轉(zhuǎn)凝蛋白基因與胃癌及癌前病變的相關(guān)性

潘　科　張人弘　鄭　娟　黃　勻　張丹丹　蒙　韜　吳小艷　趙　艷

(黔南州人民醫(yī)院消化內(nèi)科，貴州　都勻　558000)

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·基礎(chǔ)研究·

轉(zhuǎn)凝蛋白基因與胃癌及癌前病變的相關(guān)性

潘科張人弘鄭娟黃勻張丹丹蒙韜吳小艷1趙艷1

(黔南州人民醫(yī)院消化內(nèi)科，貴州都勻558000)

目的探討轉(zhuǎn)凝蛋白(transgelin)基因與胃癌前病變及胃癌的關(guān)系。方法收集7例慢性非萎縮性胃炎、12例腸上皮化生、4例非典型增生及39例胃癌患者的胃組織，提取及純化總RNA。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定transgelin mRNA的表達(dá)水平，分析其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果transgelin mRNA在腸上皮化生、非典型增生及胃癌組織中的表達(dá)增加，分別是慢性非萎縮性胃炎組織的4.06倍、73.11倍、13.21倍(均P<0.05)；Ⅳ期胃癌組織transgelin mRNA表達(dá)增加，是Ⅰ～Ⅱ期的2.54倍；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者胃癌組織transgelin mRNA是無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的3.35倍(均P<0.05)。結(jié)論transgelin基因可能與胃癌前病變的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，可能是胃癌發(fā)生過程中的促進(jìn)因素。

胃癌前病變；轉(zhuǎn)凝蛋白

轉(zhuǎn)凝蛋白(transgelin)與卵巢癌〔1〕、肺癌〔2〕、直腸癌〔3〕等多種腫瘤相關(guān)，推斷其可能是腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要因素。有研究〔4〕發(fā)現(xiàn)幽門螺桿菌(H.pylori)感染致胃癌的動(dòng)物模型中，胃組織中transgelin蛋白表達(dá)上調(diào)；且在體外實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)〔5〕，H.pylori感染可上調(diào)transgelin mRNA的表達(dá)。但從正常胃黏膜經(jīng)慢性萎縮性胃炎、腸上皮化生、非典型增生，最后發(fā)展成胃癌的過程中，transgelin的水平變化并不清楚。本研究擬探討transgelin mRNA的表達(dá)與胃癌前病變及胃癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。

1　材料與方法

1.1對(duì)象及標(biāo)本采集收集2013年1月至2015年10月黔南州人民醫(yī)院及同期貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院收治的經(jīng)病理學(xué)確診的82例胃癌組織標(biāo)本，其中27例慢性非萎縮性胃炎(男18例、女9例，年齡32～89歲)、12例腸上皮化生(男7例、女5例，年齡30～83歲)、4例非典型增生(男3例、女1例)及39例胃癌(男24例、女15例，年齡30～82歲；胃竇癌28例、胃體癌11例；Ⅰ期2例，Ⅱ期3例，Ⅲ期14例，Ⅳ期20例；淋巴轉(zhuǎn)移20例，無淋巴轉(zhuǎn)移19例)。標(biāo)本收集后-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2主要儀器及試劑DU640核酸定量?jī)x(美國(guó)Beckman公司)，9700型PCR擴(kuò)增儀、ABI Step one plus型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)。瓊脂糖(美國(guó) Introvergen公司)，Trizol(美國(guó)Ameresco 公司)，MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶(美國(guó)Promega 公司)，RNA 酶抑制劑、Oligo dT18、dNTPs(中國(guó)天根公司)、Power SYBR?Green PCR Master Mix(美國(guó)ABI公司)。其他試劑：焦碳酸二乙酯(DEPC)：水、乙醇、氯仿、異丙醇、氯仿-異戊醇(24∶1)均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3總RNA的提取及cDNA合成采用酚-氯仿一步法提取總RNA：取0.1 g組織剪碎后置于勻漿器中，加入1 ml Trizol，在冰浴中迅速勻漿30 s，充分研碎組織，置于室溫5 min后加入0.2 ml氯仿，于渦旋振蕩器搖振15 s，置于室溫下3 min，以12 000 r/min 4℃離心15 min，吸取上清，加入0.5 ml異丙醇混勻，室溫靜置2 h，12 000 r/min 4℃離心15 min，棄上清，加入75%乙醇清洗，棄上清，加入無核酸水50 μl，用核酸定量?jī)x(DU640)檢測(cè)RNA濃度。

逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA：參照說明書操作，在25 μl反應(yīng)體系中分別加入樣本RNA 3 μl、Oligo(10 pmol/L)1 μl混勻后放置于PCR儀中65℃(10 min)、4℃(10 min)后轉(zhuǎn)至冰上，再加入dNTPs(10 mmol/L)2 μl、5×buffer 4 μl、RNAse Inhibitor(40 U/μl) 0.5 μl、MMLV (200 U/μl)0.5 μl，最后加DEPC處理水至25 μl，55℃孵育30 min、85℃孵育5 min、4℃孵育10 min合成cDNA，置-20℃保存。

1.4SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)transgelin基因的表達(dá)選用次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶1(HPRT1)作為內(nèi)參基因，登陸GenBank獲取差異蛋白基因序列，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，由上海生工生物技術(shù)服務(wù)公司合成引物序列。實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列：HPRT1上游：5'-TGAGGATTTGGAAAGGGTGT-3'，下游：5'-GAGCACACAGAGGGCTACAA-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度118 bp，GenBank登錄號(hào)：NM-000194.2；transgelin上游：5'-TGGAGATCCCAACTGGTTTATG-3'，下游：5'-CTGCCGAGGTCGTCCGTAG-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度157 bp，GenBank登陸號(hào)：M-003186。PCR反應(yīng)體系20 μl：Hotsybr Real-time PCR Master Mix(2×)10 μl，上、下游引物(10 μmol/L)各1.0 μl，cDNA模板(300 ng)2 μl，加DEPC補(bǔ)足至20 μl。PCR循環(huán)參數(shù)：95℃預(yù)變性10 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。

transgelin基因和HPRT1的擴(kuò)增循環(huán)熒光信號(hào)Ct值由ABI Step one plus型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀采集，計(jì)算transgelin基因的相對(duì)表達(dá)量(2-ΔΔCt)，其中△△Ct=實(shí)驗(yàn)組(Cttransgelin-CtHPRT1)-對(duì)照組(Cttransgelin-CtHPRT1)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS20.0軟件，并對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)，組間比較采用方差分析和q檢驗(yàn)。

2　結(jié)　果

2.1RNA純度的鑒定胃組織RNA的A260/A280值為1.8～2.0，濃度為400～800 μg/ml，1.5%瓊脂糖凝膠電泳中，細(xì)胞RNA和組織RNA中的28S rRNA、18S rRNA清晰可見，表明提取的RNA質(zhì)量較好。見圖1。

1和4，慢性非萎縮性胃炎組；2和6，胃癌組；3，腸上皮化生組；5，非典型增生組圖1　RNA瓊脂糖凝膠電泳圖譜

2.2transgelin mRNA在各組胃組織中的表達(dá)水平transgelin基因在腸上皮化生、非典型增生及胃癌組織中的表達(dá)增加(均P<0.05)，見表1。

表1　各組胃組織中transgelin mRNA的表達(dá)

與慢性胃炎組比較：1)P<0.05；與腸上皮化生組比較：2)P<0.05

2.3transgelin mRNA的表達(dá)與腫瘤病理特征的關(guān)系與胃癌組織Ⅰ～Ⅱ期transgelin mRNA表達(dá)水平相比，胃癌組織Ⅳ期表達(dá)明顯增加；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者胃癌組織transgelin mRNA表達(dá)增高(均P<0.05)，見表2。

表2　transgelin mRNA表達(dá)與胃癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

與其他亞組比較：1)P<0.05

3　討　論

transgelin 蛋白是一種重要的細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白，不僅參與細(xì)胞骨架重構(gòu)，而且還可作為信號(hào)分子參與細(xì)胞生長(zhǎng)；也在平滑肌分化為干細(xì)胞和胚胎血管發(fā)育及細(xì)胞外基質(zhì)降解和血管生成中起到重要的作用〔6〕。文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)和功能的改變與腫瘤形成和發(fā)展密切先關(guān)，是一個(gè)必不可少的重要因素，transgelin在多種腫瘤組織中表達(dá)異常，可能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)〔7〕。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，transgelin基因在腸上皮化生、非典型增生及胃癌組織中的表達(dá)高于慢性炎癥組織，因此推測(cè)transgelin可能與胃癌的發(fā)生有關(guān)。這與Yu等〔8〕、趙艷等〔4〕研究結(jié)論一致，可能在于transgelin通過重構(gòu)細(xì)胞骨架、形成偽足小體或參與上皮細(xì)胞的遷移等，對(duì)細(xì)胞的侵襲、遷移及分化起到促進(jìn)作用，在胃癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中起著重要的作用。本研究中，transgelin基因在胃癌Ⅳ期組織及已經(jīng)發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移的胃癌組織表達(dá)明顯升高，也支持了上述觀點(diǎn)。且Yu等〔8〕研究也發(fā)現(xiàn)trangelin蛋白可改變腫瘤微環(huán)境，促進(jìn)胃癌細(xì)胞遷移和入侵。有研究發(fā)也現(xiàn)，transgelin在缺氧的肺癌細(xì)胞中高表達(dá)，使用小型干擾RNA，可減少遷移能力〔9〕；且在胰腺癌患者中已發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移者transgelin 表達(dá)明顯上調(diào)，因此推斷transgelin與淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，且transgelin可能是晚期胰腺癌新的預(yù)后標(biāo)志物〔10〕。Lee等〔11〕研究發(fā)現(xiàn)，transgelin在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)量顯著高于非腫瘤細(xì)胞，是非腫瘤細(xì)胞的25倍，并可對(duì)腫瘤干細(xì)胞的遷移和入侵起促進(jìn)作用。另外，翁永強(qiáng)等〔12〕研究發(fā)現(xiàn)，高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞的樹突細(xì)胞組transgelin的表達(dá)顯著高于正常的樹突細(xì)胞組。以上研究都說明transgelin基因在某些腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中有重要作用，但有研究發(fā)現(xiàn)，在人乳腺癌、結(jié)腸癌〔13〕及卵巢漿液性癌〔1〕等研究中均發(fā)現(xiàn)，transgelin水平均下降，甚至在卵巢交界性漿液性瘤、卵巢漿液性癌的早期發(fā)生過程中，transgelin基因表達(dá)減弱或無表達(dá)，且Goctinck等〔14〕研究認(rèn)為transgelin可能抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和浸潤(rùn)。因此，對(duì)于不同腫瘤transgelin 表達(dá)差異的具體機(jī)制也需進(jìn)一步研究。

1劉志輝.Transgelin基因與蛋白在卵巢漿液性腫瘤中的表達(dá)及臨床意義〔D〕.沈陽：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)，2005.

2劉艷茹.Transgelin基因在肺腺癌發(fā)展中的作用研究〔D〕.杭州：浙江大學(xué)，2014.

3李里，彭佳遠(yuǎn)，馬延磊，等.Transgelin蛋白在人結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其臨床意義〔J〕.腫瘤，2009；29(8)：765-7.

4趙艷，謝淵，陳嫻，等.幽門螺桿菌感染蒙古沙鼠胃癌模型的建立及蛋白質(zhì)組學(xué)研究〔J〕.中華病理學(xué)雜志，2014；43(11)：1-7.

5趙艷，謝淵，王文玲，等.transgelin基因在幽門螺桿菌感染胃癌細(xì)胞及人胃癌組織中的表達(dá)〔J〕.臨床檢驗(yàn)雜志，2014；32(12)：920-2.

6白霞，張連峰，周琳，等.靶向干擾骨架蛋白Transgelin抑制胰腺癌裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)〔J〕.中華普通外科雜志，2013；28(7)：538-41.

7劉志輝，王敏，史春雪，等.Transgelin基因在卵巢漿液性腫瘤中的表達(dá)〔J〕.中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2010；20(19)：2933-6.

8 Yu B，Chen X，Li J，etal.Stromal fibroblasts in the microenvironment of gastric carcinomas promote tumor metastasis via upregulating TAGLN expression〔J〕.BMC Cell Biol,2013；14：17.

9 Wu X，Dong L，Zhang R，etal.Transgelin overexpression in lung adenocarcinoma is associated with tumor progression〔J〕.Int J Mol Med，2014；34(2)：585-91.

10 Zhou L，Zhang R，Zhang L，etal.Upregulation of transgelin is an independent factor predictive of poor prognosis in patients with advanced pancreatic cancer〔J〕.Cancer Sci，2013；104(4)：423-30.

11 Lee EK，Han GY，Park HW，etal.Transgelin promotes migration and invasion of cancer stem cells〔J〕.J Proteome Res，2010；9(10)：5108-17.

12翁永強(qiáng)，袁祖榮，張益軍，等.負(fù)載肝癌細(xì)胞裂解物的樹突狀細(xì)胞Transgelin表達(dá)水平與其功能的關(guān)系〔J〕.中華肝臟病雜志，2008；16(7)：514-8.

13 Shields JM，Rogers-Graham K,Der CJ.Loss of transgelin in breast and colon tumors and in RIE-1 cells by Ras deregulation of gene expression through Raf-independent pathways〔J〕.Biol Chem，2002；277(12)：9790-9.

14 Goctinck S，Watcrston RH.The caenorhabditis elegans muscle-affecting gene uric-87 encodesa novel thin filament-associated protein〔J〕.J Cell Biol，1994；127(1)：79-93.

〔2016-02-11修回〕

(編輯袁左鳴)

國(guó)家自然科學(xué)基金(81260303)；貴州省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(黔科合SY字〔2011〕3067號(hào))；黔南州社會(huì)發(fā)展科技計(jì)劃(黔南科合社字〔2012〕13號(hào))；貴州省科技合作計(jì)劃項(xiàng)目(黔科合LH字〔2015〕7360)

趙艷(1973-)，女，副教授，碩士，主要從事腫瘤分子生物學(xué)研究。

潘科(1974-)，男，副主任醫(yī)師，碩士，主要從事消化道腫瘤的發(fā)病機(jī)制研究。

R735

A

1005-9202(2016)16-3869-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.16.001

1貴州醫(yī)科大學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室