• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    番茄獨腳金內(nèi)酯合成關(guān)鍵基因CCD7、CCD8 RNA沉默載體的構(gòu)建

    2017-03-18 15:05:37田芳姚兆群陳美秀徐瑛趙思
    湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2016年21期
    關(guān)鍵詞:內(nèi)酯串聯(lián)克隆

    田芳++姚兆群++陳美秀++徐瑛++趙思峰

    摘要:根據(jù)已知的番茄(Lycopersicon esculentum Mill.)CCD7和CCD8基因的序列設(shè)計特異性引物,采用RT-PCR克隆CCD7和CCD8基因片段,通過特定酶切將2個基因進行拼接,再將串聯(lián)基因以反向重復(fù)的方式連入pUCCRNAi載體,并定向插入到p35植物表達載體上。結(jié)果表明,克隆獲得了大小約為400 bp的CCD7和CCD8基因片段,基因片段拼接后獲得800 bp左右的串聯(lián)片段CCD7-8;將該基因片段插入pUCCRNAi載體后得到1 700 bp大小的含Intron的反向重復(fù)序列In-7-8,并成功插入到植物表達載體p35中,通過酶切分析,RNAi載體構(gòu)建正確。最終成功構(gòu)建了番茄CCD7和CCD8 2個串聯(lián)基因的RNA沉默表達載體p35-In-7-8。

    關(guān)鍵詞:番茄(Lycopersicon esculentum Mill.);獨腳金內(nèi)酯;列當(dāng);類胡蘿卜素裂解雙加氧酶7(CCD7)和8(CCD8);RNA沉默載體

    中圖分類號:Q78 文獻標(biāo)識碼:A 文章編號:0439-8114(2016)21-5668-04

    DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.21.058

    Construction of Strigolactones Key Genes CCD7、CCD8 of

    Tomato RNA Silencing Expression Vector

    TIAN Fang, YAO Zhao-qun, CHEN Mei-xiu, XU Ying, ZHAO Si-feng

    (Key Laboratory of Universities of Xinjiang Uygur Autonomous Region for Oasis Agricul-tural Pest Management and Plant Protection Resource Utilization /College of Agriculture, Shihezi Uni-versity, Shihezi 832003, Xinjiang, China)

    Abstract: In order to construct tomato(Lycopersicon esculentum Mill.) carotenoid cleavage dioxygense 7(CCD7) and 8 (CCD8) RNA silencing expression vector, the specific primers were designed according to the published sequence of tomato CCD7 and CCD8. The CCD7 and CCD8 fragments were obtained by RT-PCR amplification,then they were concatenated through specific enzyme digestion,and cloned into pUCCRNAi vector in a inverted repeat manner,finally inserted into p35 plant expression vector. Results show that we cloned about 400 bp CCD7 and CCD8 gene fragment,respectively. The concatenation gene CCD7-8 of 800 bp was constructed by gene fragment splicing. Two copies of CCD7-8 gene was inserted into pUCCRNAi vector and got 1 700 bp contain Introns inverted repeat sequence In-7-8. Then they were inserted into p35 vector successfully and the RNAi vector was constructed correctly by enzyme digestion analysis. Finally successful constructed tomato CCD7 and CCD8 two concatenation genes RNA silencing expression vector p35-In-7-8.

    Key words: tomato(Lycopersicon esculentum Mill.); strigolactones; orobanche; carotenoid cleavage dioxygense 7(CCD7) and 8(CCD8);RNA silencing vector

    列當(dāng)(Orobanche coerulescens Steph.)是一類無葉綠素并以全寄生方式寄生于其他植物根部獲取所需養(yǎng)分的植物,其可寄生在茄科、豆科、菊科、傘形科、葫蘆科等多種重要經(jīng)濟作物上,造成寄主植物減產(chǎn)5%~100%,已在亞洲、歐洲、非洲、南美洲和北美洲的較多國家和地區(qū)發(fā)生,每年給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成的經(jīng)濟損失達數(shù)十億美元[1-3]。人們采用農(nóng)業(yè)、物理、化學(xué)、生物等各項措施防治列當(dāng),均無法完全防治,在列當(dāng)嚴重發(fā)生地區(qū)的農(nóng)民會因為防效和防治成本等問題直接放棄所種作物甚至棄耕土地[4,5]。列當(dāng)靠種子進行繁殖,且種子產(chǎn)生量大,1株成熟植株可產(chǎn)生5萬~50萬粒種子,種子可隨風(fēng)、流水、人為活動等因素快速傳播,可在土壤中存活數(shù)十年,這是列當(dāng)難以防治的重要原因[1,3]。列當(dāng)種子內(nèi)的KAI2蛋白是一個受體蛋白,可感受到寄主植物根系分泌的獨腳金內(nèi)酯類似物的刺激然后誘導(dǎo)列當(dāng)種子萌發(fā)[6],若能減少寄主植物分泌的獨腳金內(nèi)酯或使其不分泌,則有望培育出抗列當(dāng)?shù)募闹髌贩N[7]。Dor等[8]發(fā)現(xiàn)番茄(Lycopersicon esculentum Mill.)突變株SL-ORT1因不能產(chǎn)生獨腳金內(nèi)酯從而對埃及(瓜)列當(dāng)表現(xiàn)出高抗特性;用類胡蘿卜素生物合成途徑抑制劑氟啶草酮處理番茄后,與對照相比,處理番茄植株根系幾乎檢測不到獨腳金內(nèi)酯,同時根際大麻列當(dāng)種子萌發(fā)率減少98%以上[9]。在植物體內(nèi),類胡蘿卜素裂解雙加氧酶7(CCD7)和8(CCD8)是獨腳金內(nèi)酯合成途經(jīng)中最為關(guān)鍵的2個功能基因,可共同作用將β-類胡蘿卜素裂解成獨腳金內(nèi)酯,這2個基因缺失或者沉默,均會導(dǎo)致獨腳金內(nèi)酯合成量下降或不能合成[7,10]。列當(dāng)目前在新疆主要農(nóng)業(yè)區(qū)均有分布,已在加工番茄、甜瓜、向日葵等重要經(jīng)濟作物上造成嚴重損失[3,11]。本研究從番茄上克隆CCD7和CCD8基因,并利用獲得的基因,構(gòu)建RNA沉默載體,為獲得抗列當(dāng)?shù)莫毮_金內(nèi)酯合成量減少的植株提供技術(shù)支撐。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    材料:所用番茄品種為改良毛粉802,將番茄種子用2%的次氯酸鈉消毒后種植于營養(yǎng)土∶蛭石為 1∶1的花盆內(nèi)并置于溫室培養(yǎng),2 d澆1次水,待長到7~8片真葉后將其從花盆中取出,切取根系并用水沖洗干凈,晾干。根據(jù)TRIzol法提取根部RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA備用。

    載體:中間載體pUCCRNAi和植物表達載體p35由石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院黃先忠老師贈送。

    菌株:大腸桿菌DH5α由本實驗室保存。

    主要試劑:pMD18-T Vector、DNA限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶購自TaKaRa公司;質(zhì)粒小量提取試劑盒,凝膠回收試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司;引物合成和基因測序由北京六合華大基因科技有限公司完成。

    1.2 目的基因片段的獲得及驗證

    根據(jù)NCBI上已知番茄CCD7和CCD8基因的序列信息,分別設(shè)計了兩個基因部分片段引物(表1)。為了便于載體的構(gòu)建,在擴增CCD7目標(biāo)片段的上下游引物上分別引入XbaⅠ和StuⅠ酶切位點,在擴增CCD8目標(biāo)片段的上下游引物上分別引入StuⅠ和SalⅠ酶切位點。

    以提取的番茄根部cDNA為共同模板,7-F和7-R為引物,擴增CCD7基因片段;再以8-F和8-R為引物,擴增CCD8基因片段。利用瓊脂糖凝膠電泳分離上述PCR擴增產(chǎn)物,割膠回收目的基因片段并連接于pMD18-T載體上轉(zhuǎn)化培養(yǎng),PCR鑒定為陽性的克隆進行測序驗證。

    1.3 目的片段的串聯(lián)

    將片段CCD7和CCD8分別克隆到pMD18-T載體上,通過PCR篩選目標(biāo)基因片段,分別記作pMD18-T-7和pMD18-T-8。

    用限制性內(nèi)切酶StuⅠ和SalⅠ雙酶切pMD18-T-7;再用StuⅠ和SalⅠ切取CCD8片段,用T4連接酶將片段CCD8連入pMD18-T-7中,并將新得到的克隆命名為pMD18-T-7-8。

    1.4 反向重復(fù)序列在中間載體pUCCRNAi上的構(gòu)建

    1)串聯(lián)片段正向插入pUCCRNAi質(zhì)粒。以pMD18-T-7-8為模板,7-F和8-R為引物,PCR擴增串聯(lián)片段CCD7-8。載體pUCCRNAi和pMD18-T-7-8分別用XbaⅠ和SalⅠ雙酶切后,將串聯(lián)片段正向插入到pUCCRNAi中,記作+pRNAi-7-8。

    2)串聯(lián)片段反向插入pUCCRNAi質(zhì)粒。因為pUCCRNAi質(zhì)粒上XbaⅠ、SalⅠ與SpeⅠ、XhoⅠ分別為同尾酶,所以載體+pRNAi-7-8用SpeⅠ和XhoⅠ雙酶切后,直接將串聯(lián)片段CCD7-8連入+pRNAi-7-8中,新得到的載體記作pRNAi-In-7-8。

    1.5 沉默表達載體的構(gòu)建

    用PstⅠ將pRNAi-In-7-8上包含Intron在內(nèi)的反向重復(fù)序列切下,插入用同樣酶切且已去磷酸化的p35植物表達載體上,篩選轉(zhuǎn)化重組體得到CCD7-8基因的反向重復(fù)植物表達載體p35-In-7-8。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 目的基因片段的獲得及驗證

    以7-F和7-R為引物,獲得的番茄cDNA為模板進行PCR擴增,得到約400 bp大小的目標(biāo)條帶(圖1A);以8-F和8-R為引物、番茄cDNA為模板進行PCR擴增,獲得約400 bp大小的目標(biāo)條帶(圖1B),均與預(yù)計結(jié)果接近。PCR產(chǎn)物與pMD-18-T載體連接后,挑選單克隆進行測序。將測得的序列登陸NCBI進行Blast比對。通過MEGA5.05軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。CCD7的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2 A)顯示CCD7與Solanum lycopersicum CCD7 NM_001247504.1在同一個分支上聚為一組,同源性達到97%;CCD8的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2B)顯示,CCD8與Solanum lycopersicum CCD8 JF831532.1、Solanum lycopersicum CCD8 NM_001279347.2在同一個分支上聚為一組,同源性較高。結(jié)果表明,克隆的CCD7和CCD8序列正確。

    2.2 目標(biāo)片段的串聯(lián)

    將片段CCD7與T載體連接,轉(zhuǎn)化、挑克隆并搖菌,以7-F和7-R為引物進行菌液PCR,得到約400 bp大小的片段,說明片段CCD7已連上T載體,記作pMD18-T-7(圖3A)。

    用StuⅠ和SalⅠ雙酶切片段CCD8后,與同樣酶切的pMD18-T-7載體相連,以7-F和8-R為引物,PCR擴增串聯(lián)片段CCD7-8,電泳檢測,得到800 bp左右的條帶,記作pMD18-T-7-8(圖3B)。獲得含有CCD7和CCD8 2個基因片段的串聯(lián)基因。

    2.3 干涉中間載體的構(gòu)建

    2.3.1 串聯(lián)片段正向插入pUCCRNAi質(zhì)粒 采用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和SalⅠ對pMD18-T-7-8質(zhì)粒進行酶切,獲得大小為800 bp的串聯(lián)基因片段CCD7-8。酶切片段經(jīng)割膠回收后連入同樣酶切開的pUCCRNAi載體,獲得+pRNAi-7-8重組載體。以7-F和8-R為引物,PCR擴增,得到約800 bp的目標(biāo)條帶(圖4),表明CCD7-8已連入pUCCRNAi載體。

    2.3.2 串聯(lián)片段反向插入pUCCRNAi質(zhì)粒 采用限制性內(nèi)切酶SpeⅠ和XhoⅠ酶切+pRNAi-7-8質(zhì)粒,將串聯(lián)基因CCD7-8連入其中,獲得pRNAi-In-7-8重組載體。采用PstⅠ對重組載體進行酶切鑒定,結(jié)果顯示,重組載體能切下1 700 bp左右的目的基因條帶(圖5)。表明串聯(lián)基因CCD7-8已反向連入+pRNAi-7-8載體,pRNAi-In-7-8中間載體構(gòu)建成功。

    2.4 沉默表達載體的構(gòu)建

    用限制性內(nèi)切酶PstⅠ雙酶切pRNAi-In-7-8質(zhì)粒,獲取了包含Intron的In-7-8片段。將酶切后的In-7-8片段回收后定向插入以相同限制性內(nèi)切酶酶切且去磷酸化的植物表達載體p35上。重組載體用限制性內(nèi)切酶PstⅠ進行酶切,可切下大小約1 700 bp的條帶(圖6),表明包含Intron在內(nèi)的串聯(lián)基因CCD7-8已成功連入p35,從而得到具有反向重復(fù)序列的植物表達載體p35-In-7-8。

    3 小結(jié)與討論

    獨腳金內(nèi)酯(Strigolactones,SLs)是一類新發(fā)現(xiàn)的類胡蘿卜素衍生型植物激素,其在抑制植物分枝、調(diào)節(jié)根生長、葉老化和花的形成方面有重要作用,在刺激列當(dāng)種子萌發(fā)并與寄主植物建立寄生關(guān)系過程中也至關(guān)重要[6,7]。目前已知有多個酶參與獨腳金內(nèi)酯的合成,其中胡蘿卜素裂解雙加氧7(CCD7)和胡蘿卜素裂解雙加氧酶8(CCD8)發(fā)揮了關(guān)鍵作用。本研究中克隆獲得的番茄CCD7和CCD8基因經(jīng)BLAST分析后與Solanum lycopersicum的CCD7和CCD8都有很高的同源性。Vogel等[10]將番茄中的CCD7沉默后,番茄上Orobanche ramosa的寄生量減少了90%,但同時番茄分枝量有了明顯的增加;Pasare等[12]將馬鈴薯的CCD8沉默后馬鈴薯表現(xiàn)出側(cè)枝增加,匍匐莖減少。Gomez-Roldan等[13]將豌豆體內(nèi)與獨腳金內(nèi)酯合成密切相關(guān)的CCD8基因被缺失突變后突變體無法有效合成獨腳金內(nèi)酯,列當(dāng)?shù)募纳鷶?shù)量也顯著減少。單個基因的沉默已經(jīng)取得了良好的抗列當(dāng)效果。

    反向重復(fù)序列導(dǎo)入植物體是一種高效誘導(dǎo)RNA沉默的方法,其優(yōu)點是在任何遺傳轉(zhuǎn)化體系成熟的植株中都可進行,且產(chǎn)生的RNA沉默高效持久并能在后代穩(wěn)定遺傳[14]。本研究先在一個小型中間載體中構(gòu)建好反向重復(fù)序列后再轉(zhuǎn)入植物表達載體,并且兩個反向重復(fù)片斷之間有Intron隔開,選用小型中間載體pUCCRNAi構(gòu)建反向重復(fù)拷貝數(shù)高,操作容易。本研究在構(gòu)建RNA沉默載體時所用的pUCCRNAi中間載體中已經(jīng)插入了一段Intron序列,使用十分方便。同時把CCD7和CCD8進行串聯(lián),同時插入到一個載體中,減少了多余的試驗操作,省時省力。

    本研究以番茄根部提取的cDAN為模板,克隆CCD7和CCD8基因片段并使其串聯(lián),插入到中間載體pUCCRNAi中構(gòu)建反向重復(fù)結(jié)構(gòu),最后插入到植物表達載體p35上,成功構(gòu)建含2個基因片段的RNA沉默載體p35-In-7-8,為研究抗列當(dāng)?shù)姆研缕贩N培育提供了技術(shù)支撐。

    參考文獻:

    [1] HABIMANA S,NDUWUMUREMYI A,CHINAMA R J D.Management of Orobanche in field crops——A review[J].Journal of Soil Science and Plant Nutrition,2014,14(1):43-62.

    [2] ALY R.Advanced technologies for parasitic weed control[J]. Weed Science,2012,60(2):290-294.

    [3] PARKER C. Observations on the current status of Orobanche and Striga problems worldwide[J].Pest Management Science, 2009,65(5):453-459.

    [4] RUBIALES D,F(xiàn)ERN?NDEZ-APARICIO M.Innovations in parasitic weeds management in legume crops. A review[J].Agronomy for Sustainable Development,2012,32(2):433-449.

    [5] WESTWOOD J H,YODER J I,TIMKO M P,et al. The evolution of parasitism in plants[J].Trends Plant Science,2010,15(4):227-235.

    [6] CONN C E,BYTHELL-DOUGLAS R, NEUMANN D,et al. Convergent evolution of strigolactone perception enabled host detection in parasitic plants[J].Science,2015,349(6247):540-543.

    [7] CARDOSO C1,RUYTER-SPIRA C,BOUWMEESTER H J.Strigolactones and root infestation by plant-parasitic Striga, Orobanche and Phelipanche spp[J].Plant Science,2011,180(3):414-420.

    [8] DOR E,YONEYAMA K,WININGER S,et al. Strigolactone deficiency confers resistance in tomato Line SL-ORF1 to the parasitic weeds Phelipanche and Orobanche spp[J].Phytopathology,2011,101(2):213-222.

    [9] L?PEZ-R?EZ J A,CHARNIKHOVA T,G?MEZ-ROLD?N V,et al.Tomato strigolactones are derived from carotenoids and their biosynthesis is promoted by phosphate starvation[J].New Phytologist,2008,178(4):863-874.

    [10] VOGEL J T,WALTER M H,GIAVALISCO P,et al. SlCCD7 controls strigolactone biosynthesis, shoot branching and mycorrhiza-induced apocarotenoid formation in tomato[J].The Plant Journal,2010,61(2):300-311.

    [11] 張學(xué)坤,姚兆群,趙思峰,等.分枝(瓜)列當(dāng)在新疆的分布、危害及其風(fēng)險評估[J].植物檢疫,2012,26(6):31-33.

    [12] PASARE S A,DUCREUX L J,MORRIS W L,et al. The role of the potato (Solanum tuberosum) CCD8 gene in stolon and tuber development[J].New Phytol,2013,198(4):1108-1120.

    [13] GOMEZ-ROLDAN V,F(xiàn)ERMAS S,BREWER P B,et al.Strigolactone inhibition of shoot branching[J].Nature,2008,455:189-194.

    [14] WATERHOUSE P M,HELLIWELL C A.Exploring plant genomes by RNA-induced gene silencing[J].Nature Reviews Genetics,2003,4(1):29-38.

    猜你喜歡
    內(nèi)酯串聯(lián)克隆
    用提問來串聯(lián)吧
    用提問來串聯(lián)吧
    克隆狼
    浙江:誕生首批體細胞克隆豬
    穿心蓮內(nèi)酯滴丸
    穿心蓮內(nèi)酯固體分散體的制備
    中成藥(2017年4期)2017-05-17 06:09:27
    審批由“串聯(lián)”改“并聯(lián)”好在哪里?
    我曾經(jīng)去北京串聯(lián)
    抗BP5-KLH多克隆抗體的制備及鑒定
    蒙藥如達七味散中木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的含量測定
    水蜜桃什么品种好| 色吧在线观看| 大香蕉久久网| 久久女婷五月综合色啪小说| 亚洲精品国产av蜜桃| 日韩一区二区三区影片| 新久久久久国产一级毛片| 一级爰片在线观看| 日本91视频免费播放| 国产成人精品一,二区| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 久久久国产精品麻豆| 日本黄大片高清| 大话2 男鬼变身卡| 两个人免费观看高清视频 | 9色porny在线观看| 亚洲四区av| 亚洲美女搞黄在线观看| 国产精品久久久久久精品古装| 成人无遮挡网站| av国产久精品久网站免费入址| 亚洲人与动物交配视频| 人妻系列 视频| 97精品久久久久久久久久精品| 欧美 日韩 精品 国产| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 边亲边吃奶的免费视频| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 国产精品99久久久久久久久| 国产欧美日韩精品一区二区| 女的被弄到高潮叫床怎么办| √禁漫天堂资源中文www| 高清视频免费观看一区二区| 久久久久久久国产电影| 国产精品一区www在线观看| 国产黄色视频一区二区在线观看| 一二三四中文在线观看免费高清| 免费av中文字幕在线| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 插阴视频在线观看视频| 成人美女网站在线观看视频| a级一级毛片免费在线观看| 亚洲精品久久午夜乱码| 国产精品偷伦视频观看了| 少妇人妻一区二区三区视频| av在线观看视频网站免费| 亚洲欧美精品专区久久| 各种免费的搞黄视频| 久久久久久久精品精品| 99热全是精品| 日韩欧美一区视频在线观看 | 大片电影免费在线观看免费| 国产免费视频播放在线视频| a 毛片基地| 国产爽快片一区二区三区| 自线自在国产av| 日韩视频在线欧美| 老司机影院毛片| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 少妇人妻 视频| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 国产爽快片一区二区三区| 亚洲国产色片| 一级毛片我不卡| 国产黄片美女视频| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 国产精品一区www在线观看| 日韩亚洲欧美综合| 黄色毛片三级朝国网站 | 欧美日韩亚洲高清精品| 丝袜喷水一区| 免费黄频网站在线观看国产| 国产中年淑女户外野战色| 亚洲精品456在线播放app| 在线观看一区二区三区激情| 欧美高清成人免费视频www| 久久女婷五月综合色啪小说| 69精品国产乱码久久久| 国产男女内射视频| 老司机深夜福利视频在线观看 | 69av精品久久久久久 | 他把我摸到了高潮在线观看 | 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 两个人看的免费小视频| 国产男女内射视频| 99久久国产精品久久久| 亚洲一区二区三区欧美精品| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 国产深夜福利视频在线观看| 国精品久久久久久国模美| 色综合欧美亚洲国产小说| 久久久国产一区二区| tocl精华| 永久免费av网站大全| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 精品人妻在线不人妻| 99国产精品免费福利视频| 无遮挡黄片免费观看| 亚洲全国av大片| 久久久精品区二区三区| 秋霞在线观看毛片| 我要看黄色一级片免费的| 欧美激情久久久久久爽电影 | 免费高清在线观看视频在线观看| 大香蕉久久网| 欧美日韩av久久| 欧美性长视频在线观看| 黄色视频在线播放观看不卡| 精品人妻一区二区三区麻豆| 久久久欧美国产精品| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 久久久精品94久久精品| 亚洲第一青青草原| av天堂在线播放| 国产野战对白在线观看| 动漫黄色视频在线观看| 久久人人爽人人片av| 精品人妻一区二区三区麻豆| 国产免费av片在线观看野外av| 十八禁高潮呻吟视频| 国产97色在线日韩免费| 午夜成年电影在线免费观看| 91精品伊人久久大香线蕉| a级毛片黄视频| 狂野欧美激情性bbbbbb| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 99国产极品粉嫩在线观看| 丝袜喷水一区| 成在线人永久免费视频| 女警被强在线播放| 9191精品国产免费久久| 免费在线观看影片大全网站| 午夜福利乱码中文字幕| 精品国产乱码久久久久久男人| 三级毛片av免费| 在线观看免费高清a一片| 性色av一级| 亚洲国产看品久久| 男女下面插进去视频免费观看| 国产成人欧美在线观看 | 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 另类亚洲欧美激情| 亚洲专区中文字幕在线| 欧美日韩亚洲高清精品| tube8黄色片| 波多野结衣av一区二区av| 97在线人人人人妻| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 国产又爽黄色视频| 久久毛片免费看一区二区三区| 免费高清在线观看日韩| 最黄视频免费看| 正在播放国产对白刺激| 下体分泌物呈黄色| av免费在线观看网站| 男女免费视频国产| 天天添夜夜摸| 性色av一级| 999久久久精品免费观看国产| 午夜福利影视在线免费观看| netflix在线观看网站| 啦啦啦啦在线视频资源| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 另类精品久久| 老司机深夜福利视频在线观看 | 在线天堂中文资源库| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 国产精品亚洲av一区麻豆| 淫妇啪啪啪对白视频 | 国产精品一区二区在线观看99| 欧美日韩福利视频一区二区| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 午夜91福利影院| 久久毛片免费看一区二区三区| 欧美激情高清一区二区三区| 亚洲成国产人片在线观看| 91大片在线观看| 日韩一区二区三区影片| 亚洲伊人色综图| 国产成人免费无遮挡视频| 久久久精品区二区三区| 精品亚洲成a人片在线观看| 精品人妻在线不人妻| 欧美97在线视频| 国产97色在线日韩免费| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区 | 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 在线永久观看黄色视频| 日本精品一区二区三区蜜桃| 国产主播在线观看一区二区| 在线观看免费午夜福利视频| 精品国产乱码久久久久久小说| 波多野结衣一区麻豆| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 国产男人的电影天堂91| 一级毛片女人18水好多| 手机成人av网站| 天堂俺去俺来也www色官网| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 亚洲精华国产精华精| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 国精品久久久久久国模美| netflix在线观看网站| 五月天丁香电影| 99国产极品粉嫩在线观看| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 91成人精品电影| 亚洲成国产人片在线观看| 久久综合国产亚洲精品| 成人国产一区最新在线观看| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 国产一区二区三区av在线| 一区二区三区四区激情视频| 一本久久精品| 国产精品熟女久久久久浪| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 女性生殖器流出的白浆| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 国产精品九九99| 国产主播在线观看一区二区| 99国产精品一区二区蜜桃av | 久久天堂一区二区三区四区| 亚洲中文av在线| 亚洲欧美一区二区三区久久| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 蜜桃国产av成人99| 亚洲国产精品成人久久小说| 国产一级毛片在线| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 一本色道久久久久久精品综合| a 毛片基地| 高清视频免费观看一区二区| 99热网站在线观看| 曰老女人黄片| 美女午夜性视频免费| 麻豆av在线久日| 亚洲欧洲日产国产| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | av不卡在线播放| 婷婷成人精品国产| 蜜桃在线观看..| av视频免费观看在线观看| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 99久久国产精品久久久| 欧美乱码精品一区二区三区| av在线老鸭窝| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 无限看片的www在线观看| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 深夜精品福利| 精品国产乱码久久久久久小说| 麻豆国产av国片精品| 黑人操中国人逼视频| 色视频在线一区二区三区| 亚洲国产中文字幕在线视频| 夜夜夜夜夜久久久久| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 久久久久久人人人人人| 国产一卡二卡三卡精品| 久久久国产欧美日韩av| 久久中文字幕一级| 51午夜福利影视在线观看| 91精品伊人久久大香线蕉| 淫妇啪啪啪对白视频 | 国精品久久久久久国模美| 午夜日韩欧美国产| 欧美日韩精品网址| av欧美777| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 亚洲精品自拍成人| 狂野欧美激情性xxxx| 黄色毛片三级朝国网站| 欧美+亚洲+日韩+国产| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| av又黄又爽大尺度在线免费看| 午夜91福利影院| av天堂久久9| 99热国产这里只有精品6| 国产亚洲精品一区二区www | 日韩视频在线欧美| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 在线观看免费午夜福利视频| 国产免费视频播放在线视频| 日本91视频免费播放| 中文字幕人妻丝袜制服| 成人亚洲精品一区在线观看| 波多野结衣一区麻豆| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 久久久欧美国产精品| a在线观看视频网站| 亚洲国产欧美网| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 99久久综合免费| 啦啦啦免费观看视频1| 香蕉国产在线看| 精品国产国语对白av| av视频免费观看在线观看| 最黄视频免费看| 老司机影院成人| 国产精品久久久av美女十八| 国产精品 国内视频| 亚洲精品国产色婷婷电影| 热re99久久精品国产66热6| www.999成人在线观看| 久久免费观看电影| 两个人看的免费小视频| 一个人免费看片子| 国产av又大| 多毛熟女@视频| 成年av动漫网址| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 午夜福利影视在线免费观看| 亚洲,欧美精品.| 狂野欧美激情性xxxx| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 欧美激情高清一区二区三区| 多毛熟女@视频| 国产精品久久久久久精品电影小说| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 视频区欧美日本亚洲| 久久香蕉激情| 老司机深夜福利视频在线观看 | 日本vs欧美在线观看视频| 亚洲欧美日韩另类电影网站| av欧美777| 老司机午夜十八禁免费视频| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 国产精品久久久人人做人人爽| 午夜福利在线观看吧| 亚洲av成人一区二区三| 18禁国产床啪视频网站| 国产97色在线日韩免费| 中文字幕制服av| 久久国产精品大桥未久av| 亚洲精品乱久久久久久| 国产亚洲一区二区精品| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 久久久久精品国产欧美久久久 | 久久国产精品大桥未久av| av超薄肉色丝袜交足视频| av一本久久久久| 亚洲三区欧美一区| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 香蕉国产在线看| www日本在线高清视频| 久久精品人人爽人人爽视色| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 日韩欧美国产一区二区入口| 老鸭窝网址在线观看| 中文字幕高清在线视频| 国产欧美日韩一区二区三 | 欧美人与性动交α欧美软件| 国产欧美日韩精品亚洲av| 一区二区av电影网| 啦啦啦啦在线视频资源| 1024视频免费在线观看| 男人爽女人下面视频在线观看| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 国产成人欧美在线观看 | 欧美日韩视频精品一区| 无限看片的www在线观看| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 各种免费的搞黄视频| 嫩草影视91久久| 免费高清在线观看视频在线观看| 岛国在线观看网站| 99re6热这里在线精品视频| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 老司机靠b影院| 久久久久久久久久久久大奶| 免费在线观看日本一区| 国产免费av片在线观看野外av| 久久免费观看电影| 精品久久久精品久久久| 久久久欧美国产精品| 色综合欧美亚洲国产小说| 三上悠亚av全集在线观看| 精品免费久久久久久久清纯 | 久久天堂一区二区三区四区| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 久久中文字幕一级| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 日韩电影二区| 一进一出抽搐动态| 美女国产高潮福利片在线看| 国产一区二区三区综合在线观看| 制服诱惑二区| 欧美精品啪啪一区二区三区 | 女警被强在线播放| 99国产精品一区二区三区| 他把我摸到了高潮在线观看 | 高清av免费在线| 国产成人欧美| 国产成人精品无人区| 精品一区二区三区av网在线观看 | 啦啦啦啦在线视频资源| 国产免费现黄频在线看| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 丝袜在线中文字幕| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 精品亚洲成国产av| 欧美精品一区二区免费开放| 9191精品国产免费久久| 啦啦啦 在线观看视频| 两个人看的免费小视频| 搡老岳熟女国产| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 岛国在线观看网站| videosex国产| 国产区一区二久久| 啦啦啦啦在线视频资源| 亚洲av欧美aⅴ国产| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 啦啦啦 在线观看视频| 久久久久精品国产欧美久久久 | 精品国产乱码久久久久久男人| 欧美精品av麻豆av| 免费黄频网站在线观看国产| 免费高清在线观看视频在线观看| 99国产精品一区二区三区| 黑丝袜美女国产一区| 久久久久久久久免费视频了| 精品人妻在线不人妻| 少妇的丰满在线观看| 国产精品1区2区在线观看. | 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 国产1区2区3区精品| 亚洲国产av影院在线观看| www日本在线高清视频| 国产男女超爽视频在线观看| 搡老乐熟女国产| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 欧美精品啪啪一区二区三区 | 可以免费在线观看a视频的电影网站| 日韩欧美国产一区二区入口| 免费在线观看黄色视频的| 久久久精品区二区三区| 麻豆av在线久日| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久 | 欧美另类亚洲清纯唯美| avwww免费| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 欧美精品高潮呻吟av久久| 99国产综合亚洲精品| 91九色精品人成在线观看| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 窝窝影院91人妻| 国产高清视频在线播放一区 | 久久久久久免费高清国产稀缺| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 亚洲成人免费电影在线观看| 18在线观看网站| 麻豆乱淫一区二区| 国产精品.久久久| 久久热在线av| 男女无遮挡免费网站观看| 精品久久蜜臀av无| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 免费不卡黄色视频| 亚洲精品国产区一区二| 日韩人妻精品一区2区三区| 欧美性长视频在线观看| 久久中文字幕一级| 国产亚洲精品一区二区www | 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 国产福利在线免费观看视频| 亚洲专区字幕在线| 欧美97在线视频| 少妇的丰满在线观看| 男女午夜视频在线观看| 免费观看a级毛片全部| 日韩中文字幕欧美一区二区| 母亲3免费完整高清在线观看| 欧美激情久久久久久爽电影 | 国产在线观看jvid| 欧美黄色淫秽网站| 91成人精品电影| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 亚洲专区中文字幕在线| 两性夫妻黄色片| 国产日韩欧美视频二区| 嫁个100分男人电影在线观看| 国产精品1区2区在线观看. | 黄色毛片三级朝国网站| 在线天堂中文资源库| 啦啦啦在线免费观看视频4| 国产主播在线观看一区二区| 精品国产乱码久久久久久小说| 老汉色∧v一级毛片| 这个男人来自地球电影免费观看| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久 | 国产区一区二久久| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 免费在线观看黄色视频的| 老司机在亚洲福利影院| 99精国产麻豆久久婷婷| 精品一区二区三区av网在线观看 | 国产又色又爽无遮挡免| 男女国产视频网站| 男女床上黄色一级片免费看| 亚洲色图综合在线观看| 久久久国产精品麻豆| 美女福利国产在线| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 黑人欧美特级aaaaaa片| 久热这里只有精品99| 欧美另类一区| a级片在线免费高清观看视频| 2018国产大陆天天弄谢| 97在线人人人人妻| 热99re8久久精品国产| 欧美日韩亚洲高清精品| 操出白浆在线播放| 成人av一区二区三区在线看 | 五月天丁香电影| 母亲3免费完整高清在线观看| 国产精品99久久99久久久不卡| 成年av动漫网址| 999精品在线视频| 一区在线观看完整版| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 亚洲av国产av综合av卡| 一级黄色大片毛片| 亚洲av欧美aⅴ国产| 亚洲中文字幕日韩| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 精品久久久久久电影网| 欧美av亚洲av综合av国产av| 黑人猛操日本美女一级片| 亚洲第一青青草原| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 国产一区二区三区综合在线观看| 精品国产乱子伦一区二区三区 | e午夜精品久久久久久久| 久久久久国产精品人妻一区二区| 国产伦理片在线播放av一区| 精品国内亚洲2022精品成人 | 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 岛国毛片在线播放| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 不卡av一区二区三区| 国产伦人伦偷精品视频| 欧美人与性动交α欧美软件| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 岛国在线观看网站| 美女大奶头黄色视频| 亚洲精品国产av成人精品| 国产亚洲精品第一综合不卡| 日本vs欧美在线观看视频| 在线观看一区二区三区激情| 欧美中文综合在线视频| 他把我摸到了高潮在线观看 | 亚洲成国产人片在线观看| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 欧美在线黄色| 男女国产视频网站| 性高湖久久久久久久久免费观看| 无限看片的www在线观看| 亚洲精品自拍成人| 中文字幕制服av| 欧美黄色淫秽网站| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 久久天堂一区二区三区四区| 亚洲精品久久午夜乱码| 午夜福利免费观看在线| 热99国产精品久久久久久7| 交换朋友夫妻互换小说| 国产精品国产三级国产专区5o| 欧美日韩一级在线毛片| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 久久久国产欧美日韩av| 欧美中文综合在线视频| 热99久久久久精品小说推荐| 高潮久久久久久久久久久不卡| 亚洲国产日韩一区二区| 精品国产国语对白av| 黑丝袜美女国产一区| 亚洲一区中文字幕在线| 亚洲一区二区三区欧美精品| 啦啦啦啦在线视频资源| 99热国产这里只有精品6| 男人舔女人的私密视频| 首页视频小说图片口味搜索| 天天影视国产精品| 中国国产av一级| 国产一区二区激情短视频 | 女人久久www免费人成看片| 高清欧美精品videossex| 麻豆av在线久日| 亚洲专区中文字幕在线| 欧美另类亚洲清纯唯美| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 久久精品国产综合久久久| 亚洲欧美精品自产自拍| 一级黄色大片毛片| 国产av又大| 精品亚洲成国产av| av天堂久久9| 成人免费观看视频高清| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 国产色视频综合| 97在线人人人人妻|