砷暴露對不同發(fā)育階段小鼠仔鼠海馬CaMKⅡ表達水平的影響

鄧麗麗，楊曉霞，王歡，吳競，王艷*

（1.沈陽醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院衛(wèi)生檢驗教研室，遼寧沈陽110034；2.職業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)醫(yī)學教研室）

砷暴露對不同發(fā)育階段小鼠仔鼠海馬CaMKⅡ表達水平的影響

鄧麗麗1a，楊曉霞2a，王歡2，吳競2，王艷2*

（1.沈陽醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院衛(wèi)生檢驗教研室，遼寧沈陽110034；2.職業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)醫(yī)學教研室）

目的：探討砷暴露對不同發(fā)育階段小鼠仔鼠海馬CaMKⅡ表達水平的影響及可能的機制。方法：建立不同發(fā)育階段小鼠仔鼠砷暴露模型（0、15、30和60 mg/L NaAsO2組），分別于仔鼠出生后（postnatal day，PND）第10、20和40天取腦組織并分離海馬，采用real-time RT-PCR法檢測CaMKⅡ亞單位CaMKⅡα和CaMKⅡβ mRNA的表達水平。結果：PND10和PND20，不同劑量砷暴露組仔鼠海馬CaMKⅡα和CaMKⅡβ mRNA表達水平與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義；PND40，不同劑量砷暴露組仔鼠海馬CaMKⅡα mRNA表達水平均顯著低于對照組，30和60 mg/L NaAsO2組仔鼠海馬CaMKⅡβ mRNA表達水平均明顯低于對照組（P＜0.05）。結論：砷暴露可使小鼠仔鼠海馬CaMKⅡ亞單位mRNA的表達水平降低，從而可能影響仔鼠的學習記憶能力。

砷；CaMKⅡ；學習記憶；小鼠

［Abstract］Objective：To investigate the impairment mechanism of learning and memory ability induced by arsenite through studying the effects of arsenite on the expression level of CaMKⅡin the hippocampus of offspring mice at different developmental stages.Methods：The model of offspring mice exposed to arsenite（0，15，30 and 60 mg/L NaAsO2）was set up.In postnatal day（PND）10，20 and 40，the expression levels of CaMKⅡα and CaMKⅡβ mRNA in the hippocampus were measured by real-time RT-PCR.Results：In PND 10 and PND 20，the expression levels of CaMKⅡα and CaMKⅡβ mRNA in the hippocampus of offspring mice exposed to arsenite had no significant difference compared with those in control group.In PND 40，the expression levels of CaMKⅡα mRNA in the hippocampus of offspring mice exposed to arsenite were significantly lower than those in control group，the expression levels of CaMKⅡβ mRNA in the hippocampus of offspring mice exposed to 30 and 60 mg/L arsenite were significantly lower than those in control group（P＜0.05）.Conclusion：Arsenite can affect the expression levels of CaMKⅡsubunits in the hippocampus of offspring mice and further may impair the learning and memory ability.

［Key words］arsenite；CaMKⅡ；learning and memory；mice

砷暴露對中樞神經系統(tǒng)的影響及其機制備受國內外學者的廣泛關注。研究顯示，長期砷暴露會引起兒童智力發(fā)育障礙［1］，砷暴露也可導致實驗動物學習記憶功能明顯下降［2］，但目前其作用機制尚未闡明。研究表明，鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ（calcium/calmodulin dependent protein kinaseⅡ，CaMKⅡ）是一種多功能蛋白激酶，是學習記憶過程中的關鍵酶，在神經組織中含量豐富，是信號轉導通路中的重要因子［3］。本實驗通過研究砷暴露對不同發(fā)育階段小鼠仔鼠海馬CaMKⅡ亞單位CaMKⅡα和CaMKⅡβ表達水平的影響，初步探討砷暴露損害學習記憶能力的可能機制，為地方性砷中毒的防治提供實驗數據。

1　材料與方法

1.1主要試劑亞砷酸鈉（NaAsO2，美國Fluka公司），Trizol試劑盒和SYBR Premix Ex TaqⅡreal-time RT-PCR試劑盒（日本TaKaRa公司）。

1.2實驗動物分組及染毒SPF級健康昆明種小鼠由中國醫(yī)科大學實驗動物中心提供，動物生產許可證號：SCXK（遼）2003-0009，使用許可證號：SYXK（遼）2003-0013。雌鼠60只，雄鼠30只，體重22～25 g，適應性飼養(yǎng)1周，雌雄2∶1合籠交配，查到陰栓之日即為受孕第0天，將孕鼠隨機分為對照組、15、30和60 mg/L NaAsO2（用NaAsO2+蒸餾水配制）組，每組15只孕鼠，NaAsO2組從受孕后第1天開始以自由飲水方式染砷，對照組孕鼠飲蒸餾水。仔鼠在斷乳前經由母體血循環(huán)和乳汁染砷，斷乳后則通過自行飲水攝入砷，分別于仔鼠出生后（postnatal day，PND）第10、20和40天隨機選不同窩別的各組仔鼠，每組各6只，記錄仔鼠體重，乙醚麻醉摘眼球放血后立即斷頭取腦并分離海馬。

1.3real-time RT-PCR法檢測CaMKⅡα和CaMKⅡβ mRNA的表達水平取各組海馬組織，按照Trizol試劑盒操作要求，提取總RNA。通過RT-PCR反應將樣本中mRNA轉錄為cDNA。建立Real-time PCR反應體系，應用ABI 7500實時定量PCR儀（美國ABI公司），測定各樣本等質量總RNA的mRNA的Ct（cycle threshold）值，以GAPDH基因Ct值為內參，應用2-ΔΔCT方法計算目的基因的相對表達含量。各基因片段擴增引物序列見表1。

表1　各基因片段擴增引物序列

1.4統(tǒng)計學方法采用SPSS 22.0進行統(tǒng)計學分析。多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1不同劑量砷暴露組仔鼠體重的變化PND20，60 mg/L NaAsO2組仔鼠體重明顯低于對照組和15 mg/L NaAsO2組（P＜0.05）；PND40，30和60 mg/L NaAsO2組仔鼠體重明顯低于對照組，60 mg/L NaAsO2組仔鼠體重顯著低于15和30 mg/L NaAsO2組（P＜0.05）。見表2。

表2　各組不同發(fā)育階段仔鼠體重的比較（±s，g）

表2　各組不同發(fā)育階段仔鼠體重的比較（±s，g）

注：與對照組比較，1）P＜0.05；與15 mg/L NaAsO2組比較，2）P＜0.05；與30 mg/L NaAsO2組比較，3）P＜0.05

組別對照組15 mg/L NaAsO2組30 mg/L NaAsO2組60 mg/L NaAsO2組n6666 PND10 6.69±0.96 6.44±0.98 6.25±0.89 5.50±0.85 PND20 14.56±1.66 14.00±1.98 13.25±1.22 11.94±1.351）2）PND40 34.44±2.54 32.81±1.83 31.19±2.241）28.25±1.871）2）3）

2.2不同劑量砷暴露對仔鼠海馬CaMKⅡα和CaMKⅡβ mRNA表達水平的影響PND10和PND20，各組仔鼠海馬CaMKⅡα和CaMKⅡβ mRNA表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；PND40，各砷暴露組仔鼠海馬CaMKⅡα mRNA表達水平均明顯低于對照組，30和60 mg/L NaAsO2組仔鼠海馬CaMKⅡβ mRNA表達水平均明顯低于對照組（P＜0.05）。見表3和表4。1）

表3　各組不同發(fā)育階段仔鼠海馬CaMKⅡα mRNA表達水平的比較（±s）

表3　各組不同發(fā)育階段仔鼠海馬CaMKⅡα mRNA表達水平的比較（±s）

注：與對照組比較，1）P＜0.05

PND40 1.00±0.00 0.85±0.011）0.86±0.001）0.83±0.001）組別對照組15 mg/L NaAsO2組30 mg/L NaAsO2組60 mg/L NaAsO2組n6666 PND10 1.00±0.00 0.98±0.00 0.99±0.00 1.02±0.02 PND20 1.00±0.06 0.94±0.06 0.88±0.04 0.86±0.07

表4　各組不同發(fā)育階段仔鼠海馬CaMKⅡβ mRNA表達水平的比較（±s）

表4　各組不同發(fā)育階段仔鼠海馬CaMKⅡβ mRNA表達水平的比較（±s）

注：與對照組比較，P＜0.05

PND40 1.00±0.01 0.92±0.01 0.88±0.021）0.81±0.051）組別對照組15 mg/L NaAsO2組30 mg/L NaAsO2組60 mg/L NaAsO2組n6666 PND10 1.00±0.01 0.99±0.01 1.01±0.02 1.02±0.02 PND20 1.00±0.03 0.96±0.03 0.90±0.02 0.91±0.05

3　討論

研究表明，母體長期處于砷暴露環(huán)境下，直接影響幼鼠的前期發(fā)育［4］。本研究中不同劑量砷暴露組小鼠仔鼠隨砷暴露時間和暴露劑量的增加，體重增長明顯減緩，表明砷暴露可能影響仔鼠的生長發(fā)育。

CaMKⅡ是海馬內含量最高的一種蛋白，其能夠磷酸化包括其自身的一系列不同的底物，活化的CaMKⅡ可以進一步使環(huán)磷酸腺苷反應元件結合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB）等核轉錄因子發(fā)生磷酸化，從而對多種基因的轉錄和表達進行調控［5］，因此，CaMKⅡ在神經系統(tǒng)中參與多種生物學過程，如突觸可塑性的調控、神經遞質合成與釋放、與學習和記憶有關的基因轉錄等，從而參與學習與記憶的形成［6］。CaMKⅡ有α、β、γ和δ 4種不同亞型，CaMKⅡα和β是CaMKⅡ的2個主要亞型，主要存在于神經組織中。本研究采用real-time RT-PCR法分別檢測了CaMKⅡα和CaMKⅡβ的mRNA表達水平，結果顯示，PND40，不同劑量砷暴露組仔鼠海馬CaMKⅡα mRNA表達水平均顯著低于對照組，30和60 mg/L NaAsO2組仔鼠海馬CaMKⅡβ mRNA表達水平均明顯低于對照組（P＜0.05），本研究結果提示砷暴露會使CaMKⅡα和CaMKⅡβ mRNA表達水平降低，從而可能影響CaMKⅡ的功能，進而可能引起學習記憶能力下降，CaMKⅡ在砷暴露所引起的學習記憶能力損害中的作用及其機制有待于進一步的研究。

［1］Wasserman GA，Liu X，Loiacono NJ，et al.A cross-sectional study of well water arsenic and child IQ in Maine schoolchildren［J］.Environ Health，2014，13（1）：23.

［2］Ram Kumar M，Flora SJ，Reddy GR.Monoisoamyl 2，3-dimercaptosuccinic acid attenuates arsenic induced toxicity：behavioral and neurochemical approach［J］.Environ Toxicol Pharmacol，2013，36（1）：231-242.

［3］Sanhueza M，Fernandez-Villalobos G，Stein IS，et al.Role of the CaMKII/NMDA receptor complex in the maintenance of synaptic strength［J］.J Neurosci，2011，31（25）：9170-9178.

［4］Xi S，Sun W，Wang F，et al.Transplacental and early life exposure to inorganic arsenic affected development and behavior in offspring rats［J］.Arch Toxicol，2009，83（6）：549-556.

［5］Sun CY，Qi SS，Lou XF，et al.Changes of learning，memory and levels of CaMKII，CaMmRNA，CREB mRNA in the hippocampus of chronic multiple-stressed rats［J］.Chin Med J（Engl），2006，119（2）：140-147.

［6］Fink CC，Meyer T.Molecular mechanisms of CaMKⅡactivation inneuronalplasticity［J］.CurrOpinNeurobiol，2002，12（3）：293-299.

Effects of Arsenite Exposure on the Expression Level of CaMKⅡin the Hippocampus of Offspring Mice

DENG Lili1a，YANG Xiaoxia2a，WANG Huan2，WU Jing2，WANG Yan2*
（1.Department of Health Inspection，Shenyang Medical College，Shenyang 110034，China；2.Department of Occupational Health and Occupational Medicine）

R994.6

A

1008-2344（2016）05-0361-03

10.16753/j.cnki.1008-2344.2016.05.013

2016-05-01

（文敏 編輯）

國家自然科學基金資助項目（No.81202158）；遼寧省教育廳優(yōu)秀人才計劃項目（No.LJQ2014115）

鄧麗麗（1985—），女（漢），實驗師，碩士，研究方向：衛(wèi)生化學分析及研究；楊曉霞（1991—），女（漢），碩士在讀.鄧麗麗與楊曉霞對本文同等貢獻，列為并列第一作者

王艷（1978—），女（漢），副教授，碩士生導師，研究方向：環(huán)境污染物的神經毒性機制研究.E-mail：zijing15@tom.com