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      過氧化物酶體增殖物激活受體β在老齡膿毒血癥大鼠肺部炎癥中的作用

      2016-10-25 04:58:27周國鵬
      中國老年學雜志 2016年16期
      關鍵詞:毒血癥激動劑老齡

      曾 增 周國鵬

      (北京大學第一醫(yī)院老年科,北京 110034)

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      過氧化物酶體增殖物激活受體β在老齡膿毒血癥大鼠肺部炎癥中的作用

      曾增周國鵬

      (北京大學第一醫(yī)院老年科,北京110034)

      目的探討激活過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)-β對老齡膿毒血癥大鼠模型肺部炎癥、炎癥指標及死亡率的影響。方法選用24月齡雄性SD大鼠,通過盲腸結扎穿孔(CLP)手術建立膿毒血癥模型,予GW501516 0.25、0.75 mg/kg為低、高劑量組。分別液體復蘇CLP術后大鼠,與空白對照組、單純CLP手術組比較24、48 h死亡率,運用HE染色、免疫組化染色及RT-PCR等方法了解肺組織中PPAR-β及Akt-1、核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB、白細胞介素(IL)-6的表達。結果(1)24 h死亡率:單純手術組42.1%,低劑量組10%,高劑量組20%;48 h死亡率:單純手術組27.3%,低劑量組16.7%,高劑量組50%。(2)RT-PCR:CLP術后24 h PPAR-β表達下調(diào),使用GW501516后上調(diào)PPAR-β表達。CLP手術打擊可上調(diào)IL-6、NF-κB炎癥因子表達量,使用GW501516后IL-6、NF-κB表達量下調(diào),Akt-1表達量上調(diào)。(3)HE染色:CLP手術打擊后肺組織中大量炎性細胞浸潤、肺間質(zhì)水腫充血,GW501516處理組肺部炎性細胞浸潤、間質(zhì)水腫減輕。(4)免疫組化:使用GW501516后肺組織中PPAR-β陽性細胞增多。結論低劑量GW501516(0.25 mg/kg)可降低膿毒血癥老齡大鼠早期死亡率,其機制與激活Akt-1、下調(diào)NF-κB有關。

      膿毒血癥;過氧化物酶體增殖物激活受體-β;生物分子信號通路

      過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARs)是配體激活的轉(zhuǎn)錄因子,分為PPAR-α、PPAR-β和PPAR-γ三種亞型,其中PPAR-β可能參與調(diào)節(jié)體內(nèi)多種與代謝和炎癥相關疾病的病理生理過程〔1〕。膿毒血癥發(fā)生時,肺部是全身炎癥反應的始動器官,其中急性肺損傷(ALI)/呼吸窘迫綜合征(ARDS)的發(fā)生率高達25%~44%〔2,3〕。膿毒血癥致ALI/ARDS發(fā)病機制復雜,死亡率高,死亡的主要原因多為多器官衰竭;年齡增高也是導致死亡率增高的重要原因〔3〕。PPAR-β活化是否參與肺部炎癥反應調(diào)控的研究較少,尤其缺乏關于老年群體的研究。本文通過盲腸結扎穿孔(CLP)的方法建立老齡大鼠膿毒血癥模型,觀察PPAR-β及相關指標在肺組織的表達。

      1 材料與方法

      1.1材料

      1.1.1動物從北京大學醫(yī)學部實驗動物中心購得雄性SD大鼠。大鼠購進時為3月齡,于實驗動物中心飼養(yǎng)至24月齡進行實驗。飼養(yǎng)期間使用標準飼料,不限食水,保持12∶12 h晝夜規(guī)律。所有動物實驗均經(jīng)過北京大學實驗動物委員會批準。

      飼養(yǎng)至24月齡時,SD大鼠存活46只,隨機分為非CLP手術對照組(CON組,n=5)、CLP手術組(CLP組,n=19)、CLP手術+低劑量激動劑干預組(CLP-LD組,n=10)、CLP手術+高劑量激動劑干預組(CLP-HD組,n=10)、單純高劑量激動劑干預48 h組(NO-CLP-HD-48組,n=2)。其中CLP、LD、HD組內(nèi)再分為術后24 h觀察組及48 h觀察組(CLP-24組,n=8;CLP-48組,n=11;CLP-LD-24組,n=4;CLP-LD-48組,n=6;CLP-HD-24組,n=4;CLP-HD-48組,n=6)。

      1.1.2試劑常用普通化學試劑均為市售分析純;高純總RNA快速提取試劑盒(離心柱型)(北京百泰克生物技術有限公司);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Fermentas公司);引物(北京奧科鼎盛生物科技有限公司);RT-PCR反應體系(Taq酶,dNTP等)(北京全式金生物技術有限公司);普通PCR反應體系(Taq酶,dNTP等)(北京康為世紀生物科技有限公司);辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(北京中山金橋公司);GW501516(Enzo Life Sciences Inc)。

      1.2建模雄性SD大鼠于術前6 h停止進食水。術前稱重,予3%戊巴比妥鈉(1 ml/kg體重)腹腔麻醉。麻醉完成后,將大鼠仰臥位固定于操作臺上。建立CLP模型:(1)下腹部備皮,75%酒精局部消毒。(2)行下腹中線切口(3~4 cm),逐層進入腹腔。(3)確認并分離盲腸。(4)結扎盲腸。(5)使用20 ml針頭從兩側串通結扎后盲腸造成人為腸穿孔。(6)盲腸還納腹腔。(7)逐層關腹。(8)按照表1于大鼠背部皮下注射進行液體復蘇(37℃,5 ml/100 g體重)。(9)建模完成后將各組老齡大鼠分開放回籠中讓其自由飲食。

      表1 液體復蘇溶液組分

      1.3標本采集各組實驗動物在預定時相點予3%戊巴比妥鈉(1 ml/kg體重)腹腔注射麻醉后固定。打開胸腔,心臟穿刺放血處死。取右肺下葉,4%多聚甲醛固定后,石蠟包埋切片,留做病理學檢查及免疫組化染色。取右肺上葉組織約100 mg,放入1.5 ml去RNA酶EP管,液氮凍實后放入-80℃冰箱保存,留做提取RNA用。

      1.4RT-PCR將所取標本按照試劑盒說明書提取RNA、逆轉(zhuǎn)錄,應用生物學軟件Primer3.0設計引物。引物序列:PPAR-β正義鏈GTGTCAGTACTGCCGCTTCCA,反義鏈CTCCGGCATCCTTCCAAAG,目的片段長度100 kD,退火溫度60℃;Akt-1正義鏈CTGTGGCTGATGGACTCAAA,反義鏈CCTCAGCACCTGAGTTGTCA,目的片段長度84 kD,退火溫度59℃;NF-κB正義鏈CCTTCTAAAGGCTGGTGCTG,反義鏈ATGGCCTCGGAAGTTTCTTT,目的片段長度136 kD,退火溫度59℃;β-actin正義鏈AGCCATGTACGTAGCCATCC,反義鏈GCTGGGTGGTGAAAGCTGTA,目的片段長度222 kD,退火溫度59℃。運用MJ Research公司的Opticon實時熒光定量PCR儀進行PCR擴增,程序:95℃預變性5 min;循環(huán)35次:90℃變性30 s,58℃~60℃退火30 s,72℃延伸30 s;72℃延伸10 min。以管家基因β-actin的表達為內(nèi)參照,用擴增基因/β-actin的灰度比值對該基因的表達進行半定量。

      1.5肺組織HE染色及PPAR-β免疫組化染色

      1.5.1肺組織HE染色將切片標本逐個經(jīng)過以下試劑:二甲苯(5 min×3次)、100%乙醇(3 min×3次)、95%乙醇(3 min)、90%乙醇(3 min)、80%乙醇(3 min)、70%乙醇(3 min)、雙蒸水(5 min)、雙蒸水(5 min)。之后蘇木素染核30 s,自來水終止,酒精鹽酸分色,依紅染色。運用梯度酒精分色、透明后,中性樹膠封片,37℃恒溫箱烘干,顯微鏡下觀察、照相。

      1.5.2PPAR-β免疫組化染色將切片標本逐個經(jīng)過以下試劑:二甲苯(5 min×3次)、100%乙醇(3 min×3次)、95%乙醇(3 min)、90%乙醇(3 min)、80%乙醇(3 min)、70%乙醇(3 min)、雙蒸水(5 min)、雙蒸水(5 min),3%雙氧水溶液避光浸泡10 min,阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性。0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3次,每次5 min??乖瓱嵝迯汀?.01 mol/L PBS溶液漂洗3次,每次5 min。用濾紙將水分吸干,1%牛白蛋白封閉,室溫放置30 min。濾紙將水分吸干,加一抗,放入濕盒中4℃過夜。0.01 mol/L PBS溶液漂洗3次,每次5 min。用濾紙將水分吸干,滴加二步法試劑盒中的試劑2(標記有辣根過氧化物酶的抗兔的一種結合兔來源的一抗),放入37℃孵育30 min。0.01 mol/L PBS溶液漂洗3次,每次5 min。用濾紙吸干水分,滴加顯色液二氨基聯(lián)苯胺(DAB),顯微鏡下觀察顯色情況,雙蒸水終止反應。蘇木素染核30 s,鹽酸酒精分色3~5 s,自來水沖洗反藍。梯度酒精脫水、透明。中性樹膠封片,37℃恒溫箱烘干,顯微鏡下觀察、照相。

      1.6統(tǒng)計學方法應用GraphPad Prism 5.0軟件,各組間比較使用one way ANOVA檢驗或t檢驗,不符合條件的使用nonparametric檢驗。各組間死亡率比較使用χ2檢驗,不符合條件的使用Fisher檢驗。

      2 結 果

      2.1死亡率CLP術后24 h觀察點,CLP組術后24 h內(nèi)死亡8只(42.1%);使用不同劑量GW501516鹽水復蘇后,CLP-LD組24 h內(nèi)死亡1只(10.0%),CLP-HD組24 h內(nèi)死亡2只(20.0%)。以CLP術后48 h觀察點,CLP-48組48 h內(nèi)共死亡3只(27.3%);CLP-LD-48組48 h內(nèi)死亡1只(16.7%),CLP-HD-48組48 h內(nèi)死亡3只(50.0%)。

      2.2肺組織HE染色見圖1。CLP手術打擊后肺組織中大量炎性細胞浸潤、肺間質(zhì)水腫充血,GW501516處理組肺部炎性細胞浸潤、間質(zhì)水腫減輕。

      2.3PPAR-β免疫組化染色結果見圖2。使用GW501516后肺組織中PPAR-β陽性細胞增多。

      2.4RT-PCR結果見表2。CLP術后24 h PPAR-β表達下調(diào),使用GW501516后上調(diào)PPAR-β表達。CLP手術打擊可上調(diào)白細胞介素(IL)-6、核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB等炎癥因子表達量,使用GW501516后IL-6、NF-κB表達量下調(diào),Akt-1表達上調(diào)。見表1。

      圖1 老齡大鼠肺組織HE染色(×400)

      圖2 老齡大鼠肺組織PPAR-β免疫組化染色(×200)

      指標CON組(n=5)CLP-24組(n=8)CLP-LD-24組(n=4)CLP-HD-24組(n=4)PPAR-β1.0000±0.42500.5057±0.46751.4260±0.26611.8680±0.0732Akt-10.9999±0.29160.9673±0.56711.8690±0.69550.7283±0.2214NF-κB1.0000±0.29351.3130±0.71101.0980±0.39921.4090±1.0550IL-60.9992±0.55841.4270±0.01461.0790±0.51310.6971±0.3497指標CLP-48組(n=11)CLP-LD-48組(n=6)CLP-HD-48組(n=6)NO-CLP-HD-48組(n=2)PPAR-β1.4160±0.98791.6370±0.84444.7270±2.89303.1450±0.2464Akt-12.5250±1.30500.9107±0.39021.5830±0.62311.0090±0.0000NF-κB2.4420±2.50001.1760±0.48031.0810±0.42551.1980±0.5066IL-61.7300±1.54400.6424±0.51260.5489±0.08211.1140±0.6245

      3 討 論

      膿毒血癥發(fā)生后,肺外炎性介質(zhì)通過循環(huán)系統(tǒng)進入肺內(nèi),導致肺血管充血,血管內(nèi)皮細胞損傷,血管通透性增加及單核細胞、淋巴細胞、多核細胞、血小板等炎性細胞聚集,進而引起肺小血管的充血和肺間質(zhì)水腫,導致肺泡萎陷。這一病生理過程與許多信號傳導通路有關,目前研究證實〔4~6〕,NF-κB信號通路、Janus激酶/信號傳導-轉(zhuǎn)錄活化因子通路、P38MAPKs通路、PI3K/PKB信號通路均在這一過程中起調(diào)控作用。本實驗選用GW501516作為PPAR-β的激動劑,結果提示使用GW501516后,肺組織中PPAR-β含量較空白對照組升高,提示激動劑起效。

      PPARβ/δ在體內(nèi)廣泛分布,其功能目前仍然不詳?,F(xiàn)有的研究表明它和脂質(zhì)代謝、骨代謝、腫瘤、生殖、腦發(fā)育及炎癥等有關〔7〕,可能參與調(diào)節(jié)體內(nèi)多種與代謝和炎癥相關的疾病的病理生理過程。目前的研究提示,PPAR-β在炎癥反應中可能主要通過NF-κB通路、p38MAPK信號通路及PI3K-Akt信號通路共同調(diào)控炎癥因子的表達,調(diào)控炎癥反應的進程〔4~6〕。

      Kapoor等〔4〕采用注射內(nèi)毒素的方法建立小鼠膿毒血癥模型,結果發(fā)現(xiàn),給予PPAR-β激動劑GW0742后,與單純手術處理的組別比較,小鼠肺部炎癥反應減輕,炎癥因子釋放減少,生存率增加,其機制可能與激活Akt及抑制GSK-3β和NF-κB有關,且NF-κB的下調(diào)可能通過MAPK-ERK1/2信號通路調(diào)控。另一項研究發(fā)現(xiàn)〔8〕,給予PPAR-β激動劑GW0742處理內(nèi)毒素注射誘發(fā)的肺炎小鼠,可以明顯減少肺部白細胞聚集浸潤,降低IL-6、IL-1β及TNF-α的表達。Fan等〔9〕用PPAR-β激動劑處理人原代臍靜脈內(nèi)皮細胞發(fā)現(xiàn),給予PPAR-β激動劑后可明顯抑制內(nèi)皮細胞黏附分子的表達及白細胞的聚集,減少氧化應激,但NF-κB并不被抑制。以上研究都提示,PPAR-β具有抗炎作用,但其抗炎的機制目前尚存爭議。本實驗通過CLP方法建立膿毒血癥模型,此模型的發(fā)病機制除了內(nèi)毒素造成以外,還包括腸道其他細菌毒素的致傷作用及手術打擊等,模型病情較重,肺部病理損害明顯〔10〕,發(fā)病過程和病理表現(xiàn)與危重監(jiān)護室(ICU)老年膿毒血癥病人ALI/ARDS的特點類似。

      IL-6在炎癥刺激下由多種細胞釋放,介導急性時相反應,刺激肝細胞合成急性反應蛋白〔11〕,本實驗結果顯示CLP手術處理后,老齡大鼠肺組織中IL-6 mRNA含量較空白對照組呈上調(diào)趨勢,且從肺組織HE染色結果可以看出,CLP術后24 h肺組織內(nèi)大量炎癥細胞浸潤,肺間質(zhì)水腫、充血,說明CLP手術后老齡大鼠體內(nèi)炎癥反應模型建立。有學者認為IL-6能較為可靠的反映肺組織局部損傷的程度〔12〕。本實驗結果也提示,激活PPAR-β后可以下調(diào)IL-6,膿毒血癥致老齡大鼠肺部炎癥反應減輕。本文死亡率結果提示PPAR-β活化后,通過下調(diào)IL-6,可降低膿毒血癥致肺部炎癥的老齡大鼠早期死亡率,這種對死亡率的影響尤其以低劑量組明顯。

      NF-κB在ARDS的發(fā)病中起重要作用,與機體非特異性免疫反應具有密切關系,廣泛參與炎癥介質(zhì)(TNF-α、IL-1、IL-6)、黏附分子(ICAM-1、VCAM-1和ELAM-1)、趨化因子和一些炎性相關酶類(基質(zhì)金屬蛋白酶、環(huán)氧化酶和一氧化碳合酶)等基因的調(diào)控;而TNF-α、IL-6等又能作為NF-κB的調(diào)節(jié)產(chǎn)物激活NF-κB,從而形成能不斷延續(xù)并逐級放大炎癥反應的調(diào)節(jié)環(huán)路〔13〕,導致瀑布效應,導致全身炎癥反應綜合征的發(fā)生,進而造成包括ALI/ARDS在內(nèi)的多器官衰竭。Blackwell等〔13〕通過腹腔內(nèi)注射內(nèi)毒素建立SD大鼠ARDS模型,并運用凝膠電泳遷移率改變法檢測肺泡灌洗液中NF-κB的活性,發(fā)現(xiàn)注射內(nèi)毒素后1 h NF-κB顯著升高,在2.5 h及7 h均恢復正常水平;而對照組中核蛋白中僅有少量NF-κB。Blackwell還檢測了注射內(nèi)毒素小鼠的肺泡巨噬細胞和肺組織中NF-κB的活性,在這些細胞和組織中均可檢測到高活性的NF-κB。提示早期運用拮抗NF-κB活化的藥物可以有效控制全身急性炎癥反應,改善病情和預后。本實驗結果提示,運用低劑量GW501516激活PPAR-β后,可通過下調(diào)IL-6等促炎因子,進一步下調(diào)NF-κB表達,減低瀑布效應,從而起到抗炎作用,降低老齡大鼠死亡率,此結果與Kapoor等〔4〕的實驗結論一致。

      磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號通路是細胞內(nèi)重要信號轉(zhuǎn)導通路之一,由PI3K家族與其下游分子絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Akt或蛋白激酶B(PKB)組成,該通路廣泛存在于細胞中,參與細胞增殖、凋亡及分化等功能的調(diào)控?;罨腁kt激活或抑制其下游靶蛋白Bad、Caspase9、NF-κB、GSK-3、FKHR、p21Cip1和p27Kip1等,進而調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化、凋亡以及遷移等。磷酸化后的Akt可通過調(diào)控激活IKKα復合體還可影響NF-κB的活化。Akt活化后,可以下調(diào)GSK-3β的表達從而抑制葡萄糖代謝;還可下調(diào)Bad的表達,促進細胞凋亡。由此看出,Akt活化后在炎癥反應、免疫反應、細胞增殖、細胞凋亡等多種生物過程中發(fā)揮重要作用。有實驗顯示〔14〕,急性肺損傷時肺組織中磷酸化Akt表達減少,肺組織中髓過氧化物酶活性增加。 本實驗結果顯示,使用低劑量GW501516處理膿毒血癥致老齡大鼠肺部炎癥后,在早期降低死亡率與上調(diào)Akt-1的表達有關,此結果與Kapoor等〔4〕的結論一致。

      綜上,低劑量GW501516(25 μg/100 g體重)可降低膿毒血癥致肺部炎癥老齡大鼠早期死亡率,其機制可能與激活PPAR-β后上調(diào)Akt-1、下調(diào)NF-κB從而減輕肺部炎癥反應有關。

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      〔2016-05-09修回〕

      (編輯袁左鳴)

      周國鵬(1973-),男,博士,副主任醫(yī)師,主要從事高齡病人多器官系統(tǒng)疾病的診治以及老年危重癥的搶救和診治研究。

      曾增(1986-),女,博士,主要從事老年患者呼吸及危重癥的診治研究。

      R631

      A

      1005-9202(2016)16-3880-04;doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2016.16.005

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