離子色譜保留模型同時(shí)檢驗(yàn)果汁中7種有機(jī)酸

呂洪鳳 崔梅蕾

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離子色譜保留模型同時(shí)檢驗(yàn)果汁中7種有機(jī)酸

呂洪鳳?崔梅蕾

中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院, 北京 100083; ?E-mail: hongfen@cau.edu.cn

離子色譜是檢測(cè)果汁內(nèi)有機(jī)酸的重要辨別法, 但需要反復(fù)試驗(yàn)以確定最優(yōu)色譜條件。為縮短時(shí)間、降低成本, 首次將離子色譜保留模型應(yīng)用于果汁有機(jī)酸的分析中, 在理論和實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的情況下提出優(yōu)化模型, 隨后確立該模型分析果汁內(nèi)7種有機(jī)酸的最優(yōu)色譜條件。在該條件下, 對(duì)蘋果汁中常見的7種有機(jī)酸進(jìn)行檢測(cè), 對(duì) 3 種不同的蘋果汁進(jìn)行分析, 驗(yàn)證了該方法的精準(zhǔn)性和適用性。研究結(jié)果可為果汁內(nèi)有機(jī)酸的檢測(cè)提供一定的理論支撐。

保留模型; 有機(jī)酸; 果汁; 離子色譜

水果的種類、產(chǎn)地、新鮮程度都會(huì)影響果汁的有機(jī)酸組成及含量, 因此對(duì)果汁中有機(jī)酸的檢測(cè)不僅有助于鑒別果汁的真?zhèn)? 還能區(qū)分果汁原料的優(yōu)劣[1]。測(cè)定果汁中有機(jī)酸的方法有很多, 包括光譜法、酶法、色譜法、毛細(xì)管電泳法等。其中, 離子色譜法因具有準(zhǔn)確性高、選擇性好、分離快速等優(yōu)點(diǎn), 在果汁有機(jī)酸的檢測(cè)中發(fā)揮著越來越重要的作用。

由于淋洗條件的設(shè)置多依靠反復(fù)試驗(yàn), 使得離子色譜的應(yīng)用受到一定的限制[2], 而離子色譜保留模型可以很好地解決這一問題[3]。在單一淋洗液的情況下, 常用的保留模型有 LSSM, EEPM 和 Dry-Lab 等[3–4]。傅厚暾等[5]對(duì)礦物質(zhì)離子的離子色譜分離進(jìn)行計(jì)算機(jī)模擬; Karu 等[6–7]利用等度和梯度保留模型, 對(duì)藥物中的大分子有機(jī)酸在離子色譜中的保留行為做了一系列研究。但是, 尚未見到離子色譜保留模型在小分子有機(jī)酸分離中的應(yīng)用。

本研究選擇單一淋洗液, 首次將離子色譜保留模型應(yīng)用于果汁中有機(jī)酸的分析, 在優(yōu)化的等度模型下, 得到線性梯度模型所需的參數(shù), 并依據(jù)線性梯度模型對(duì)保留時(shí)間的預(yù)測(cè), 結(jié)合重復(fù)實(shí)驗(yàn), 確立最優(yōu)色譜條件。在該條件下, 對(duì)蘋果汁中常見的7 種有機(jī)酸進(jìn)行檢測(cè), 并對(duì)3種不同的蘋果汁進(jìn)行分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

“寇老西”牌蘋果醋(248 mL 裝), “匯源”牌百分百蘋果汁(200 mL 裝), “都樂”牌百分百果汁(250 mL裝), 以上果汁均購(gòu)于某大型超市。

奎寧酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸、富馬酸、檸檬酸、抗壞血酸標(biāo)樣。其中, 奎寧酸(純度為98%)、乳酸(純度為85%)、蘋果酸(純度為99%)、富馬酸(純度為 99%)均購(gòu)自百靈威, 酒石酸、檸檬酸、抗壞血酸均為優(yōu)級(jí)純, 購(gòu)自國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)信息中心。50%氫氧化鈉溶液購(gòu)自 Sigma。去離子水由Milli-Q超純水系統(tǒng)產(chǎn)生, 電阻率為18.2MΩ·cm。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

Dionex ICS 3000 離子色譜儀配有AS11-HC分離柱和AG11-HC保護(hù)柱、ASRS-ULTRA 4-mm抑制器、電導(dǎo)檢測(cè)器、Chromeleon (版本為6.5)色譜工作站、Pesticarb SPE 小柱(200 mg/3 mL)(天津博納艾杰爾科技有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟

1.2.1 10種有機(jī)酸分離的等度和梯度實(shí)驗(yàn)方法

本部分實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證等度和梯度實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?詳見2.1.1 和 2.1.2 節(jié))在離子色譜檢測(cè)有機(jī)酸過程中的適用性, 進(jìn)行 10 種有機(jī)酸分離的等度實(shí)驗(yàn)和梯度實(shí)驗(yàn), 并與重復(fù)實(shí)驗(yàn)相結(jié)合, 確定摸索最優(yōu)色譜條件的方法。綜合考慮價(jià)態(tài)和疏水性等因素, 本實(shí)驗(yàn)選取果汁中相對(duì)含量較高的 10 種有機(jī)酸(奎寧酸、乙酸、乳酸、琥珀酸、蘋果酸、酒石酸、草酸、富馬酸、檸檬酸和抗壞血酸)。

1) 配制淋洗液。

取50%的氫氧化鈉液體5.2~5.3 mL, 加入儲(chǔ)液罐, 并用去離子水定容至1 L, 即配制成濃度為100 mmol/L (誤差小于2%)的淋洗液。溶液配好后, 將儲(chǔ)液罐放入超聲器中超聲脫氣 30 分鐘, 之后充入氮?dú)? 以排除淋洗液中的CO2等氣體。

2) 配制標(biāo)準(zhǔn)溶液。

用萬分之一電子天平準(zhǔn)確稱取奎寧酸、乙酸、乳酸、琥珀酸、蘋果酸、酒石酸、草酸、富馬酸、抗壞血酸各0.1 g, 檸檬酸0.2 g, 用去離子水分別定容至100 mL容量瓶中, 即為1000 mg/L (檸檬酸為2000 mg/L)的母液。

用移液腔吸取 0.1 mL 母液至 10 mL 比色管中, 并用去離子水定容, 即為 10 mg/L 工作液。將工作液倒入自動(dòng)進(jìn)樣器小瓶中(工作液的液面高度需超過小瓶高度的 1/2, 以保證進(jìn)樣針能進(jìn)樣), 置于自動(dòng)進(jìn)樣器中。穩(wěn)定儀器。

3)編寫淋洗條件程序、進(jìn)樣分析。

通過編寫淋洗條件程序控制淋洗條件。每次開機(jī)后, 儀器需穩(wěn)定半小時(shí), 穩(wěn)定后自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣, 每次進(jìn)樣前先走一針(25μL)去離子水, 以穩(wěn)定系統(tǒng)。進(jìn)入編輯界面, 導(dǎo)出色譜圖, 并記錄保留時(shí)間(即出峰時(shí)間)和死時(shí)間(水負(fù)峰的出峰時(shí)間)。

1.2.2 確立最優(yōu)色譜條件

通過等度模型的建立, 可以確定各有機(jī)酸在不同淋洗液濃度下的保留時(shí)間。運(yùn)用等度模型得到的數(shù)據(jù)建立不同酸的梯度模型, 可以估算不同有機(jī)酸在線性梯度條件下保留時(shí)間, 結(jié)合重復(fù)實(shí)驗(yàn), 可得到分離有機(jī)酸的最優(yōu)色譜條件。利用上述方法確定的最優(yōu)色譜條件, 對(duì)蘋果汁中常見的7種有機(jī)酸進(jìn)行檢測(cè)。

配制奎寧酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸、富馬酸、抗壞血酸和檸檬酸7種有機(jī)酸的標(biāo)準(zhǔn)混合液及果汁樣品溶液。將有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)混合液各7個(gè)濃度梯度進(jìn)行色譜分離, 以各種有機(jī)酸的峰高–濃度和峰面積–濃度分別制作標(biāo)準(zhǔn)曲線, 求出回歸方程。在相同的色譜條件下, 將果汁樣品色譜圖與有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)混合液的色譜圖進(jìn)行對(duì)照, 根據(jù)保留時(shí)間確定果汁樣品中的各種有機(jī)酸, 并測(cè)定峰高或計(jì)算峰面積, 將有機(jī)酸峰高的響應(yīng)值或峰面積的積分值代入各自的回歸方程, 求出其濃度。得到淋洗液為 NaOH 溶液、流速為 1.0 mL/min、進(jìn)樣量為 25 μL 情況下的最優(yōu)離子色譜條件(梯度程序), 如表 1 所示。

表1 實(shí)驗(yàn)中的最優(yōu)離子色譜條件

2 結(jié)果與討論

2.1 確立理論模型

保留模型可用于離子色譜法檢測(cè)無機(jī)陰離子時(shí)的保留時(shí)間預(yù)測(cè), 但未見應(yīng)用于小分子有機(jī)酸的報(bào)道。本研究首次將離子色譜的等度保留模型和梯度保留模型成功地運(yùn)用于檢測(cè)果汁中的有機(jī)酸, 系統(tǒng)列出各保留模型的建立過程, 并對(duì)該過程中數(shù)據(jù)點(diǎn)的選取、公式的數(shù)學(xué)處理等問題進(jìn)行詳細(xì)的分析。

2.1.1 等度模型簡(jiǎn)介

1) LSSM模型。

主要用于淋洗液為單一組分的情況(如以NaOH或Na2CO3為淋洗液時(shí)):

下角標(biāo) i 表示等度(isocratic)條件;為容量因子,=(R-M)/M;R為保留時(shí)間,M為死時(shí)間;為被測(cè)離子所帶電荷數(shù),為淋洗液離子所帶電荷數(shù);為淋洗液中競(jìng)爭(zhēng)離子 E-(本文中為 OH-)的濃度;A,E為被測(cè)離子 A-和E-的離子交換選擇系數(shù);為固定相的離子交換容量;為固定相的質(zhì)量;m為柱中淋洗液的體積。

對(duì)某種被測(cè)離子, 當(dāng)淋洗液組成和固定相一定時(shí),,,A,E,,和m均為固定值, 因此式(1)可簡(jiǎn)化為

其中i為常數(shù)。

2) EEPM模型。

EEPM 模型是在 LSSM 模型的基礎(chǔ)上得出的, 與LSSM模型的區(qū)別在于, LSSM模型中的/為理論值, EEPM模型中i為實(shí)驗(yàn)值。

i和i均為常數(shù), 可由實(shí)驗(yàn)獲得。

3) Drylab模型。

Drylab 是一個(gè)商業(yè)化的 HPLC 優(yōu)化和模擬軟件, 也可用于 IC 中單一淋洗液的情況。這種情況下的模型為

其中,和均為常數(shù)。

本實(shí)驗(yàn)對(duì) 3 種保留模型在 10 種小分子有機(jī)酸分析中的表現(xiàn)做出評(píng)價(jià), 并選出最合適的模型用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的預(yù)測(cè)。

2.1.2 梯度模型介紹

梯度模型均由 LSSM 模型衍生出來, 主要表達(dá)式為

式中, 下角標(biāo)g 表示梯度(gradient),為容量因子,g為被測(cè)物的保留時(shí)間,為淋洗梯度的斜率(單位為 mmol/L/min),g為與淋洗液組成和固定相相關(guān)的常數(shù)。

被測(cè)物保留時(shí)間相應(yīng)可由式(6)得到:

0為死時(shí)間;為淋洗液的流速;為標(biāo)準(zhǔn)化的梯度斜率,=/, 單位為 mmol/L/mL;為梯度形狀的調(diào)整參數(shù)(線性梯度時(shí)= 1);s為梯度淋洗開始時(shí)淋洗液的濃度;i和i均為常數(shù), 可由等度條件實(shí)驗(yàn)獲得。

該梯度模型只能用于線性梯度淋洗的條件下, 對(duì)于混合梯度淋洗的情況無法直接進(jìn)行預(yù)測(cè)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)該模型在小分子有機(jī)酸預(yù)測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)行研究和分析。

2.1.3 等度淋洗模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果

綜合考慮價(jià)態(tài)和疏水性等因素, 本實(shí)驗(yàn)選取果汁中相對(duì)含量較高的 10 種有機(jī)酸(奎寧酸、乙酸、乳酸、琥珀酸、蘋果酸、酒石酸、草酸、富馬酸、檸檬酸和抗壞血酸)。以不同濃度(4~40 mmol/L)的NaOH為淋洗液, 在淋洗液流速為1 mmol/L/min時(shí)得到 10 種有機(jī)酸在不同淋洗液濃度[OH]下對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間R。死時(shí)間為 2.80 分鐘。以淋洗液濃度[OH]為橫坐標(biāo), 保留時(shí)間R為縱坐標(biāo)時(shí), 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)點(diǎn)呈拋物線分布。由于死時(shí)間0與[OH]無關(guān), 因此采用i(i=(R-0)/0)表征時(shí)間量, 可以得到更好的擬合優(yōu)度。以log[OH]為橫坐標(biāo), logi為縱坐標(biāo), 對(duì)奎寧酸、乙酸、乳酸 3 種酸分別做對(duì)數(shù)擬合, 擬合優(yōu)度分別為0.99936, 0.99948和0.99947。可知, 擬合優(yōu)度較高, 可以很好地預(yù)測(cè)不同濃度淋洗液的保留時(shí)間。

以奎寧酸和乙酸為例, 討論計(jì)算點(diǎn)的選取。在奎寧酸的 LSSM 模型下, 以不同的濃度為參考值(即0.00%所在位置), 求出logi=-log[OH]中的待定系數(shù), 用所得公式求出預(yù)測(cè)的保留時(shí)間R,pred, 計(jì)算用來表征保留時(shí)間的預(yù)測(cè)值R,pred與實(shí)驗(yàn)值R,act比較結(jié)果的誤差(%):

= (R,pred-R,act)/(R,pred+R,act) × 2 × 100% 。

從結(jié)果可知, 各系列點(diǎn)的分布趨勢(shì)大致相同。當(dāng)參考點(diǎn)取[OH]為 18, 16 和 14 mmol/L 時(shí), 偏離0.00%較遠(yuǎn);取 10 和 8mmol/L時(shí), 偏離0.00%較近。

在乙酸的LSSM模型下, 進(jìn)行相同的數(shù)據(jù)處理。對(duì)各系列點(diǎn)分別求和后, 可得取[OH]為 10 mmol/L 時(shí), 所得和最小, 即偏離 0.00%最近。由的定義可知, 對(duì)于乙酸, 取 10 mmol/L 的 [OH]濃度為參考點(diǎn)時(shí), 實(shí)驗(yàn)的誤差最小。

對(duì)以上兩種酸的分析可得, 取不同的[OH]濃度為參考點(diǎn)時(shí), 保留時(shí)間預(yù)測(cè)值不同, 相應(yīng)地, 會(huì)得到相同趨勢(shì)的分布, 但是對(duì)0.00%偏差最小的值所在位置不同。為方便起見, 統(tǒng)一取 6 mmol/L點(diǎn)作為參考點(diǎn)。

2.1.4 等度模型計(jì)算方法(以奎寧酸為例)

1) 根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù), 計(jì)算調(diào)整保留時(shí)間(其中0為死時(shí)間, 在本實(shí)驗(yàn)中為 2.80 min), 容量因子i(i= (R,act-0)/0), 并對(duì)[OH]和i取對(duì)數(shù)(見表2)。

表2 奎寧酸的等度模型數(shù)據(jù)

2) 以log[OH]為橫坐標(biāo), logi為縱坐標(biāo), 對(duì)數(shù)據(jù)點(diǎn)進(jìn)行線性擬合?？傻玫綌M合方程=0.8404-1.12373, 擬合優(yōu)度2為0.99936。

3) 以[OH]為6mmol/L時(shí)的數(shù)據(jù)為計(jì)算點(diǎn),求出LSSM模型的表達(dá)式為

logi= 0.4924-log[OH],

根據(jù)此表達(dá)式求出不同濃度[OH]下, 保留時(shí)間的預(yù)測(cè)值(R,pred), 并與實(shí)驗(yàn)值(R,act)進(jìn)行比較。以[OH]為 6 mmol/L 和 10 mmol/L 的數(shù)據(jù)為計(jì)算點(diǎn), 求出 EEPM 模型的表達(dá)式為

logi= 0.5826-1.1159log[OH],

并根據(jù)此表達(dá)式求出不同濃度[OH]下保留時(shí)間的預(yù)測(cè)值(R,pred), 與實(shí)驗(yàn)值(R,act)進(jìn)行比較。以[OH]為6, 10和16 mmol/L的數(shù)據(jù)為計(jì)算點(diǎn), 求出DryLab模型的表達(dá)式為

logi=0.5392-1.0167log[OH]-0.0558(log[OH])2,

根據(jù)此表達(dá)式求出不同濃度[OH]下, 保留時(shí)間的預(yù)測(cè)值(R,pred), 并與實(shí)驗(yàn)值(R,act)進(jìn)行比較。

最終結(jié)果見表3。

表3 LSSM, EEPM和 DryLab 3種模型誤差比較

說明: 誤差=(R,pred-R,act)/(R,pred+R,act)×2×100%, 百分比誤差=(|R,pred-R,act|/R,pred×100%),R,pred為保留時(shí)間的預(yù)測(cè)值,R,act為實(shí)驗(yàn)值。

通過考察LSSM, EEPM和DryLab 3種等度保留模型實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值之間的偏差, 可知 DryLab的準(zhǔn)確性最好, EEPM 的準(zhǔn)確性比 DryLab 稍差, LSSM 的準(zhǔn)確性最差。但是, 要得到模型中的參數(shù), DryLab 需要的實(shí)驗(yàn)次數(shù)最多, EEPM 次之, LSSM最少。因此, 綜合考慮實(shí)驗(yàn)規(guī)模和模型的準(zhǔn)確性, 對(duì)果汁中 10 種常見有機(jī)酸進(jìn)行預(yù)測(cè)時(shí)采用EEPM。該結(jié)論與 Madden 等[4]利用這3種模型在AS11柱中檢測(cè)21種無機(jī)陰離子時(shí)所得的結(jié)論一致。在OH-做淋洗因子時(shí), 小分子有機(jī)酸與無機(jī)陰離子在離子交換柱上的保留特性相似, 因此該結(jié)論可推廣至其他樣品中的小分子有機(jī)酸和無機(jī)陰離子的同時(shí)檢測(cè)。

2.1.5 梯度淋洗模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1) 色譜圖及有機(jī)酸的選取。

由于梯度模型只適合于線性梯度下的狀況, 因此接下來選取一個(gè)線性條件下有機(jī)酸的色譜圖, 以其中蘋果酸、酒石酸、抗壞血酸和富馬酸在梯度淋洗時(shí)的預(yù)測(cè)保留時(shí)間和實(shí)驗(yàn)保留時(shí)間的對(duì)比來說明該保留模型在本實(shí)驗(yàn)中的有效性, 并說明該模型的計(jì)算方法。

圖 1 為 4 種有機(jī)酸在梯度淋洗下的色譜圖。色譜條件: 流速1 mL/min, 抑制電流50 mA。梯度條件: NaOH 濃度在 0 分鐘時(shí)為 12.0 mmol/L, 在25分鐘時(shí)為 23.6 mmol/L。

2) 梯度模型的計(jì)算方法(以蘋果酸為例)。

由色譜圖和梯度程序可知, 死時(shí)間為 2.80 分鐘,淋洗液的流速為 1.0 mL/min, 淋洗液初始濃度為 12.0 mmol/L, 最終濃度為 23.6 mmol/L。根據(jù)梯度模型的計(jì)算方法可知: 淋洗液的流速= 1.0 mL/ min, 淋洗梯度的斜率= 0.48 mmol/L/min, 標(biāo)準(zhǔn)化的梯度斜率= 0.48 mmol/L/mL, 梯度形狀的調(diào)整參數(shù)= 1。

由等度部分?jǐn)?shù)據(jù)處理可知, 在等度條件下(流速為1.0mL/min時(shí)), 蘋果酸的EEPM模型可計(jì)算的保留時(shí)間為

R,pred=1×{(1/0.48)×[(2.1942+1)×0.48×(103.1573)×

2.80×1.0+12(2.1942+1)](1/3.1942)- 12/0.48} +

2.80

=13.7913 (min),

即在圖 1 所示的梯度條件下, 利用線性梯度模型, 計(jì)算出蘋果酸的保留時(shí)間為 13.7913 分鐘。

用上述方法同樣處理酒石酸、富馬酸和抗壞血酸, 所得梯度模型誤差數(shù)據(jù)如表4所示。

表4 梯度模型誤差

由百分比誤差可知, 該梯度模型對(duì)有機(jī)酸在色譜柱AS11-HC中進(jìn)行梯度淋洗時(shí)的保留時(shí)間進(jìn)行預(yù)測(cè)時(shí), 有良好的表現(xiàn)。因此, 可根據(jù)預(yù)測(cè)的保留時(shí)間進(jìn)行梯度的設(shè)計(jì)和優(yōu)化, 能大大減少實(shí)驗(yàn)次數(shù)、縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間。

對(duì)于等度淋洗和線性梯度淋洗, 可以直接運(yùn)用保留模型對(duì)有機(jī)酸離子的保留行為進(jìn)行預(yù)測(cè); 對(duì)于非線性梯度淋洗, 采用模型與反復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)合的方法摸索最優(yōu)色譜條件, 可以減少實(shí)驗(yàn)次數(shù)。該研究可以簡(jiǎn)化離子色譜檢測(cè)有機(jī)酸的實(shí)驗(yàn)過程, 并為計(jì)算機(jī)模擬小分子有機(jī)酸在離子色譜柱中的保留行為提供理論依據(jù)。

2.2 最優(yōu)色譜條件

將有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)混合液各濃度梯度進(jìn)行色譜分離, 以各種有機(jī)酸的峰高–濃度和峰面積–濃度分別制作標(biāo)準(zhǔn)曲線, 求出回歸方程。在相同的色譜條件下, 將樣品色譜圖與有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)混合液的色譜圖進(jìn)行對(duì)照, 根據(jù)保留時(shí)間確定樣品中的各種有機(jī)酸, 并測(cè)定峰高或計(jì)算峰面積, 將有機(jī)酸峰高的響應(yīng)值或峰面積的積分值代入各自的回歸方程, 求出其濃度。

2.2.1 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線

1) 峰高–濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

以乳酸為例, 從色譜工作站中, 可以讀出不同濃度(0.1, 1, 10, 20, 30, 40 mg/L)條件下乳酸峰形圖各峰高的響應(yīng)值, 分別為0.0688, 0.3128, 2.8489, 5.4103, 7.8501, 10.7889 μS。以乳酸溶液的濃度(mg/L)為, 峰高的響應(yīng)值(μS)為, 做線性擬合, 可求出回歸方程和相關(guān)系數(shù)。對(duì)不同濃度的其他各有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)樣, 進(jìn)行色譜分離, 以峰高對(duì)濃度作圖, 求出回歸方程和相關(guān)系數(shù)(見表 5)。由回歸分析可知,在進(jìn)樣范圍內(nèi), 各酸的線性關(guān)系良好。

表5 7種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液峰高–濃度峰形圖的回歸分析

2) 峰面積–濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

與步驟 1 相類似, 得到峰面積–濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線, 回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表 6。由表 6 可知,在進(jìn)樣范圍內(nèi), 除酒石酸外, 其他酸的線性關(guān)系良好。

表6 7種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積–濃度峰形圖的回歸分析

2.2.2 對(duì)果汁中7種有機(jī)酸的檢驗(yàn)

1) 保留時(shí)間的重復(fù)性。

用確定的色譜條件對(duì)有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)混合溶液進(jìn)樣, 進(jìn)行 5 次重復(fù)試驗(yàn), 記錄其保留時(shí)間, 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析, 求出平均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù) CV 結(jié)果見表 7?？梢? 7 種有機(jī)酸保留時(shí)間的標(biāo)準(zhǔn)差在0.007~0.115 之間, 變異系數(shù)(CV)在 0.06%~0.32%之間, 表明在確定的色譜條件下, 有機(jī)酸的保留時(shí)間基本恒定, 本方法具有很好的重復(fù)性。

表7 保留時(shí)間的重復(fù)性

2) 樣品的重復(fù)性。

為考察方法的重復(fù)性, 對(duì)同一試樣(都樂 100%純果汁)進(jìn)行3次平行測(cè)定, 記錄每種酸的峰高, 利用峰高–濃度回歸方程計(jì)算每種酸的濃度, 并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析, 求出平均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù) CV, 分析結(jié)果見表 8。由表 8 可知, 該試樣中檢測(cè)出 5種有機(jī)酸, 這 5 種有機(jī)酸含量的標(biāo)準(zhǔn)差在0.02~ 0.09 之間, 除富馬酸外, 變異系數(shù) CV 在0.14%~ 0.79%之間。由于富馬酸的含量微小, 影響了該有機(jī)酸分析結(jié)果的精密度。該實(shí)驗(yàn)表明, 除富馬酸外, 分析結(jié)果的重復(fù)性好, 精密度高。

表8 樣品的重復(fù)性

說明: —表示未檢出。

3) 回收率實(shí)驗(yàn)。

取匯源 100%蘋果汁樣品兩份, 其中一份作為本底, 另外一份添加一定量的有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)混合液后測(cè)定各組分的含量, 考察測(cè)定方法的回收率。

取 100 mg/L的混合酸標(biāo)樣0.3 mL置于比色管中, 定容至 10 mL, 即成為 3 mg/L 的混標(biāo), 取1 mL蘋果汁原汁放入其中混合; 另一個(gè)比色管中放入10 mL去離子水, 取1 mL蘋果汁原汁放入其中混合, 作為本底。每份樣品進(jìn)行 3 次平行測(cè)定, 考察測(cè)定方法的回收率。結(jié)果如表 9 所示, 所有有機(jī)酸的回收率都在96%以上, 比較理想。說明該方法的分析結(jié)果重現(xiàn)性好, 精密度高, 在該色譜條件下對(duì)果汁中的有機(jī)酸含量進(jìn)行定量分析結(jié)果可靠。

表9 有機(jī)酸回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4) 對(duì)果汁的定量分析。

取“寇老西”牌蘋果醋(248 mL 裝), “匯源”牌百分百蘋果汁(200 mL裝), “都樂”百分百果汁(250 mL 裝) 3種蘋果汁進(jìn)行有機(jī)酸的測(cè)定。結(jié)果見表 10。從表 10 可知, 利用本文提出的優(yōu)化模型和分析果汁標(biāo)準(zhǔn)樣內(nèi)7種有機(jī)酸的最優(yōu)色譜條件, 可以同時(shí)檢測(cè)到果汁中的4~5種有機(jī)酸。除蘋果汁外, 可推廣至其他果汁的有機(jī)酸分析。

表10 果汁中有機(jī)酸含量的定量分析

注: —表示未檢出。

2.2.3 對(duì)果汁樣品的前處理

先將Pesticarb PC2003 SPE小柱預(yù)先用去離子水潤(rùn)洗5分鐘, 然后用甲醇活化15分鐘, 最后用去離子水以 1 mL/min 的速度沖洗 5 分鐘, 將甲醇沖洗干凈。

量取果汁樣品約 20 mL 置于比色管中。用注射器取 2 mL 樣品注入 SPE 小柱中, 控制流速為 1 mL/min, 使樣品緩慢流過小柱, 重復(fù)該過程, 收集洗脫液于比色管中備用(前 3~4 mL 拋棄)。將洗脫液稀釋 10 倍供測(cè)定。處理前后的果汁顏色差異很大, 說明色素成分去除比較徹底, 可以進(jìn)行離子色譜檢測(cè)。

3 結(jié)論

本研究首次將離子色譜的等度保留模型和梯度保留模型成功地運(yùn)用于檢測(cè)果汁中的有機(jī)酸。對(duì)于等度淋洗和線性梯度淋洗, 可以直接運(yùn)用保留模型對(duì)有機(jī)酸離子的保留行為進(jìn)行預(yù)測(cè); 對(duì)于非線性梯度淋洗, 采用模型與反復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)合的方法摸索最優(yōu)色譜條件, 可以減少實(shí)驗(yàn)次數(shù)。本研究可以簡(jiǎn)化離子色譜檢測(cè)有機(jī)酸的實(shí)驗(yàn)過程, 并為計(jì)算機(jī)模擬小分子有機(jī)酸在離子色譜柱中的保留行為提供理論依據(jù)。本研究只對(duì)蘋果汁進(jìn)行了分析, 可推廣至其他果汁的有機(jī)酸分析。

致謝 感謝清華大學(xué)分析中心在實(shí)驗(yàn)中給予的大力協(xié)助。

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Determination of Seven Organic Acids in Juice by Retention Model in Ion Chromatography

Lü Hongfeng?,CUI Meilei

College of Science, China Agricultural University, Beijing 100083; ?E-mail: hongfen@cau.edu.cn

Optimal chromatography condition can be obtained via time-consuming experiments. To simplify it, an improved retention model assisting experiments optimum are developed and the separating conditions of seven organic acids in juice are established. The retention behaviors of organic acids on AS11-HC analytical columns are analyzed. It is found that the gradient model performs well for linear gradient elution while it should be assisted with a trial-and-error optimization for nonlinear gradient elution.

retention model; organic acids; juice; ion chromatography

10.13209/j.0479-8023.2016.036

O661

2015-04-14;

2015-07-30; 網(wǎng)絡(luò)出版日期: 2016-05-09

國(guó)家自然科學(xué)基金(11474355, 60977057)和中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)URP項(xiàng)目資助