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      內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活劑通過(guò)上調(diào)GRP78增加肺癌A549細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性

      2016-10-25 04:55:33石少敏趙建軍趙鳳芹
      中國(guó)老年學(xué)雜志 2016年16期
      關(guān)鍵詞:內(nèi)質(zhì)網(wǎng)敏感性生存率

      石少敏 趙建軍 趙鳳芹 王 靜

      (吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院呼吸內(nèi)科,吉林 長(zhǎng)春 130033)

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      內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活劑通過(guò)上調(diào)GRP78增加肺癌A549細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性

      石少敏趙建軍趙鳳芹王靜

      (吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院呼吸內(nèi)科,吉林長(zhǎng)春130033)

      目的探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活劑(TM)增加肺癌A549細(xì)胞對(duì)順鉑(DDP)敏感性的機(jī)制。方法DDP和TM處理肺癌A549細(xì)胞,MTT法檢測(cè)肺癌A549細(xì)胞存活率,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平,Western印跡檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Cleaved Caspase-7表達(dá)。結(jié)果不同濃度的DDP(0,10,20,50 μmol/L)作用于肺癌A549細(xì)胞24 h,細(xì)胞存活率以劑量依賴的方式下降;TM誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后,提高了DDP(20 μmol/L)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率(55.23%±2.31%,P<0.05);同時(shí)檢測(cè)到凋亡相關(guān)蛋白Caspase-7表達(dá)增加。結(jié)論DDP能夠誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞凋亡,但是TM通過(guò)上調(diào)GRP78增加了肺癌A549細(xì)胞對(duì)DDP敏感性,聯(lián)合應(yīng)用TM和DDP有望成為治療肺癌的新策略。

      內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激;順鉑;凋亡;肺癌

      順鉑(DDP)通過(guò)損傷細(xì)胞的DNA而發(fā)揮抗腫瘤作用〔1〕,可用于治療卵巢癌、頭頸部的腫瘤和肺癌等〔2〕,其治療腫瘤的主要障礙是藥物耐受〔3〕。新近報(bào)道,線粒體通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與了DDP誘導(dǎo)的癌癥細(xì)胞的凋亡〔4〕。同時(shí),有研究顯示,在人黑色素瘤和結(jié)腸癌細(xì)胞中,DDP通過(guò)影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的鈣穩(wěn)態(tài)而誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,進(jìn)而導(dǎo)致癌癥細(xì)胞凋亡〔5〕。當(dāng)缺氧、DNA損傷、細(xì)胞內(nèi)的鈣紊亂時(shí),誘導(dǎo)癌癥細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。葡萄糖相關(guān)蛋白(GRP78)是細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白,當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時(shí)表達(dá)上調(diào),并進(jìn)一步活化內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上橫跨膜蛋白質(zhì)傳感器ATF6、IRE1、PERK〔6〕。有研究報(bào)道,在肺癌A549細(xì)胞中,GRP78上調(diào)能夠增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)DDP的敏感性〔7〕。本研究旨在觀察DDP作用于肺癌A549細(xì)胞前后細(xì)胞凋亡的變化,以及聯(lián)合內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活劑TM對(duì)細(xì)胞凋亡產(chǎn)生的影響,并初步探討其相關(guān)機(jī)制。

      1 材料與方法

      1.1細(xì)胞培養(yǎng)將人肺癌A549細(xì)胞用含10%胎牛血清、雙抗(100 U/ml青霉素及0.1 mg/ml鏈霉素)的RPMI-1640培養(yǎng)液(Gibco公司),在37℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

      1.2實(shí)驗(yàn)方法

      1.2.1MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期肺癌細(xì)胞接種至96孔板,待細(xì)胞完全貼壁,加入既定濃度的DDP和(或)TM,每孔200 μl的終體積液體,每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔,藥物干預(yù)作用24 h后,每孔加入20 μl噻唑藍(lán)(MTT)溶液(5 g/L),將細(xì)胞在培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4~6 h。棄去培養(yǎng)基,加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)于每孔內(nèi),振蕩搖勻后,用酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔的吸光度值,計(jì)算細(xì)胞的生存率。

      1.2.2流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的肺癌A549細(xì)胞,將細(xì)胞接種于6孔板,培養(yǎng)24 h后,換液并按既定濃度的DDP和(或)TM處理細(xì)胞,藥物干預(yù)24 h后收集懸浮,并用胰酶消化貼壁細(xì)胞,加入400 μl結(jié)合緩沖液使細(xì)胞重懸,之后加入AnnexinV和PI溶液,于室溫條件下避光孵育15 min;通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率,每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

      1.2.3Western印跡檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的肺癌A549細(xì)胞,接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶,細(xì)胞貼壁后分別加入既定濃度的DDP和(或)TM處理細(xì)胞,藥物干預(yù)24 h后,收集貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞,提取細(xì)胞蛋白,采用二喹啉甲酸(BCA)方法將蛋白進(jìn)行定量。并使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)膠(200 V,45 min)進(jìn)行電泳,之后用100 V轉(zhuǎn)膜1 h,將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,同時(shí)含15%脫脂牛奶的磷酸鹽緩沖液(PBS)封閉2 h,用PBS洗滌3次,之后加入相應(yīng)一抗,經(jīng)4℃孵育過(guò)夜后,用PBS洗滌3次15 min、5 min、5 min后,加入辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗孵育2 h(Caspase-7抗體稀釋比例1∶100、β-actin抗體稀釋比例1∶1 000、二抗稀釋比例1∶1 000),之后再用PBS洗滌3次,使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)進(jìn)行顯影,之后再用凝膠成像系統(tǒng)分析條帶的灰度值。

      1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0軟件行t檢驗(yàn)。

      2 結(jié) 果

      2.1不同濃度的DDP對(duì)肺癌A549細(xì)胞活力及凋亡的影響0,10,20,50 μmol/L的DDP干預(yù)24 h后,MTT結(jié)果顯示,隨著藥物濃度的增加,其對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用逐漸增加,細(xì)胞存活率分別為(1±0.066)、(0.74±0.11)、(0.52±0.054)、(0.32±0.021);并且隨著藥物濃度的逐漸增加,A549細(xì)胞逐漸皺縮,而且脫離貼壁的現(xiàn)象明顯增加。10,20,50 μmol/L的DDP作用A549細(xì)胞24 h后,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)A549細(xì)胞凋亡分別為(2.14±0.68)%,(8.67±0.69)%,(13.16±1.11)%,(19.22±1.65)%。

      2.2DDP誘導(dǎo)的肺癌A549細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平0,10,20,50 μmol/L的DDP作用A549細(xì)胞24 h后,凋亡相關(guān)蛋白Cleaved Caspase-7的表達(dá)水平隨著藥物濃度增加而上調(diào),分別為0.04±0.023,0.73±0.28,1.33±0.079,1.67±0.121,尤其DDP濃度在20,50 μmol/L時(shí),與對(duì)照組相比,Cleaved Caspase-7的表達(dá)水平增加更明顯。見(jiàn)圖1。

      2.3TM對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78表達(dá)水平的影響0,1,2,4 μg/ml TM作用A549細(xì)胞24 h后,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78的表達(dá)水平逐漸增加,分別為0.23±0.058、0.49±0.11、0.62±0.062、0.79±0.077,與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

      2.4TM聯(lián)合DDP對(duì)肺癌A549細(xì)胞存活率的影響1 μg/ml TM聯(lián)合20 μmol/L DDP處理A549細(xì)胞24 h后,與對(duì)照組(1±0.18)相比,單加1 μg/ml TM組細(xì)胞生存率(0.95±0.075)無(wú)明顯差異。DDP組(0.55±0.068)和二者聯(lián)合組(0.24±0.03)的細(xì)胞存活率均明顯降低,尤其二者聯(lián)合組的細(xì)胞生存率明顯低于單加DDP組(P<0.05),提示TM促進(jìn)了順鉑對(duì)A549細(xì)胞生存率的影響。

      2.5TM促進(jìn)DDP誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞凋亡TM聯(lián)合DDP處理肺癌A549細(xì)胞24 h后,流式結(jié)果顯示,與對(duì)照組〔(2.6±0.062)%〕相比,單加1 μg/ml TM組肺癌A549細(xì)胞凋亡率〔(3.3±0.17)%〕無(wú)明顯差異(P>0.05);而20 μmol/L DDP組〔(10.21±0.32)%〕和二者聯(lián)合組〔(18.69±1.12)%〕的細(xì)胞凋亡率均明顯增加,尤其在二者聯(lián)合組細(xì)胞凋亡率增加更明顯(P<0.05),提示TM促進(jìn)了DDP誘導(dǎo)的肺癌A549細(xì)胞凋亡率的增加。

      2.6TM影響DDP誘導(dǎo)的肺癌A549細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)TM聯(lián)合DDP處理肺癌A549細(xì)胞24 h后,與對(duì)照組(0.03±0.02)相比,單加TM細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Caspase-7的表達(dá)(0.043±0.031)無(wú)明顯的變化(P>0.05);與單加DDP組(0.32±0.06)比較,二者聯(lián)合組Caspase-7表達(dá)(0.71±0.054)明顯升高(P<0.05),見(jiàn)圖3。

      圖1 DDP誘導(dǎo)的肺癌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平

      圖2 TM對(duì)肺癌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)水平

      圖3 聯(lián)合應(yīng)用對(duì)A549細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

      3 討 論

      目前研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在化療藥物誘導(dǎo)的肺癌凋亡中起到了重要的作用〔8〕。在以前的研究中,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激被認(rèn)為是一種生物學(xué)的級(jí)聯(lián)反應(yīng),能夠有效誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;事實(shí)上,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是對(duì)許多刺激因素如生物化學(xué)、病理及生理?xiàng)l件下的刺激產(chǎn)生的一種細(xì)胞反應(yīng),能夠促發(fā)各種細(xì)胞功能紊亂包括錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的聚集和Ca2+穩(wěn)態(tài)的改變〔9〕。并且在過(guò)度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡性的細(xì)胞死亡之間的關(guān)系已經(jīng)在巨噬細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞,以及癌癥細(xì)胞都已得到了證實(shí)〔10〕。在本研究中,也發(fā)現(xiàn)TM增強(qiáng)了肺癌細(xì)胞對(duì)DDP的敏感性。GRPs是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶,普遍存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中,能夠輔助蛋白質(zhì)的折疊〔11〕。GRP78(也被成為Bip)是典型的GRPs家族成員,是和細(xì)胞質(zhì)中的熱休克蛋白(HSP)70和90同源,并且一般被大家認(rèn)為是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的分子標(biāo)志〔12〕。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時(shí),GRP78表達(dá)水平明顯上調(diào)。在本研究中也顯示,在肺癌A549細(xì)胞中,TM能夠劑量依賴性上調(diào)GRP78的表達(dá),并且,當(dāng)TM和DDP聯(lián)合應(yīng)用時(shí),能夠有效抑制肺癌A549細(xì)胞的生存率,同時(shí)明顯增加肺癌A549細(xì)胞的凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白Caspase-7的表達(dá)。

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      〔2015-12-11修回〕

      (編輯袁左鳴)

      王靜(1976-),女,副主任醫(yī)師,主要從事慢性阻塞性肺疾病研究。

      石少敏(1981-),女,主治醫(yī)師,主要從事肺癌診治的基礎(chǔ)研究。

      R453

      A

      1005-9202(2016)16-3925-02;doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2016.16.025

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