鴉膽子苦醇抑制人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞轉(zhuǎn)移的機(jī)制

陳　果　李　蔚　李小惠

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 四川省人民醫(yī)院，四川　成都　610072)

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鴉膽子苦醇抑制人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞轉(zhuǎn)移的機(jī)制

陳果李蔚李小惠

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 四川省人民醫(yī)院，四川成都610072)

目的探討鴉膽子苦醇對(duì)人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的抑制作用及其機(jī)制。方法采用Reed-Muench法計(jì)算鴉膽子苦醇對(duì)A549細(xì)胞的半數(shù)致死濃度(LC50)；通過(guò)CCK-8測(cè)定細(xì)胞活力繪制增殖曲線和流式細(xì)胞周期測(cè)定鴉膽子苦醇對(duì)A549細(xì)胞增殖能力的影響；采用Transwell法檢測(cè)鴉膽子苦醇對(duì)A549細(xì)胞株轉(zhuǎn)移的抑制情況，以及在半數(shù)致死濃度的鴉膽子苦醇濃度下不同時(shí)間對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)移的抑制率；應(yīng)用Western印跡法檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的增殖能力在鴉膽子苦醇處理后基本沒(méi)有變化；鴉膽子苦醇處理后A549細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力與對(duì)照組相比明顯下降，且在一定作用時(shí)間范圍內(nèi)有時(shí)間依賴(lài)性；腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白(BRF)2、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-2(IGFBP-2)、CD151的表達(dá)水平在鴉膽子苦醇處理后的細(xì)胞中明顯下調(diào)。結(jié)論鴉膽子苦醇是潛在的抗非小細(xì)胞肺癌的藥物，有必要進(jìn)一步闡明其抗非小細(xì)胞肺癌的分子機(jī)制，為臨床治療提供一定的指導(dǎo)意義。

鴉膽子苦醇；非小細(xì)胞肺癌；A549細(xì)胞；轉(zhuǎn)移

隨著當(dāng)今分子生物學(xué)技術(shù)和臨床治療水平的快速發(fā)展，非小細(xì)胞肺癌的臨床治療手段特別是新型的分子藥物靶向治療有了較明顯的進(jìn)步，但是肺癌的易轉(zhuǎn)移性仍然是治療的主要難題〔1，2〕。鴉膽子苦醇(Brusatol)是一種苦木內(nèi)酯類(lèi)化合物，從鴉膽子中提取獲得。鴉膽子性苦寒，具有殺蟲(chóng)止痢和抗瘧、抗腫瘤等功效〔3〕。目前關(guān)于鴉膽子苦醇抗白血病、抗胰腺癌和前列腺癌中的重要作用均有報(bào)道，但未見(jiàn)有其對(duì)肺癌轉(zhuǎn)移能力抑制的研究〔4〕。本文初步探討鴉膽子苦醇對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞轉(zhuǎn)移的抑制能力及其相應(yīng)的分子機(jī)制。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)藥物鴉膽子苦醇，購(gòu)自成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司。

1.2試劑非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞，購(gòu)自中科院上海細(xì)胞所。膽囊收縮素八肽(CCK-8)，購(gòu)自上海易色醫(yī)療科技有限公司；24孔，孔徑8.0 μm，Transwell板，購(gòu)自北京樂(lè)博生物科技有限公司；1640培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；0.25%胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白2(BRF2)、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-2(IGFBP-2)、CD151、β-actin單克隆抗體購(gòu)自Proteintech公司；辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的羊抗兔、羊抗鼠抗體購(gòu)自北京中杉金橋。

1.3儀器倒置相差顯微鏡：德國(guó)Leica 公司；二氧化碳孵箱：美國(guó)Thermo Fisher 公司；垂直電泳系統(tǒng)、蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)：北京六一；無(wú)菌操作臺(tái)：蘇凈集團(tuán)安泰公司；凝膠成像系統(tǒng)：美國(guó)Bio-Rad公司。

1.4方法

1.4.1細(xì)胞培養(yǎng)A549細(xì)胞用5 ml含10%胎牛血清(FBS)的1640培養(yǎng)基于含37℃、飽和濕度、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞呈單層貼壁生長(zhǎng)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)取狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行。

1.4.2半數(shù)致死濃度計(jì)算將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)期細(xì)胞按2 000個(gè)/孔的細(xì)胞量接種于96孔板中，鴉膽子苦醇用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋?zhuān)?.01～10 μmol/L十倍稀釋設(shè)置濃度梯度，每孔加100 μl。于培養(yǎng)箱中孵育，2 d后觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，細(xì)胞發(fā)生壞死標(biāo)記為陽(yáng)性，細(xì)胞未有壞死標(biāo)記為陰性。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，用Reed-Muench算法進(jìn)行計(jì)算。

1.4.3細(xì)胞增殖能力測(cè)定A549細(xì)胞經(jīng)半數(shù)細(xì)胞致死濃度的鴉膽子苦醇處理6 h和12 h后胰酶消化，按每孔2 000個(gè)細(xì)胞的量接種于96孔板中，用CCK-8法分別測(cè)定0、1、2、3、4、5 d的吸光值，數(shù)據(jù)繪制成曲線圖。半數(shù)細(xì)胞致死濃度的鴉膽子苦醇處理A549細(xì)胞6 h和12 h后胰酶消化，按每組樣品2×106的量收集細(xì)胞于EP管中，75%乙醇固定過(guò)夜，用含100 μg/ml RNA酶、30 μg/ml PI和2‰的TritonX-100染液染色，細(xì)胞流式儀分析，用ModFit處理數(shù)據(jù)。

1.4.4細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的測(cè)定A549細(xì)胞經(jīng)半數(shù)細(xì)胞致死濃度的鴉膽子苦醇分別處理2、6、12、24、48 h后用胰酶消化收集細(xì)胞，每個(gè)樣品孔200 μl，無(wú)血清1640培養(yǎng)基重懸5×104個(gè)細(xì)胞于Transwell上室中，下室采用含20%FBS的1640培養(yǎng)基900 μl，恒溫培養(yǎng)箱中孵育24 h，用棉簽擦去上室殘留細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗，甲醇中固定30 min，室溫吹干，用結(jié)晶紫染色1 min，PBS清洗，將上室薄膜用小刀切下，于載玻片上，固定，封片，觀察計(jì)數(shù)。

1.4.5Western印跡檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達(dá)上步驟中同批次細(xì)胞，經(jīng)PBS清洗后，加入RIPA細(xì)胞裂解液，冰上裂解細(xì)胞30 min，12 000 r/min離心10 min，用考馬斯亮藍(lán)染色法進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度測(cè)定。同樣量的蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳進(jìn)行蛋白分離，蛋白電泳完成后通過(guò)蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)將PAGE膠上的蛋白轉(zhuǎn)印到適當(dāng)大小的硝酸纖維素膜上，用5%的脫脂奶粉進(jìn)行封閉，按1∶1 000的稀釋倍數(shù)配置抗體，4℃孵育過(guò)夜，第2天取出后洗去殘余的一抗，按1∶5 000的稀釋倍數(shù)配置二抗，室溫孵育2 h后洗去殘余的二抗，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯色，對(duì)比轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達(dá)變化。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SSPS17.0和Graphpad prism 5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。

2　結(jié)　果

2.1梯度濃度鴉膽子苦醇處理A549細(xì)胞觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，采用Reed-Muench算法計(jì)算得出半數(shù)致死濃度為(0.70 ± 0.06)μmol/L。0.01μmol/L濃度的鴉膽子苦醇處理A549細(xì)胞后細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，10 μmol/L濃度的鴉膽子苦醇處理A549細(xì)胞后細(xì)胞多數(shù)發(fā)生壞死。見(jiàn)圖1。

2.2CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果半數(shù)致死濃度的鴉膽子苦醇處理A549細(xì)胞6 h和12 h后，與未處理前相比其增殖能力沒(méi)有明顯變化；細(xì)胞流式周期分析結(jié)果顯示，半數(shù)致死濃度的鴉膽子苦醇處理A549細(xì)胞6 h和12 h后與未處理前相比其細(xì)胞周期變化不明顯。見(jiàn)圖2，圖3。

2.3Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果0.70 μmol/L的鴉膽子苦醇處理A549細(xì)胞6 h后，A549細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力略有下降；處理12 h后，細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力明顯下降。見(jiàn)圖4。

圖1　A549細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)(×200)

圖2　A549細(xì)胞增殖曲線圖

A：對(duì)照組；B：鴉膽子苦醇處理處理6 h；C：鴉膽子苦醇處理處理12 h；下圖同圖3　A549細(xì)胞周期

圖4　0.70 μmol/L的鴉膽子苦醇處理A549細(xì)胞不同時(shí)間細(xì)胞遷移能力(×200)

2.4Western印跡檢測(cè)結(jié)果細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白BRF2、IGFBP-2、CD151的表達(dá)水平均有不同程度的下調(diào)。與細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力相應(yīng)，在鴉膽子苦醇處理6 h后蛋白表達(dá)量開(kāi)始下降，在12 h后蛋白表達(dá)明顯下調(diào)。見(jiàn)圖5。

圖5　鴉膽子苦醇處理A549細(xì)胞不同時(shí)間段細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的表達(dá)

3　討　論

目前發(fā)現(xiàn)，天然抗腫瘤藥物通過(guò)不同的作用方式抑制腫瘤生長(zhǎng)，如抑制腫瘤細(xì)胞的增殖；或者通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的分化而使腫瘤細(xì)胞失去干性；誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡以及抑制腫瘤細(xì)胞的黏附能力從而抑制腫瘤的遷移、侵襲和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移等。本研究發(fā)現(xiàn)，鴉膽子苦醇能夠抑制非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的遷移能力，而且在一定范圍內(nèi)藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移能力抑制的效果具有時(shí)間和劑量依賴(lài)性。半數(shù)致死濃度(0.70 μmol/L)的鴉膽子苦醇處理A549細(xì)胞后其遷移能力發(fā)生明顯下降，進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)鴉膽子苦醇可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)遷移相關(guān)蛋白的表達(dá)而影響細(xì)胞的遷移。

在腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中腫瘤微血管網(wǎng)絡(luò)的形成對(duì)轉(zhuǎn)移的進(jìn)程起著非常關(guān)鍵的作用。腫瘤中微血管網(wǎng)絡(luò)的存在不僅能夠?yàn)槟[瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)提供豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而且能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，為腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移提供必要的通道〔5〕。肺癌組織內(nèi)的微血管極為豐富，造成其更易發(fā)生侵襲與轉(zhuǎn)移，這也是目前肺癌治療困難的主要原因之一。因此，研究肺癌腫瘤組織中微血管網(wǎng)絡(luò)的形成機(jī)制，并針對(duì)其相應(yīng)的機(jī)制采取有效的干預(yù)措施，能夠抑制肺癌中微血管網(wǎng)絡(luò)的形成，進(jìn)而降低肺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，從而在一定程度上降低肺癌的死亡率。

本研究發(fā)現(xiàn)鴉膽子苦醇能夠下調(diào)細(xì)胞中IGFBP-2的表達(dá)。IGFBP-2是屬于胰島素樣生長(zhǎng)因子家族的蛋白成員之一，能通過(guò)與胰島素生長(zhǎng)因子(IGF)相互作用而發(fā)揮其生物學(xué)功能〔6〕。已有研究證實(shí)非小細(xì)胞肺癌組織中IGFBP-2的表達(dá)有明顯的上調(diào)，而且其與非小細(xì)胞肺癌腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)〔7〕。BRF2主要參與RNA聚合酶Ⅲ催化的miRNA的產(chǎn)生。BRF2基因與miRNA的相互關(guān)系決定了其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中所起的重要作用〔8〕。研究表明BRF2基因在肺鱗癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演著重要的角色，與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移等過(guò)程存在密切的關(guān)系〔9〕。CD151是四跨膜蛋白(TM4SF)家族的成員之一〔10〕，主要參與調(diào)控信號(hào)傳導(dǎo)，細(xì)胞的激活、發(fā)展、增殖和運(yùn)動(dòng)、腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)功能〔11，12〕。臨床研究表明，CD151蛋白在多種人類(lèi)常見(jiàn)的惡性腫瘤中表達(dá)水平均有一定上調(diào)，且與這些腫瘤的預(yù)后關(guān)系緊密〔13〕。這與本研究發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞中CD151蛋白的表達(dá)也受鴉膽子苦醇的影響相符合。

綜上所述，鴉膽子苦醇通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的表達(dá)而對(duì)非小細(xì)胞肺癌的轉(zhuǎn)移能力有明顯的抑制作用。鴉膽子苦醇可以作為潛在的治療非小細(xì)胞肺癌的中成藥物，為肺癌的臨床治療提供一定的指導(dǎo)意義。

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〔2015-10-12修回〕

(編輯袁左鳴)

The inhibitory effects of brusatol on the migration of human non-small cell lung carcinoma A549 cells and its molecular mechanism

CHEN Guo,LI Wei,LI Xiao-Hui.

Sichuan Provincial People's Hospital,Chengdu 610072,Sichuan,China

ObjectiveTo explore the inhibitory effects of brusatol on the migration of human non-small cell lung carcinoma A549 cells and its molecular mechanism.MethodsReed-Muench method was used to calculate the lethal concentration of 50%(LC50) of brusatol on A549 cell.Transwell method was used to detect the inhibitory effect of A549 cell lines migration after deal with brusatol,and different inhibition rate of migration with different concentration of brusatol.Western blot was used to detect the expression of cell metastasis associated proteins.ResultsThe migration of A549 cell was down-regulated compared with that of control group after dispose with brusatol.Cell metastasis associated proteins BRF2,IGFBP-2 and CD151 were obviously reduced expressions in cell after dispose with brusatol.ConclusionsHrusatol is a potential anticancer drug against the non-small cell lung carcinoma,the further molecular mechanism should be revealed to provide significance guiding for clinical treatment.

Brusatol;Non-small cell lung carcinoma;A549 cell;Migration

國(guó)家“973”計(jì)劃項(xiàng)目(No.2011CB708133)；四川省科技廳項(xiàng)目(No.2015SZ0042)

李蔚(1966-)，女，主任醫(yī)師，主要從事肺癌、COPD等疾病的治療及機(jī)制研究。

陳果(1981-)，女，碩士，主要從事非小細(xì)胞肺癌的治療及其相關(guān)機(jī)制研究。

R736

A

1005-9202(2016)16-3897-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.16.012