人工抗菌肽MA-D4的原核表達及其生物活性鑒定

劉誠

（1.廣西大學新聞傳播學院，廣西南寧530004；2.亞熱帶農業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室，廣西南寧530004）

?

人工抗菌肽MA-D4的原核表達及其生物活性鑒定

劉誠1，2*

（1.廣西大學新聞傳播學院，廣西南寧530004；2.亞熱帶農業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室，廣西南寧530004）

為研究人工抗菌肽MA-D4的高效制備方法，檢測其體外生物活性，探索該抗菌肽作為新型抗菌藥物的應用前景和開發(fā)潛力，本試驗設計人工抗菌肽MA-D4的氨基酸序列，并采用大腸桿菌偏嗜性密碼子設計編碼該抗菌肽的核苷酸序列；采取重疊區(qū)擴增基因拼接法合成目的基因，構建原核表達載體，并轉化至大腸桿菌中誘導表達；表達產(chǎn)物經(jīng)腸激酶酶切處理和鎳離子親和層析純化后，進行體外生物活性檢測。結果表明，人工抗菌肽MA-D4具備較強的廣譜抗菌活性，可抑制革蘭氏陽性菌和陰性菌，同時不具有溶血活性。綜上所述，人工抗菌肽MA-D4在食品防腐、疾病治療等方面具有良好的應用前景，極具開發(fā)潛力。

抗菌肽；MA-D4；原核表達；生物活性

抗菌肽是一類由宿主產(chǎn)生的能夠抵抗外界病原體感染的小分子多肽，是生物天然免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分，由特定基因編碼產(chǎn)生，具有廣譜抗菌活性（劉誠等，2011）。抗菌肽廣泛存在于各種生物體內，在微生物、植物和動物體中均有發(fā)現(xiàn)并成功分離獲得。但生物體內抗菌肽含量較低，直接提取的工藝要求高、難度大，無法應用于規(guī)?；a(chǎn)。人工化學合成雖可獲得與天然抗菌肽一致的氨基酸序列，但是常常不能形成正確的空間結構，且因成本昂貴，使其目前僅停留在實驗室試驗階段。通過基因工程途徑合成人工抗菌肽是規(guī)?；a(chǎn)制備的理想選擇。研究表明，雜合不同抗菌肽分子可以有效改善其生物活性，消除或降低其細胞毒性和溶血活性（謝海偉等，2012）。本試驗將抗菌肽Magainin和Dermaseptin-4雜合并進行高效表達，以期為相關研究提供理論依據(jù)。

1　材料和方法

1.1質粒、菌株原核表達質粒pET-32a（+）、基因工程菌E.coli BL21（DE3）pLysS和E.coli DH5α，均購自默克化工技術（上海）有限公司；金黃色葡萄球菌（10384）、枯草芽孢桿菌（21744）購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；綠膿桿菌、豬鏈球菌2型和炭疽桿菌由湖南農業(yè)大學分子免疫學與微生物學實驗室保存。

1.2主要試劑限制性內切酶、DNA分子量Marker，均購自寶生物工程（大連）有限公司；蛋白質分子量Marker購自Fermentas公司；Taq PCR Mastermix、DNA凝膠回收試劑盒、質粒抽提試劑盒，均購自天根生化科技（北京）有限公司；腸激酶（Z01003）購自南京金斯瑞生物科技有限公司；其他試劑均為分析純級產(chǎn)品。

1.3設計抗菌肽MA-D4氨基酸序列和MA-D4基因根據(jù)GenBank中的抗菌肽Magainin（No. 474452717）和Dermaseptin-4（No.P84924.1）成熟肽氨基酸序列，將抗菌肽Magainin第21位的甲硫氨酸（Met）替換成色氨酸（Trp），設計出人工抗菌肽MA-D4的氨基酸，序列如下所示，下劃線為腸激酶識別位點。

參照Hoffmann等（1996）的方法，采用大腸桿菌偏嗜性密碼子設計編碼抗菌肽MA-D4的核苷酸序列，并在兩端分別添加核酸限制性內切酶XhoI和BamHI識別位點，形成MA-D4基因，共有204bp，序列如下所示，下劃線分別為核酸限制性內切酶XhoI和BamHI的識別位點。

1.4MA-D4基因合成和原核表達載體構建利用DNAStar軟件，設計兩兩互補的4條PCR引物（表1）。其中P1與P2之間、P2與P3之間、P3與P4之間均有15個核苷酸互補。由廣州英駿生物有限公司合成上述引物。

表1　合成MA-D4基因的PCR引物

采用重疊區(qū)擴增基因拼接法，多步PCR獲得人工抗菌肽MA-D4基因。先以P1和P2為引物擴增MA-D4基因前半部分序列MA-D4-Q，再以P3和P4為引物擴增MA-D4基因后半部分序列MA-D4-H，最后以前兩次PCR產(chǎn)物為模板，P1和P4為引物擴增獲得完整的MA-D4基因。反應體系（50 μL）：2×Taq PCR Mastermix 25 μL，上游引物和下游引物各1.0 μL，ddH2O 23 μL。PCR程序：95℃預變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)30次；72℃終延伸10 min。反應結束后使用1.0%瓊脂糖凝膠進行DNA電泳分析，產(chǎn)物置于-20℃保存。

使用XhoI和BamHI核酸限制性內切酶對PCR產(chǎn)物和原核表達質粒pET-32a（+）同時進行雙酶切操作。純化酶切產(chǎn)物后，將MA-D4基因片段與pET-32a（+）質粒連接，構建原核表達載體，并轉化至E.coli DH5α中。利用氨芐西林（Amp）挑選疑似陽性菌，由深圳華大基因科技服務有限公司測序確認。將陽性菌擴大培養(yǎng)后，使用質粒抽提試劑盒提取重組質粒P-MA-D4。最終將P-MA-D4轉化至E.coli BL21（DE3）pLysS中，即為E-MA-D4。

1.5人工抗菌肽MA-D4誘導表達與獲取純化選取在氨芐西林（Amp）LB固態(tài)培養(yǎng)基上的單個陽性菌落，振蕩培養(yǎng)過夜。翌日，以1∶100體積比轉移至200 mL添加有0.1%氨芐西林（Amp）的LB液態(tài)培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，直至OD600nm值達到0.5～0.6時，按照1.0 mmol/L終濃度添加IPTG誘導EMA-D4表達。

添加IPTG 6 h后，4℃、5000 r/min離心10 min收集菌體，使用PBS清洗三次，再利用超聲波裂解菌體。因預試驗鑒定融合蛋白為可溶蛋白形式，4℃、12000 r/min離心15 min收集上清液。使用腸激酶按下述酶切體系對上清液進行酶切處理：10×Buffer 10.0 μL，ddH2O 38.0 μL，上清液50.0 μL，腸激酶2.0 μL，23℃放置20 h。

利用Thermo Scientific公司的HisPur Ni-NTA Spin Purification Kit，通過鎳離子親和層析純化獲得人工抗菌肽MA-D4。按說明書預處理樹脂柱后，加入與High-capacity nickel-IMAC resin等量的酶切處理過的上清液，置于4℃環(huán)境中結合1 h后，梯度洗脫蛋白，分段收集洗脫液，進行SDS-PAGE檢測。使用Bradford法檢測人工抗菌肽MA-D4溶液濃度（汪家政和范明，2000）。

1.6人工抗菌肽MA-D4生物活性檢測

1.6.1最小抑菌濃度和最低殺菌濃度測定通過微量稀釋法測定人工抗菌肽MA-D4對于大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）、豬鏈球菌2型（Streptococcus suis 2）和炭疽桿菌（Bacillus anthracis）的最小抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）。具體試驗步驟參照Duclohier（2006）的方法：將試驗菌株制備成106cfu/mL的菌液，分別加入96孔細胞培養(yǎng)板內，每孔90 μL。使用PBS將人工抗菌肽MA-D4溶液分別稀釋成40.0、20.0、10.0、8.0、6.0、4.0、2.0、1.0、0.5 μg/mL，并加入96孔細胞培養(yǎng)板內，每孔10 μL。設置空白對照組僅含LB液態(tài)培養(yǎng)基，條件對照組為僅含有試驗菌株的菌液，酶切對照組為添加有未經(jīng)腸激酶處理的上清液和試驗菌株的菌液。置于37℃培養(yǎng)箱中過夜，翌日測定每孔的OD600nm值?？赏耆种萍毦L的最低溶液濃度即為人工抗菌肽MA-D4針對該試驗菌株的MIC。將MIC以上的組按1∶100比例接種LB液態(tài)培養(yǎng)基，并取其中100 μL均勻涂布在LB固態(tài)培養(yǎng)基上，置于37℃培養(yǎng)箱中12 h后，進行菌落計數(shù)。固態(tài)培養(yǎng)基上少于5個菌落的最高溶液濃度即為人工抗菌肽MA-D4針對該試驗菌株的MBC。

1.6.2溶血活性測定對健康小鼠進行眼球采血，將獲得的小鼠血液與阿氏液等比例混合，2000 r/min離心5 min后棄去上清液。使用10倍體積的生理鹽水洗滌小鼠紅細胞3次后，使用生理鹽水將其稀釋成2%濃度的紅細胞懸液。將人工抗菌肽MA-D4制備成不同濃度的稀釋液，與紅細胞懸液混合，37℃孵育30 min后，2000 r/min離心5 min，測定上清液于540 nm的吸收值。使用生理鹽水作為陰性對照組，使用1%Triton X-100作為陽性對照組，按照540 nm吸收值計算人工抗菌肽MA-D4溶血率（石偉等，2015）。

2　結果

2.1人工抗菌肽MA-D4基因的多步PCR擴增分別取三次PCR的產(chǎn)物各10 μL，使用1.0%瓊脂糖凝膠進行DNA電泳分析。由圖1可見，100～250 bp間有特異性條帶，符合預期結果，即為MA-D4基因片段。

圖1　人工抗菌肽MA-D4基因的多步PCR擴增

2.2測序經(jīng)深圳華大基因科技服務有限公司測序，確認所獲得的MA-D4基因序列與試驗設計完全一致。

2.3人工抗菌肽MA-D4的獲取與純化收集上清液后，使用腸激酶酶切處理，并通過鎳離子親和層析法獲得純化的人工抗菌肽MA-D4溶液。由圖2可知，經(jīng)過純化處理后，4.6～10.0 kD處有明顯的蛋白條帶，符合試驗設計大小，即為人工抗菌肽MA-D4。通過Bradford法測定其蛋白濃度為486.75 μg/mL。

圖2　人工抗菌肽MA-D4的鎳離子親和層析純化結果

2.4人工抗菌肽MA-D4的生物活性檢測

2.4.1最小抑菌濃度和最低殺菌濃度使用微量稀釋法測定人工抗菌肽MA-D4對于大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、綠膿桿菌、豬鏈球菌2型和炭疽桿菌的MIC分別為0.5、1.0、1.0、0.5、1.0、4.0 μg/mL；MBC分別為1.0、2.0、2.0、1.0、2.0、6.0 μg/mL。未經(jīng)腸激酶處理的融合蛋白針對所有試驗菌株均不能表現(xiàn)出生物活性。

2.4.2溶血活性陰性對照組的溶血率為0%，陽性對照組的溶血率為100%，按照540 nm吸收值計算不同濃度下人工抗菌肽MA-D4的溶血率，結果見圖3。由圖3可知，當人工抗菌肽MA-D4濃度分別為5、10、20、40、80、160、320、400 μg/mL時，溶血率依次為0.78%、1.23%、1.96%、2.15%、2.97%、3.72%、6.45%、6.81%。

圖3　人工抗菌肽MA-D4的溶血活性檢測

3　討論

本試驗采用重疊區(qū)擴增基因拼接法，通過設計4條末端互補的PCR引物，分三步合成人工抗菌肽MA-D4基因。其兩端帶有的核酸限制性內切酶XhoI和BamHI識別位點為構建原核表達載體提供黏性末端；腸激酶識別位點可將人工抗菌肽MA-D4從誘導表達的融合蛋白中分離；His標簽則可使人工抗菌肽MA-D4通過鎳離子親和層析法得到純化。

絕大多數(shù)生物都具備某種程度的密碼子偏嗜性，大腸桿菌極少利用TAG等8個密碼子（鄭彬瓊，2009；李永春等，2006）。本試驗設計的引物均在采用大腸桿菌利用頻率較高的密碼子構成，以期大腸桿菌原核表達系統(tǒng)中實現(xiàn)密碼子最佳化，從而進行高水平表達。

pET-32a（+）原核表達質粒中帶有硫氧還蛋白（Trx）標簽，可促進表達高產(chǎn)量的可溶性融合蛋白，并能催化蛋白質二硫鍵還原，幫助蛋白質正確折疊（王媛媛等，2008）。因人工抗菌肽MA-D4分子量較小，僅占融合蛋白的36.15%，對其進行融合表達既能實現(xiàn)融合蛋白的可溶性表達，又能避免蛋白酶作用，提高穩(wěn)定性（Hsu等，2013；Wang等，2013）。

通過對人工抗菌肽MA-D4的體外生物活性檢測，發(fā)現(xiàn)其對以大腸桿菌為代表的革蘭氏陰性菌、以豬鏈球菌2型為代表的革蘭氏陽性菌和目前耐藥性最嚴重的金黃色葡萄球菌均具有生物活性，說明人工抗菌肽MA-D4具有廣譜抗菌活性（劉誠等，2012）。

人工抗菌肽MA-D4濃度為400 μg/mL時，溶血率僅為15.6%，推測其針對小鼠紅細胞的HC50值應遠遠超出400 μg/mL，而人工抗菌肽MA-D4發(fā)揮生物活性的濃度僅需1.0～6.0 μg/mL，由此可以認為其不表現(xiàn)溶血活性。

綜上所述，人工抗菌肽MA-D4具備較強的廣譜抗菌活性，可抑制革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌，同時不具有溶血活性。其制備方法高效，純化過程簡單，生產(chǎn)成本低廉，適用于規(guī)?；a(chǎn)。因此，人工抗菌肽MA-D4可作為一類新型抗菌藥物，在食品防腐、疾病治療等方面將具有良好的應用前景和開發(fā)潛力。

［1］李永香，李宏，王芳平.大腸桿菌同義密碼子重復序列中密碼子的使用［J］.內蒙古工業(yè)大學學報（自然科學版），2006，1：5～11.

［2］劉誠，黎滿香，盧帥，等.抗菌肽Dermadistinctin-K的原核表達及生物活性鑒定［J］.中國獸醫(yī)科學，2012，5：517～522.

［3］劉誠，黎滿香，盧帥，等.抗菌肽研究進展［J］.動物醫(yī)學進展，2011，3：94～99.

［4］石偉，李彩云，陳玉清.蜂毒肽Melittin對小鼠紅細胞溶血效應及影響機制分析［J］.南京師大學報（自然科學版），2015，2：86～92.

［5］汪家政，范明.蛋白質技術手冊［M］.2000.166～183.

［6］王媛媛，韓紅輝，杜冰，等.一種新型肝癌免疫毒素的表達、純化及初步鑒定［J］.現(xiàn)代免疫學，2008，2：110～115.

［7］謝海偉，孫蘭萍，王娣，等.抗菌肽（tachyplesinⅠ）串聯(lián)基因的構建、表達及抗菌活性［J］.高校化學工程學報，2012，4：640～647.

［8］鄭彬瓊.大腸桿菌同義密碼子偏好性概述［J］.硅谷，2009，1：3～24.

［9］Duclohier H.Bilayer lipid composition modulates the activity of dermaseptins，polycationic antimicrobial peptides［J］.Eur Biophys J，2006，35（5）：401～409.

［10］Hoffmann J A，Reichhart J M，Hetru C.Innate immunity in higher insects［J］.Curr Opin Immunol，1996，8（1）：8～13.

［11］Hsu M F，Yu T F，Chou C C，et al.Using Haloarcula marismortui bacteriorhodopsin as a fusion tag for enhancing and visible expression of integral membrane proteins in Escherichia coli［J］.PLoS One，2013，8（2）：56363.

［12］Sambrook J，Sambrook J，Green M R.Molecular cloning：a laboratory manual［M］.4th ed.ed.Cold Spring Harbor，N.Y.：Cold Spring Harbor Laboratory Press，2012：3.

［13］Wang W，Luo J，Xu L，et al.Expression of scFv-Mel-Gal4 triple fusion protein as a targeted DNA-carrier in Escherichia Coli［J］.Cell Biochem Funct，2013，31（8）：698～706.

The test was conducted to study the efficient preparation methods of artificial antibacterial peptide MA-D4 and detect its biological activity in vitro，explore the application prospect and development potential of antibacterial peptide MA-D4 as a new type of antibacterial drug.The amino acid sequence of artificial antibacterial peptide MA-D4 was designed，and the nucleotide sequence coding antibacterial peptide MA-D4 was designed by using E.coli preferred codon；MA-D4 gene was spliced by overlap extension，then the prokaryotic expression vector was constructed and transformated；after the treatment of enterokinase and Ni ion affinity chromatography，the expression product was performanced the further detection of biological activity.The results showed that artificial antibacterial peptide MA-D4 had broad-spectrum antibacterial activity，could inhibit gram-positive bacterium and gram-negative bacteria，as well as had no hemolytic activity.The results indicated that artificial antibacterial peptide MA-D4 had good application prospect and development potential in such aspects as food preservative，disease treatment.

antibacterial peptide；MA-D4；prokaryotic expression；biological activity

S816.7

A

1004-3314（2016）02-0030-04

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20160207