一株貂源綠膿桿菌的分離和鑒定

楊朋欣，丁國(guó)杰，劉可姝，張春媛，王彬

（哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司黑龍江哈爾濱150069）

一株貂源綠膿桿菌的分離和鑒定

楊朋欣，丁國(guó)杰，劉可姝，張春媛，王彬

（哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司黑龍江哈爾濱150069）

為鑒定一株引起水貂發(fā)病的致病菌，本研究從患病水貂肺臟中分離獲得一株優(yōu)勢(shì)菌，分別對(duì)該分離株進(jìn)行形態(tài)、生化和培養(yǎng)特性研究；分子生物學(xué)和血清型鑒定；半數(shù)致死量測(cè)定。結(jié)果表明，該分離株為血清G型水貂源綠膿桿菌；分離株16S rRNA基因序列與已知的綠膿桿菌相應(yīng)序列同源性為99.16%；分離菌對(duì)小鼠的半數(shù)致死量（LD50）為1.17×106CFU，對(duì)水貂的LD50為1.5×108CFU。

綠膿桿菌；分離鑒定；LD50；水貂

水貂出血性肺炎是由綠膿桿菌又稱銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa）感染引起的一種高度致死性傳染病，多發(fā)于每年9-11月份，該菌可通過患病水貂形成的飛沫及氣溶膠傳播［1］。發(fā)病急、死亡快，所以又稱銅綠假單胞菌肺炎，以呼吸困難、口鼻出血、突發(fā)性死亡為主要特征，死后典型癥狀為口鼻流出血樣泡沫，剖檢肺臟呈彌漫性出血。本研究無菌采集多份發(fā)病水貂病料肺臟樣品，分離出一株細(xì)菌。對(duì)該分離菌株進(jìn)行形態(tài)、生化和培養(yǎng)特性研究，分子生物學(xué)和血清型鑒定等方面的綜合分析鑒定，并測(cè)定分離菌的半數(shù)致死量，為水貂養(yǎng)殖中防治該病提供了理論依據(jù)。

1　材料和方法

1.1病料來源

從大連某貂場(chǎng)疑似出血性肺炎的病死水貂無菌采集肺臟3份。

1.2主要試劑

綠膿桿菌分型用標(biāo)準(zhǔn)血清系列，購自日本生研株式會(huì)社；綠膿素測(cè)定用培養(yǎng)基（PDP）購自北京陸橋公司（PDP）；rTaq、dNTP和DL2000DNAMarker均購自寶生物工程（大連）有限公司；瓊脂糖購自生工生物工程（上海）有限公司。

1.3試驗(yàn)動(dòng)物

18～20g昆明小鼠購自哈藥集團(tuán)三精制藥有限公司；2～5月齡水貂購自尚志五仁養(yǎng)貂專業(yè)合作社（綠膿桿菌B型、C型和G型玻片凝集試驗(yàn)抗體陰性）。

1.4分離株的分離培養(yǎng)

分別無菌沾取病料切面劃線接種2%牛血清肉湯瓊脂平板，37℃過夜培養(yǎng)。挑取疑似陽性菌落接種5mL2%牛血清肉湯培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過夜，標(biāo)記為F0代。

1.5分離株形態(tài)、生化特性及培養(yǎng)特性

對(duì)疑似陽性分離株做進(jìn)一步的鑒定，取F0代劃線培養(yǎng)的典型菌落，分別接種2%牛血清肉湯培養(yǎng)基、PDP斜面和綿羊鮮血瓊脂平板；進(jìn)行革蘭氏染色；氧化酶試驗(yàn)。

1.6分子生物學(xué)和血清型鑒定

1.6.1分子生物學(xué)鑒定將分離純化的細(xì)菌接種于2%牛血清肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，煮沸法提取分離菌株的基因組DNA。以綠膿桿菌16SrRNA（GenBank登錄號(hào)為NR_118644.1）設(shè)計(jì)引物，上游引物為 5'-GGGGGATCTTCGGACCTC-3'；下游引物為5'-TCCTTAGAGTGCCCACCC-3'，引物由上海生物工程有限公司合成，目的片段大小為956bp。反應(yīng)體系 為25 μL：Buffer2.5μL、dNTP2μL、上下游引物各1μL、模板1μL、rTaq0.5μL、去離子水補(bǔ)齊。程序?yàn)?5℃5min；95℃1min、55℃1min、72℃1min，循環(huán)35次；72℃10min。進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳。同時(shí)，PCR產(chǎn)物送測(cè)序。

1.6.2血清型鑒定用綠膿桿菌分型用標(biāo)準(zhǔn)血清進(jìn)行血清型檢測(cè)，進(jìn)一步篩選不同血清型的綠膿桿菌。操作步驟按說明書進(jìn)行即可?；旄胁×喜蛔鲞M(jìn)一步篩選。

1.7分離株的半數(shù)致死量試驗(yàn)

1.7.1分離株對(duì)小鼠的半數(shù)致死量試驗(yàn)對(duì)小鼠進(jìn)行半數(shù)致死量（LD50）的測(cè)定，選取健康昆明系小鼠40只，分成4組，每組10只，取10-1～10-4滴度的菌液，滴鼻接種0.1mL/只，觀察7d，記錄各組小鼠死亡情況，按Reed-Muench法計(jì)算LD50

1.7.2分離株對(duì)水貂的半數(shù)致死量試驗(yàn)對(duì)水貂進(jìn)行LD50測(cè)定，選取健康水貂20只，分成4組，分離株菌液進(jìn)行10倍倍比稀釋，選取原倍至10-3滴度，滴鼻接種水貂，0.2mL/只，觀察7d，記錄各組水貂的死亡情況，按Reed-Muench法計(jì)算LD50。

2　結(jié)果

2.1分離株的分離培養(yǎng)

對(duì)三份病料中的致病菌分別分離培養(yǎng)，僅一份病料初步分離出疑似陽性菌。

2.2形態(tài)、生化特性及培養(yǎng)特性

對(duì)分離株進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果表明，該分離株符合綠膿桿菌的形態(tài)、生化及培養(yǎng)特性，在2%牛血清肉湯瓊脂平板上生長(zhǎng)形態(tài)正常，革蘭氏染色為陰性桿菌；氧化酶試驗(yàn)為陽性；2%牛血清肉湯培養(yǎng)基呈黃綠色渾濁、10%牛血清肉湯瓊脂平板成黃綠色，菌落形態(tài)正常，在綿羊鮮血瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)菌落周圍出現(xiàn)溶血環(huán)，PDP斜面上生長(zhǎng)，產(chǎn)綠色素，菌落周圍呈淺綠色。

2.3PCR鑒定及序列分析

以提取的分離株的DNA為模板，在1000bp處擴(kuò)增出1條片段，與預(yù)期結(jié)果相符，表明該分離株為16SrDNA基因陽性；測(cè)序結(jié)果預(yù)期相符，片段大小為956bp，與 GenBank登（錄號(hào)為NR_118644.1）16S rDNA 同源性為99.16%。

2.4血清型鑒定

血清型鑒定結(jié)果為，生理鹽水空白對(duì)照組不凝集，血清G型凝集，為血清G型陽性。

2.5分離株半數(shù)致死量的測(cè)定結(jié)果

分離株對(duì)小鼠的 LD50為1.17×106CFU，結(jié)果（見表1）；分離株對(duì)2～5月齡水貂LD50為1.5×108CFU，結(jié)果（見表2）。

3　結(jié)論與討論

本研究從疑似出血性肺炎水貂肺臟中分離一株血清G型綠膿桿菌，我國(guó)于上世紀(jì)80年代初首次報(bào)道了水貂出血性肺炎病例，此后相繼有該病報(bào)道，調(diào)查發(fā)現(xiàn)我國(guó)各地水貂出血性肺炎以G型為主，其次是B型和C型。G型菌株流行情況為60%～80%不等，由于各血清型之間無交叉保護(hù)，因此制備的單苗具有可針性［2，3］。

本研究病料分離率偏低，分析原因可能與病料運(yùn)輸與保存有關(guān)，提示病料采集后應(yīng)盡快進(jìn)行分離；白雪等對(duì)2011年分離出的2株G型貂源綠膿桿菌進(jìn)行LD50測(cè)定，結(jié)果為對(duì)水貂的LD50分別為 2×106CFU和 5×106CFU，對(duì)小鼠的 LD50分別為3.38×106CFU和8×106CFU［4］，對(duì)水貂的毒力高于本實(shí)驗(yàn)1.5× 108CFU的結(jié)果，對(duì)小鼠的毒力低于本實(shí)驗(yàn)1.17×106，這與計(jì)算、攻毒方法以及分離株來源等均具有一定的關(guān)系?！觯ň庉嫞黑w曉松）

表1　分離株對(duì)小鼠LD50結(jié)果

表2　分離株對(duì)2～5月齡水貂LD50結(jié)果

［1］ 陸承平.獸醫(yī)微生物學(xué)［M］.3版.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2002:274-275.

［2］ 戴秀美，張永兵，惠涌泉，等.水貂源綠膿桿菌的分離鑒定及致病性試驗(yàn)［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2014，35（8）:126-129.

［3］ 劉德福，趙燕，劉超.水貂暴發(fā)出血性肺炎的診治報(bào)告 ［J］.畜牧獸醫(yī)雜志，2003，22（4）:47-48.

［4］ 白雪，柴秀麗，閆喜軍.水貂出血性肺炎流行病學(xué)調(diào)查及銅綠假單胞菌疫苗研究進(jìn)展［J］.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2011（15）: 317-318.

Isolation and Identification ofPseudomonasAeruginpsa From theMinks

Yang Peng-xin，Liu Ke-shu，Zhang Chun-yuan，W ang Bin
（Harbin pharmaceutical group bio-vaccine Co.，Ltd.，Harbin HeiLongjiang 150069）

To identify abacterium isolation from themink，the isolatewas investigated through themorphology，biochemical character，cultural character，molecular biology，serotype identification，and LD50test.The results showed that Pseudomonas aeruginosa（P.aeruginosa）type G was isolated from the lung of a dead mink from Dalian of Liaoning Province.The isolate had 99.16%similaritywith P.aeruginosabased on 16SrRNA sequence. The results of LD50testwas 1.17×106CFU formice and 1.5×108CFU formink by using the Reed-Muench calaulationmethod.

Pseudomonasaeruginpsa；Isolation and identification；LD50test；Minks

10.3969/j.issn.1008-4754.2016.9.047