反相高效液相色譜峰法測定痛風(fēng)顆粒中落新婦苷的含量

肖　柳，楊全偉

1.武漢市中醫(yī)醫(yī)院(湖北 武漢430022) 2.武漢市第一醫(yī)院藥學(xué)部(湖北 武漢 430022)

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反相高效液相色譜峰法測定痛風(fēng)顆粒中落新婦苷的含量

肖柳1，楊全偉2*

1.武漢市中醫(yī)醫(yī)院(湖北 武漢430022) 2.武漢市第一醫(yī)院藥學(xué)部(湖北 武漢 430022)

目的建立測定痛風(fēng)顆粒中的落新婦苷含量的方法。方法采用高效液相色譜法。流動相為甲醇-0.1%磷酸(40∶60)，檢測波長為290nm，流速為1.0mL/min，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為10μL。結(jié)果落新婦苷進(jìn)樣量在0.099 8-0.998 0μg(R=0.999 9)范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好；精密度試驗、重復(fù)性試驗、穩(wěn)定性試驗的RSD≤3.0%；平均加樣回收率為101.54%，RSD=0.54%(n=6)。結(jié)論該方法測量較為準(zhǔn)確、穩(wěn)定、簡便，可用于痛風(fēng)顆粒的質(zhì)量控制。

痛風(fēng)顆粒；落新婦苷；高效液相色譜法

高尿酸血癥主要是由于尿酸合成增加或排泄減少，是機(jī)體嘌呤代謝異常所引發(fā)的臨床疾病，臨床目前對其發(fā)病原因尚不能完全統(tǒng)一，但大多數(shù)患者均伴有肥胖、高血壓、高血脂等疾病。隨著人們生活水平的不斷提升，該疾病的臨床發(fā)病率不斷上升[1]。同時呈現(xiàn)出地域性、性別及飲食結(jié)構(gòu)差異，隨著病情發(fā)展，關(guān)節(jié)腔處會有尿酸堆積形成尿酸鹽結(jié)晶，引發(fā)炎癥因子活動，從而形成一系列臨床癥狀?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)主要選用促進(jìn)尿酸排泄的藥物(如苯溴馬隆)或抑制尿酸合成的藥物(別嘌醇)，具有一定的副作用，且對于合并高脂血癥者，往往需要加用調(diào)脂藥物，在加重患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)的同時，進(jìn)一步降低患者的依從性[2]。因此，研究高效低毒的既能降尿酸又能調(diào)節(jié)脂代謝的藥物已經(jīng)迫在眉睫。近年來，越來越多研究表明中醫(yī)藥治療高尿酸血癥合并高脂血癥具有獨特的優(yōu)勢[3]。痛風(fēng)顆粒為武漢市中醫(yī)醫(yī)院應(yīng)用多年證實具有良好降尿酸作用的臨床經(jīng)驗方，由土茯苓、白英、薏苡仁、徐長卿等十一味中藥組成，以土茯苓等作為君藥，根據(jù)文獻(xiàn)，落新婦苷為二氫黃酮類化合物，是土茯苓中主要有效成分[4-5]。具有淡滲利濕、健脾祛濁、通脈補腎等功效。主治由高尿酸血癥引起的痛風(fēng)尤其是合并有高脂血癥如關(guān)節(jié)腫痛，頭昏頭重，肢體困倦乏力，脘腹悶脹，腰膝酸軟，大便粘膩。本實驗主要應(yīng)用高效液相色譜法(highperformanceliquidchromatography，HPLC)對痛風(fēng)顆粒中落新婦苷含量進(jìn)行測定，以期為制劑質(zhì)量控制提供有效依據(jù)。

1　儀器與試劑

Waters2695高效液相色譜儀(美國Waters公司)，Waters2489紫外檢測器(美國Waters公司)。百萬分之一天平(METTLERTOLEDO)(美國奧豪斯公司)。落新婦苷對照品(中國食品藥品檢定院，批號111798-201504)；痛風(fēng)顆粒(醫(yī)院自制制劑，批號20150614)；蒸餾水，甲醇、磷酸為色譜純，其余試劑均為分析純。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件檢測波長的選擇：適量稱取落新婦苷對照品，加50%甲醇溶解后進(jìn)行過濾，配制成濃度為10μg/mL的溶液；根據(jù)2015版《中國藥典》中的相關(guān)規(guī)定[6-7]，紫外分光光度法進(jìn)行全波長掃描，測定結(jié)果顯示，最大吸收波長為290nm，因此本次試驗以290nm作為檢測波長。Waterse2685C18色譜柱(5μm，4.6×250mm)；流動相為甲醇：0.1%磷酸(40∶60)；檢測波長290nm；流速1.0mL/min；柱溫30℃；進(jìn)樣量10μL。

2.2溶液配制

2.2.1對照品溶液配制精密稱定4.990mg落新婦苷對照品。加入50%甲醇溶液稀釋至50mL，充分振蕩搖勻，溶液濃度為0.099 8mg/mL。

2.2.2供試品溶液配制取痛風(fēng)顆粒0.5g，加入50%甲醇50mL溶液，稱重，超聲溶解30min，放冷，補重，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.3陰性對照溶液的配制稱取不含土茯苓的白英、薏苡仁、徐長卿等十味藥材，按照“2.2.2”項下供試品溶液的制備方法制備陰性對照溶液。

2.3專屬性試驗取上述對照品溶液、供試品溶液和陰性對照品溶液，按照“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果按上述含量測定方法，供試品中落新婦苷的色譜峰能夠較好的分離，保留時間與對照品一致，且陰性樣品在相同保留時間無色譜峰出現(xiàn)，表明該色譜條件專屬性良好，見圖1、圖2、圖3。

圖1　落新婦苷對照品HPLC圖譜

圖2　痛風(fēng)顆粒供試品HPLC圖譜

圖3　陰性對照HPLC圖譜

2.4線性關(guān)系考察精密量取落新婦苷對照品溶液1、2、4、6、8、10mL，用50%甲醇溶液定容至10mL容量瓶，分別制備成濃度為0.009 98mg/mL，0.019 96mg/mL，0.039 92mg/mL，0.059 88mg/mL，0.079 84mg/mL，0.099 8mg/mL的溶液。精密吸取10μL注入高效液相色譜儀，記錄峰面積。其中橫坐標(biāo)為落新婦苷進(jìn)樣量(X)，縱坐標(biāo)為峰面積(Y)，進(jìn)行線性回歸計算，得到線性方程：Y=2 336 982X-114 709，相關(guān)系數(shù)R=0.999 9。根據(jù)線性回歸方程分析可得，落新婦苷在0.099 8-0.998μg的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，見圖4。

圖4　落新婦苷進(jìn)樣量與峰面積線性關(guān)系

2.5精密度試驗精密吸取10μL對照品溶液，按照上述色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣測定，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，RSD=0.53%，表明儀器精密度良好。

2.6重復(fù)性試驗分別適量稱取6份供試品(批號20150614)，根據(jù)上述供試品溶液制定方法，進(jìn)行測定，外標(biāo)法計算本品平均含量=0.039 2mg/mL，RSD為1.21%，表明方法重復(fù)性良好。

2.7穩(wěn)定性試驗精密吸取供試品溶液，于0、1、2、4、8、12h分別進(jìn)樣，根據(jù)上述色譜條件測定其峰面積，計算結(jié)果顯示峰面積RSD為0.69%，結(jié)果表明供試品溶液中所含落新婦苷在12h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8加樣回收率試驗精密量取已知含量的痛風(fēng)顆粒(批號20150614)各0.25g，共6份，置具塞錐形瓶中，依次精密加入落新婦苷對照品(0.040 9mg/mL)10mL，測定加樣回收率，見表1。計算分析可得，平均加樣回收率為101.54% ，RSD=0.54% ，結(jié)果顯示本試驗方法加樣回收率良好。

表1　加樣回收率結(jié)果

2.9樣品含量測定取3批痛風(fēng)顆粒(批號20150615；20150616；20150617)，按“2.2.2”項下方法制成供試品溶液，按照“2.1”項下含量測定方法測定落新婦苷的含量，見表2。

表2　樣品含量測定結(jié)果

3　討論

臨床研究發(fā)現(xiàn)，落新婦苷具有較為顯著的選擇性免疫抑制作用，能夠有效選擇性誘導(dǎo)移植排斥反應(yīng)中活化T細(xì)胞的凋亡，可作為一種新型的免疫抑制劑用于臨床推廣。此外落新婦苷還具有抗氧化、體外抗菌、抗水腫、鎮(zhèn)痛等作用，其中落新婦苷具有較強抗氧化能力，對機(jī)體內(nèi)DPPH、ABTS等超氧離子及自由基均具有良好清除作用，有學(xué)者指出[11-13]其能夠抑制髓過氧化物酶的活性，清除次氯酸，落新婦苷能夠增加機(jī)體抗氧化能力從而起到降尿酸作用。2015版《中國藥典》中明確指出，落新婦苷屬于難溶物質(zhì)，不易被機(jī)體吸收，生物利用度較差，因此限制了其在臨床上的應(yīng)用，為更好的對其進(jìn)行推廣，在保證藥品質(zhì)量優(yōu)良的前提下對制藥工藝進(jìn)行優(yōu)化。本次試驗研究證明在290nm處落新婦苷有最大吸收波長，因此設(shè)定為檢測波長，關(guān)于流動相選擇上，在考察不同比例的甲醇-水作為流動相洗脫時發(fā)現(xiàn)，落新婦苷拖尾現(xiàn)象較為明顯，最終發(fā)現(xiàn)以甲醇：0.1%磷酸(40∶60)作為流動相，其基線平穩(wěn)，落新婦苷與雜峰具有較好的分離度，且無明顯拖尾現(xiàn)象。本研究發(fā)現(xiàn)此方法測定落新婦苷含量準(zhǔn)確，方便，穩(wěn)定，可用于痛風(fēng)顆粒的有效成分落新婦苷的檢測，彌補了痛風(fēng)顆粒的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)中含量測定的空白，從而在生產(chǎn)環(huán)節(jié)保障痛風(fēng)顆粒的有效性和穩(wěn)定性，保證患者用藥的安全與有效[11-12]。

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責(zé)任編輯：艾茜

TheGoutGranuleTestedforAstilbinContentbyReversedPhaseHighPerformanceLiquidChromatographicPeakMethod

XiaoLiu1，YangQuanwei2*

(1.Wuhan Hospital of Traditional Chinese Medicine,Wuhan 430022,China;2.Department of Pharmacy,the First Hospital of Wuhan,Wuhan 430022,China)

ObjectiveToexploreamethodtotestAstilbiningoutgranule.MethodsThehighperformanceliquidchromatographymethod(HPLC)wasusedtomeasuremobilephaseofmethanol-0.1%phosphoricacid(40∶60),wavelengthf290nm,theflowrateof1.0mL/min,columntemperatureof30℃andsamplequantityof10μL.ResultsTheAstilbinsamplequantity(between0.099 8-0.998 0μg,R=0.999 9)hadagoodlinearrelationshipwithpeakarea.TheRSDintheaccuracy,repeatabilityandstabilitytestwere3.0%orless.Theaveragesamplerecoveryratewas101.54%. (RSD=0.54% n=6).ConclusionThismethodwasmoreaccurate,stableandsimple.Itcanbeusedforqualitycontrolofgoutgranule.

goutgranule;astilbin;HPLC

肖柳(1986- )，女，湖北黃岡人，碩士，中醫(yī)師，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合腫瘤研究；*

楊全偉，男，碩士，中藥師，主要從事中藥新藥方面的研究。

R284.1

A

1008-8164(2016)03-0046-03

2016-06-10