纖維素降解菌的分離、鑒定及其產(chǎn)酶特性研究

汪 彬，郭照輝，杜東霞

（湖南省微生物研究院，湖南 長沙 410009）

纖維素降解菌的分離、鑒定及其產(chǎn)酶特性研究

汪 彬，郭照輝，杜東霞

（湖南省微生物研究院，湖南 長沙 410009）

從纖維素富集的環(huán)境中分離到3株能以羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）為唯一碳源的纖維素降解菌，采用纖維素-剛果紅染色法進(jìn)一步篩選，獲得透明圈較大的菌株1株，命名為為B1。經(jīng)菌落、菌體形態(tài)觀察、生理生化實(shí)驗(yàn)及分子生物學(xué)鑒定，初步確定為蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus），該菌株表現(xiàn)出了較高的濾紙崩解能力和較高的纖維素酶活力。通過培養(yǎng)條件的優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)該菌株在起始pH值為5.0的培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)36 h，其纖維素酶活力可達(dá)64.22 U/m L。

纖維素；降解；分離；鑒定；蠟樣芽孢桿菌

纖維素是自然界中分布最廣泛、來源最豐富的可再生有機(jī)資源之一，隨著自然界中，不可再生資源的日益枯竭，如何高效利用這一資源成為當(dāng)前各國關(guān)注的重要課題［1-3］。利用微生物可將豐富的有機(jī)資源轉(zhuǎn)化為糖和蛋白質(zhì)，繼而成為飼料加工、食品生產(chǎn)等的原材料，從而實(shí)現(xiàn)變廢為寶［4］。在自然界的長期進(jìn)化中，可以降解纖維素的微生物有細(xì)菌、真菌、放線菌等，其中研究較多的有青霉、木霉、曲霉、纖維弧菌和纖維單胞菌等［5］。利用這些微生物生產(chǎn)的纖維素酶已經(jīng)廣泛應(yīng)用到食品制造［6］、飼料加工［7］和酒精發(fā)酵［8］等領(lǐng)域，但普遍存在纖維素酶活力低、成本高等問題，制約著纖維素資源利用的進(jìn)一步發(fā)展［9］。因此，從自然界中進(jìn)一步開發(fā)纖維素酶高產(chǎn)菌種并加強(qiáng)菌株選育等基礎(chǔ)研究，是纖維素資源能否高效利用的關(guān)鍵所在。研究從高溫堆肥中分離纖維素分解菌，并對其酶學(xué)特性進(jìn)行了研究，為纖維素酶制劑的開發(fā)提供菌株資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為富含纖維素的土壤樣品（采集自寧鄉(xiāng)縣回龍埔鎮(zhèn)）以及畜禽糞便、作物秸稈的堆肥樣品（湖南泰谷生物科技股份有限公司）。

供試培養(yǎng)基：初篩分離平板培養(yǎng)基（羧甲基纖維素鈉20 g/L、MgSO40 .5 g/L、K2HPO41.0 g/L、NaCl 0.5 g/L、瓊脂20 g/L，pH值自然），復(fù)篩培養(yǎng)基（羧甲基纖維素鈉20 g/L、（NH4）2SO42.0 g/L、KH2PO40.5 g/ L、K2HPO42.0 g/L、MgSO4·7H2O 0.1 g/L、NaCl 6.0 g/L、CaCl20.1 g/L、瓊脂20 g/L，pH值7.0～7.5），液體培養(yǎng)基（羧甲基纖維素鈉 10 g/L、硫酸銨 4 g/L、磷酸氫二鉀2 g/L、七水硫酸鎂 0.1 g/L、酵母膏10 g/L、蛋白胨1 g/L，pH值自然），濾紙崩解液體培養(yǎng)基（硫酸銨4 g/L、磷酸氫二鉀 2 g/L、七水硫酸鎂 0.1 g/L、蛋白胨1 g/L、酵母膏10 g，pH值自然）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的分離與篩選 （1）處理樣品。稱取樣品10 g，加入90 mL帶玻璃珠的無菌水中，振蕩30 m in，放置10 min后，將上清液梯度稀釋，并涂布在初篩固體培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)3～5 d。（2）純化菌株。挑選生長狀態(tài)較好的菌株并在復(fù)篩培養(yǎng)基上劃線分離純化。（3）剛果紅染色篩選。將生長狀態(tài)好、純化后的株菌分別點(diǎn)接在復(fù)篩培養(yǎng)基平板上，30℃培養(yǎng)3～5 d，將培養(yǎng)好的平板用4 g/L的剛果紅染色5 m in，沖洗傾去染液，再用0.9% NaCl脫色5 m in，產(chǎn)生纖維素酶的菌落周圍將出現(xiàn)明顯的透明圈，測其透明圈大小，選取透明圈較大的菌落進(jìn)行復(fù)篩。

1.2.2 復(fù)篩培養(yǎng)及酶活力初測 將初篩水解圈比較大的菌株點(diǎn)接到復(fù)篩培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)3～5 d；用4 g/L的剛果紅染色5 min，再用0.9 % NaCl 沖洗，測水解圈直徑，計(jì)算酶的相對比活力：A= d/t，式中A為相對活性、d為透明圈直徑、t為培養(yǎng)天數(shù)。

1.2.3 菌株的鑒定 （1）形態(tài)學(xué)觀察。在LB培養(yǎng)基上觀察菌落形態(tài)，在光學(xué)顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。（2）生理生化實(shí)驗(yàn)。V-P 試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、酪蛋白酶實(shí)驗(yàn)、糖類的氧化發(fā)酵試驗(yàn)（包括葡萄糖、麥芽糖、果糖和阿拉伯糖等）、卵磷脂酶實(shí)驗(yàn)、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)的具體方法均參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》（第9版）。（3）16S rDN A的序列分析。利用基因組提取試劑盒提取菌株B1的基因組DNA，并以此為模板，采用細(xì)菌16S rDNA通用引物（27F和1492R）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行序列測定。所得序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的已知序列進(jìn)行比對分析，選擇同源性較高的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 纖維素酶活力測定 取離心后的發(fā)酵液1 m L與同體積 0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液混合，50 ℃恒溫水浴30 min，迅速加入2.5 m L的DNS試劑，煮沸5 min終止反應(yīng)，并在 540 nm波長下比色。在上述條件下1 mL 粗酶液所產(chǎn)生的1 μg 葡萄糖定義為 1個(gè)酶活力單位，以U/mL表示。

1.2.5 濾紙崩解情況測定 將B1菌株接種于以濾紙為唯一碳源的液體培養(yǎng)基中，37℃下200 r/m in振蕩培養(yǎng)3～12 d，觀察記錄濾紙崩解情況。

1.2.6 纖維素分解菌B1的產(chǎn)酶條件研究 （1）培養(yǎng)時(shí)間對B1菌株酶活力的影響。在500 m L的三角瓶中，裝入100 mL的液體培養(yǎng)基，接種B1菌株，37℃下200 r/min搖振培養(yǎng)，分別于12、24、36、48、60、72 h取樣測定纖維素酶活力。（2）培養(yǎng)溫度對B1菌株酶活力的影響。在500 m L的三角瓶中，裝入100 mL液體培養(yǎng)基，接種B1菌株，分別在25、30、35、37、40、45℃條件下，以200 r/min的轉(zhuǎn)速搖振培養(yǎng)36 h，取樣測定纖維素酶活力。（3）培養(yǎng)基pH值對B1菌株酶活力的影響。在容積為500 mL的三角瓶中，分別裝入100 mL起始pH值分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5的液體培養(yǎng)基，接種B1菌株，37℃下200 r/m in搖振培養(yǎng)36 h，取樣測定纖維素酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素分解菌的篩選

經(jīng)CMC平板初篩和剛果紅染色、NaCl 脫色后得到有清晰透明圈的菌株3株（B1～B3，其中B1來自堆肥樣品，B2和B3來自土壤樣品），將透明圈較大的菌株B1點(diǎn)接到復(fù)篩平板培養(yǎng)基上，纖維素水解圈見圖 1。培養(yǎng)3 d測得B1菌株纖維素水解圈直徑最大為18 mm。纖維素酶的相對比活力A= d/t=18/3=6。

圖1 菌株B1的纖維素水解圈

2.2 纖維素分解菌的鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)觀察 菌株B1在LB平板上培養(yǎng)，菌落呈白色，表面粗糙不透明，邊緣呈擴(kuò)展?fàn)睢＞w鏡檢結(jié)果為長桿狀，可形成芽孢，為革蘭氏陽性菌。

2.2.2 生理生化實(shí)驗(yàn) 生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果：V-P實(shí)驗(yàn)、甲基紅實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)、酪蛋白酶、卵磷脂酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為陽性；檸檬酸鹽實(shí)驗(yàn)為陰性；可利用葡萄糖、麥芽糖、果糖及阿拉伯糖等碳源。

2.2.3 16S rDNA PCR擴(kuò)增、序列測定和系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建 將測序結(jié)果與GenBank中其他基因序列通過BLAST軟件進(jìn)行比較分析，結(jié)果表明，該菌株與蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）有較高的同源性。從GenBank中任意選取芽胞桿菌屬7個(gè)菌株的16S rDNA序列與蠟樣芽孢桿菌B1的序列一起構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖2所示。B1菌株與蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）同為一簇，兩者的16S rDNA核苷酸同源率為99%。

圖2 細(xì)菌B1的 16S rDNA 序列系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 B1菌株的纖維素酶活分析

蠟樣芽孢桿菌B1以合適的接種量接種到以羧基纖維素鈉為唯一碳源的液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)36 h，測定菌株的纖維素酶活力，該菌株的纖維素酶活力為60. 21 U/m L。

2.4 濾紙崩解結(jié)果分析

蠟樣芽孢桿菌B1以合適的接種量接種到以濾紙為唯一碳源的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3 d后濾紙開始變軟，其表面可看到少許絮狀物；第5天，可見部分濾紙出現(xiàn)崩解，溶液開始變渾濁，絮狀物開始增多；培養(yǎng)至12 d后，濾紙全部崩解。

2.5 纖維素酶蠟樣芽孢桿菌B1的產(chǎn)酶條件

2.5.1 培養(yǎng)時(shí)間對蠟樣芽孢桿菌B1酶活力的影晌

從圖3中可以看出，該菌株的酶活在培養(yǎng)36 h時(shí)達(dá)到最大值；培養(yǎng)36～60 h之間，酶活力有輕微下降，但基本處于穩(wěn)定；培養(yǎng)60 h之后，酶活力迅速下降。

圖3 培養(yǎng)時(shí)間對菌株B1酶活力的影響

2.5.2 培養(yǎng)溫度對蠟樣芽孢桿菌B1酶活力的影響

由圖4可知，在25～37℃范圍內(nèi)，菌株的酶活力逐漸升高，至37℃達(dá)到最大值，而培養(yǎng)溫度超過37℃時(shí)，酶活力有所降低。

圖4 培養(yǎng)溫度對菌株B1酶活力的影響

2.5.3 培養(yǎng)基起始pH值對蠟樣芽孢桿菌B1產(chǎn)酶的影響 由圖5可知，當(dāng)pH值在4.0～4.5范圍內(nèi)時(shí)，酶活力隨pH值增加迅速升高，至pH值5.0時(shí)達(dá)到最大值；當(dāng)pH值為5.0～6.5之間時(shí)，酶活力基本穩(wěn)定；pH值超過6.5時(shí)，酶活力開始逐漸降低。

3 結(jié)論與討論

圖5 培養(yǎng)基起始pH值對菌株B1酶活力的影響

近年來，有關(guān)纖維素分解菌的研究越來越受到關(guān)注，從土壤、堆肥、海洋等不同環(huán)境中分離纖維素分解菌均有報(bào)道。這些菌株所產(chǎn)生的纖維素酶是許多生物化學(xué)過程的重要原料。筆者從富集纖維素的環(huán)境中篩選分離獲得一株纖維素降解菌，該菌株經(jīng)菌落、菌體形態(tài)觀察、生理生化實(shí)驗(yàn)及分子生物學(xué)鑒定，初步確定為蠟樣芽胞桿菌，該菌株表現(xiàn)出了較高的濾紙崩解能力和較高的纖維素酶活力。通過培養(yǎng)條件的優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)該菌株在起始pH值為5.0的培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)36 h，其纖維素酶活力可達(dá)最大。另外，該菌株分離自纖維素富集的環(huán)境中，屬芽孢桿菌屬細(xì)菌，對于構(gòu)建高產(chǎn)纖維素酶的工程菌株并探索其作用機(jī)制具有一定的理論及實(shí)踐意義。

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（責(zé)任編輯：成 平）

Research on Isolation， Identification and Enzyme Production Characterization of Cellu lose Degrading Bacteria

WANG Bin，GUO Zhao-hui，DU Dong-xia
（Hunan Academy of m icrobiology， Changsha 410009， PRC）

Three cellulose degrading bacteria， which can be isolated from cellulose enriched environments， were isolated with carboxymethylcellulose sodium （CMC-Na） as sole carbon source， CMC-Congo red staining method was used to further screen， and one strain with larger transparent circle was obtained， named as B1. Through the identif cation of bacterial colony， cell morphology observation，physiology and biochem istry experiment， and molecular biology， initially identifed as Bacillus cereus， the strain show ed a high ability of disintegration of flter paper and higher cellulase activity. Through the optimization of culture conditions， it was found that the strain was in the culture medium with the initial pH value of 5.0， temperature 37℃ and after 36 hours， the cellulase activity could reach 64.22 U/m L.

cellulose； degradation； isolation； identif cation； Bacillus cereus

Q93-331

A

1006-060X（2016）09-0007-03

10.16498/j.cnki.hnnykx.2016.09.003

2016-07-14

湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（13JJ2035）；湖南省“一化四體系”專項(xiàng)資金 （湘財(cái)農(nóng)指［2014］153號）

汪 彬（1982-），女，湖南長沙市人，助理研究員，主要研究方向農(nóng)牧廢棄物資源化利用等方面的研究。

杜東霞