through these 2 methods.The results showed that the virus content increased at 5，10，15 days in turn，reached the highest level at 15 days.Then，the virus content reduced slightly.The virus content of the plants obtained by DAS-ELISA was positively correlated with the disease index obtained by artificial inoculation.The results obtained by the 2 methods were consistent.

CMV；Pepper；DAS-ELISA；Temporal Change；Symptom Phenotype

王興興，女，碩士研究生，專業(yè)方向：蔬菜遺傳育種，E-mail：1021348247@qq.com

（

）：張寶璽，研究員，碩士生導(dǎo)師，專業(yè)方向：蔬菜遺傳育種，E-mail：zhangbaoxi@caas.cn

2016-02-29；接受日期：2016-04-19

國家“863”項目（2012AA100103002），中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程項目（CAAS-ASTIP-IVFCAAS），農(nóng)業(yè)部大宗蔬菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目（CARS-25），公益研究所基金項目（ICS，CAAS，1610032011011）