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      豐富康復(fù)訓(xùn)練對(duì)腦出血大鼠Slit2表達(dá)的影響

      2016-10-25 04:58:19王風(fēng)波唐明薇王瓊芬
      中國(guó)老年學(xué)雜志 2016年16期
      關(guān)鍵詞:腦損傷海馬腦組織

      王風(fēng)波 唐明薇 王瓊芬 李 飛 張 弘

      (成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科,四川 成都 610500)

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      豐富康復(fù)訓(xùn)練對(duì)腦出血大鼠Slit2表達(dá)的影響

      王風(fēng)波唐明薇王瓊芬李飛張弘

      (成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科,四川成都610500)

      目的觀察大鼠腦出血后同側(cè)海馬區(qū)Slit2的表達(dá)情況及豐富康復(fù)訓(xùn)練的干預(yù)效果。方法將66只成年SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組,采用Ⅶ型膠原酶制備誘導(dǎo)尾狀核出血模型,模型組又隨機(jī)分為非干預(yù)組和豐富康復(fù)訓(xùn)練組,豐富康復(fù)訓(xùn)練組大鼠于造模成功次日開(kāi)始進(jìn)行干預(yù),各組大鼠分別于24 h、7 d、14 d及21 d時(shí)相點(diǎn)行出血側(cè)海馬區(qū)免疫組化Slit2檢測(cè)。結(jié)果與對(duì)照組相比,非干預(yù)組、豐富康復(fù)訓(xùn)練組大鼠Slit2陽(yáng)性反應(yīng)明顯增強(qiáng)(P<0.01),豐富康復(fù)訓(xùn)練組Slit2表達(dá)水平明顯高于非干預(yù)組(P<0.01),各組Slit2陽(yáng)性反應(yīng)均以第7天最為顯著。結(jié)論豐富康復(fù)訓(xùn)練能顯著增強(qiáng)腦出血大鼠Slit2的陽(yáng)性表達(dá),促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的修復(fù)與再生。

      豐富康復(fù)訓(xùn)練;腦出血;Slit2

      腦卒中后中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重塑、修復(fù)與再生一直是神經(jīng)康復(fù)學(xué)研究的熱點(diǎn),其影響因素十分復(fù)雜,既有神經(jīng)生長(zhǎng)因子、軸突導(dǎo)向因子等促進(jìn)因素,又有軸突生長(zhǎng)抑制因素,如何有效降低抑制因子作用,提高神經(jīng)生長(zhǎng)促進(jìn)因素效應(yīng),對(duì)腦損傷后的修復(fù)具有重要意義。作為近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的在神經(jīng)生長(zhǎng)和神經(jīng)元遷移方面都具有重要作用的軸突導(dǎo)向因子Slit2,目前基礎(chǔ)研究主要集中于脊髓損傷和非出血性腦損傷,國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)到有關(guān)腦出血后Slit2表達(dá)變化的研究報(bào)告,而豐富康復(fù)訓(xùn)練對(duì)其影響更是未知。本研究觀察大鼠腦出血后同側(cè)海馬區(qū)Slit2的表達(dá)情況,探討豐富康復(fù)訓(xùn)練在腦出血康復(fù)治療中的作用。

      1 材料與方法

      1.1材料66只SD成年雄性大鼠,體重均≥220 g,由成都大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供;Ⅶ型膠原酶(Sigma公司);大鼠腦立體定位注射儀(江灣Ⅰ型);微量注射器(上海高鴿);動(dòng)物顱骨鉆(ALC-CED);兔抗大鼠Slit2抗體及(SABC)試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

      1.2方法大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(n=24)、模型組(n=42),模型組又分為非干預(yù)組(n=24)和豐富康復(fù)訓(xùn)練組(n=18),均常規(guī)飼養(yǎng)。參照Rosenberg等〔1〕及楊潔等〔2〕方法制備Ⅶ型膠原酶誘導(dǎo)尾狀核腦出血大鼠模型:水合氯醛腹腔麻醉大鼠后固定于腦立體定位儀上,充分暴露前囟,取前囟后0.5 mm,矢狀線右旁側(cè)3 mm,動(dòng)物顱骨鉆鉆孔。Ⅶ型膠原酶0.6 U溶于1.5 μl生理鹽水,微量注射器進(jìn)針至硬膜下約5 mm并緩慢給藥,注射時(shí)間不超過(guò)5 min,注射完畢留針8 min,緩慢退針后縫合頭皮。造模全程要求無(wú)菌操作。對(duì)照組手術(shù)操作方法同模型組,注射同等劑量生理鹽水代替膠原酶。術(shù)后24 h隨機(jī)處死對(duì)照組和非干預(yù)組大鼠各6只,行肉眼及顯微鏡下觀察腦出血區(qū)情況,并用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Slit2表達(dá)。豐富康復(fù)訓(xùn)練組大鼠于造模次日開(kāi)始進(jìn)行干預(yù)。各組大鼠分別于第7、14及21天時(shí)相點(diǎn)行腦出血側(cè)海馬區(qū)腦組織免疫組化Slit2檢測(cè)。

      1.3豐富康復(fù)訓(xùn)練

      1.3.1早期觸摸造模成功后次日開(kāi)始將豐富康復(fù)訓(xùn)練組大鼠托至掌心,用軟毛刷從頭至尾刷動(dòng),勻速有力,持續(xù)15 min/次,1次/d,至第7天。

      1.3.2豐富環(huán)境刺激第7天開(kāi)始將豐富康復(fù)訓(xùn)練組大鼠暴露于豐富環(huán)境中,包括:轉(zhuǎn)盤(pán)、秋千、搖鈴、管道、爬梯、階梯等,同時(shí)給予聲音和彩色燈光刺激,每周更新兩次環(huán)境刺激。2 h/d,1次/d,至第14天。

      1.3.3康復(fù)訓(xùn)練從第7天開(kāi)始對(duì)豐富康復(fù)訓(xùn)練組大鼠進(jìn)行康復(fù)訓(xùn)練,1次/d,至第21天。包括:①跑籠訓(xùn)練:采用圓形轉(zhuǎn)籠,底座有固定架,大鼠在其內(nèi)奔跑,10 min/次;②平衡木訓(xùn)練:平置距地面50 cm處,讓大鼠在上面行走,10 min/次;③網(wǎng)屏訓(xùn)練:網(wǎng)屏距地面高度為80 cm,下方鋪以海綿,訓(xùn)練期間觀察大鼠是否會(huì)用前爪抓住網(wǎng)屏或從網(wǎng)屏上掉下,10 min/d。

      1.4出血側(cè)海馬區(qū)Slit2免疫組織化學(xué)檢測(cè)免疫組織化學(xué)染色用SABC法,陰性對(duì)照用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗。光鏡下觀察神經(jīng)元胞核周?chē)|(zhì)有棕黃色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)。每例腦組織取4張切片,所有切片均在400倍顯微鏡下隨機(jī)拍取4個(gè)互不疊加的視野,計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞,取其平均值。

      1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、q檢驗(yàn)及秩和檢驗(yàn)。

      2 結(jié) 果

      2.1肉眼及鏡下觀察大鼠腦組織病理改變?cè)炷3晒?4 h隨機(jī)處死對(duì)照組和模型組大鼠各6只,以冠狀面切開(kāi)進(jìn)針點(diǎn)腦組織,模型組大鼠右側(cè)尾狀核部位可見(jiàn)血腫形成,直徑約2.5 mm,血腫周邊有不規(guī)則的水腫帶,光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)腦內(nèi)注射區(qū)大量紅細(xì)胞滲出聚集,腦神經(jīng)元大量壞死,其間少許散在存活神經(jīng)元,血腫周邊有小膠質(zhì)細(xì)胞與中性粒細(xì)胞浸潤(rùn),出血區(qū)內(nèi)有大量呈黃褐色的含鐵血黃素顆粒。對(duì)照組大鼠腦內(nèi)無(wú)血腫形成。

      2.2各組大鼠腦出血側(cè)海馬區(qū)Slit2免疫組化檢測(cè)情況對(duì)照組右側(cè)海馬區(qū)可見(jiàn)少量Slit2陽(yáng)性細(xì)胞散在分布。腦出血后,Slit2陽(yáng)性表達(dá)水平明顯升高,與對(duì)照組相比,非干預(yù)組、豐富康復(fù)訓(xùn)練組出血側(cè)海馬區(qū)Slit2陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著上升(P<0.01);與非干預(yù)組比較,豐富康復(fù)訓(xùn)練組大鼠Slit2陽(yáng)性反應(yīng)進(jìn)一步增強(qiáng)(P<0.01)。非干預(yù)組與豐富康復(fù)訓(xùn)練組不同時(shí)間點(diǎn)比較均有顯著差異(P<0.01)。各組Slit2陽(yáng)性反應(yīng)均以第7天最為顯著。見(jiàn)表1和圖1。

      表1 各組大鼠海馬區(qū)Slit2陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)比較

      與對(duì)照組比較:1)P<0.01;與非干預(yù)組比較:2)P<0.01

      圖1 各組第7天Slit2免疫組在檢測(cè)大鼠腦出血測(cè)海馬區(qū)(DAB,×400)

      3 討 論

      Slit家族是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的在神經(jīng)生長(zhǎng)和神經(jīng)元遷移方面都具有重要的導(dǎo)向作用的分泌型蛋白質(zhì)分子,與表達(dá)在軸突表面的受體相互作用,對(duì)軸突生長(zhǎng)起著排斥性導(dǎo)向作用,引導(dǎo)生長(zhǎng)錐朝正確的方向延伸,并決定這些軸突是否穿過(guò)中線,或阻止已經(jīng)穿過(guò)中線的軸突迂回〔3〕。Slit的導(dǎo)向作用主要依賴于其濃度梯度而非絕對(duì)量。Slits因子分布于成年腦的皮質(zhì)、海馬、小腦等區(qū)域,提示Slits可能在成年腦內(nèi)發(fā)揮某些功能,而成年腦內(nèi)鮮有軸突誘導(dǎo)現(xiàn)象發(fā)生。出生后發(fā)育期腦內(nèi)的Slits和Robo因子表達(dá)水平上調(diào)并維持在較高的水平,說(shuō)明Slits的功能不但體現(xiàn)在調(diào)控軸突生長(zhǎng)和神經(jīng)元遷移方面,而且極有可能參與了突觸的塑形〔4〕。已觀察到的海馬組織不斷改變連接現(xiàn)象,就可能與Slits參與的神經(jīng)活性的改進(jìn)有關(guān)。有學(xué)者〔5〕用原位雜交研究冷凝損傷的腦組織內(nèi)Slit-mRNA表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)所有的Slit-mRNA在壞死區(qū)均有不同程度的表達(dá),其中Slit2 mRNA在病灶區(qū)周?chē)X組織的膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)最為明顯,認(rèn)為Slit2可能產(chǎn)生阻止再生軸突進(jìn)入病灶的作用,從而成為影響中樞神經(jīng)再生的原因之一。盡管成年腦內(nèi)Slit2的表達(dá)明顯減少,但在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷情況下,多種軸突導(dǎo)向因子及相應(yīng)受體的表達(dá)可再次發(fā)生改變,并從多個(gè)方面抑制軸突再生〔6〕。有研究用液氯針刺傷成年大鼠腦組織,發(fā)現(xiàn)損傷后第7天損傷灶周?chē)X組織多種Slit陽(yáng)性表達(dá),并以Slit2表達(dá)水平最高〔7〕。目前認(rèn)為Slits的功能主要表現(xiàn)在:①對(duì)軸突生長(zhǎng)的排斥性導(dǎo)向作用;②引導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng);③促進(jìn)背根神經(jīng)節(jié)軸突的延伸和分支;④抑制化學(xué)趨向因子所誘導(dǎo)的白細(xì)胞運(yùn)動(dòng)。有關(guān)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后Slit2表達(dá)變化的基礎(chǔ)研究在脊髓損傷方面相對(duì)較早開(kāi)展。劉興波等〔8〕觀察外傷性脊髓損傷大鼠損傷后1~28 d脊髓前角Slit2表達(dá)變化情況,發(fā)現(xiàn)1 d內(nèi)陽(yáng)性表達(dá)即明顯升高,3 d達(dá)到高峰,5 d開(kāi)始逐漸呈下降趨勢(shì),至28 d接近正常組水平,但仍略高。劉肅等〔9〕制備切割性胸髓損傷大鼠模型,分別通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法和免疫組化法檢測(cè)Slit2基因表達(dá),觀察大鼠損傷后脊髓的Slit2表達(dá)情況,逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法結(jié)果顯示損傷后12 h即可檢測(cè)到Slit2 mRNA的表達(dá),逐漸升高于第3天達(dá)高峰,之后表達(dá)水平逐漸回降。免疫組化檢測(cè)到Slit2蛋白定位于星型膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的胞質(zhì),在正常大鼠脊髓內(nèi)表達(dá)水平較低,于損傷后第3天出現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)并逐漸增多,第7天達(dá)到高峰并趨于穩(wěn)定,第14天開(kāi)始逐漸下降。尹明錫等〔10〕用改良Allen打擊法制備脊髓損傷大鼠模型,分別用電針及藥物早期干預(yù)治療,電針組大鼠于麻醉蘇醒后即造模后大約半小時(shí)開(kāi)始刺激“大椎、命門(mén)”等督脈穴位,20 min/d,1次/d;藥物組大鼠于造模后以30 mg/kg體重劑量的甲潑尼龍經(jīng)尾靜脈注入體內(nèi),次日同一時(shí)間以5.4 mg/kg劑量的甲潑尼龍經(jīng)尾靜脈重復(fù)注射一次,之后不再給藥;結(jié)果顯示,電針組和藥物組大鼠脊髓組織中Slit2 mRNA的表達(dá)水平均顯著升高,與模型組比較均有顯著差異,電針組大鼠Slit2 mRNA表達(dá)略高于藥物組,但兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。近兩年在腦損傷后Slit2表達(dá)的基礎(chǔ)研究方面也有了一些成果。呂凱等〔11〕觀察局灶性腦梗死大鼠大腦皮質(zhì)區(qū)Slit2/Robo1的表達(dá),結(jié)果顯示腦梗死組Slit2表達(dá)水平在術(shù)后第1天即開(kāi)始明顯升高,3 d時(shí)上升達(dá)高峰,14 d回落到接近基礎(chǔ)水平;該實(shí)驗(yàn)用電針刺激腦梗死大鼠“內(nèi)關(guān)、足三里”等穴,30 min/次,1次/d,電針組Slit2表達(dá)水平明顯高于模型非干預(yù)組,兩組在不同時(shí)間點(diǎn)表達(dá)趨勢(shì)大體一致,但對(duì)照組在14 d時(shí)仍高于模型組,提示電針干預(yù)可以在一定程度上維持Slit2表達(dá)的峰值,延緩下降的趨勢(shì);Robo1的表達(dá)情況與趨勢(shì)與Slit2基本一致。崔靜等〔12〕用免疫組化法檢測(cè)宮內(nèi)感染致腦損傷仔鼠模型組和康復(fù)訓(xùn)練組腦皮質(zhì)及海馬區(qū)Slit積分光密度,兩組Slit表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組,在14 d時(shí)達(dá)高峰,之后逐漸呈回落,28 d時(shí)已低于第7天,兩組間相互比較,康復(fù)訓(xùn)練組仔鼠Slit表達(dá)水平高于非干預(yù)組。田貴華等〔13〕用改良Feeney打擊法制備顱腦損傷模型,并針刺腦損傷大鼠“人中、百會(huì)”兩穴,用免疫組化法觀察腦損傷后48 h、6 d損傷局部腦組織Slit2的表達(dá)變化,模型組、針刺組大鼠兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)Slit2的表達(dá)均明顯升高,兩組比較,針刺組大鼠Slit2表達(dá)顯著高于模型組。從上述研究成果可以看到,各種中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后Slit2表達(dá)均有不同程度的升高,而早期干預(yù)有助于進(jìn)一步增強(qiáng)表達(dá)水平。近年來(lái),豐富康復(fù)訓(xùn)練在腦損傷的康復(fù)治療作用與機(jī)制有了較多的研究成果,是豐富環(huán)境、運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練、康復(fù)治療時(shí)機(jī)等積極因素的有機(jī)結(jié)合,對(duì)腦損傷恢復(fù)有著確切的作用,筆者也曾做過(guò)一些相關(guān)研究,并得到了肯定的觀察結(jié)果〔14,15〕。本研究說(shuō)明豐富康復(fù)訓(xùn)練對(duì)腦出血后腦組織Slit2的表達(dá)有確切的增強(qiáng)作用。本實(shí)驗(yàn)雖僅從出血側(cè)海馬區(qū)Slit2表達(dá)的角度探討豐富康復(fù)訓(xùn)練對(duì)腦出血的治療意義,但考慮到Slit2對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后神經(jīng)生長(zhǎng)和神經(jīng)元遷移方面具有的重要導(dǎo)向作用,證實(shí)了豐富康復(fù)訓(xùn)練在腦出血損傷后中樞神經(jīng)重構(gòu)方面的作用及價(jià)值,進(jìn)一步為腦出血的臨床早期系統(tǒng)康復(fù)治療的重要性和必要性提供了有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)并具有一定的指導(dǎo)意義。

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      〔2015-02-04修回〕

      (編輯馮超/曹夢(mèng)園)

      四川省衛(wèi)生廳科研課題(No.120476)

      張弘(1977-),男,副主任醫(yī)師,講師,碩士,主要從事傳統(tǒng)康復(fù)治療腦損傷研究。

      王風(fēng)波(1979-),男,主治醫(yī)師,碩士,主要從事中西醫(yī)結(jié)合治療腦損傷研究。

      R493

      A

      1005-9202(2016)16-3887-03;doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2016.16.008

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