木犀草素對人牙周膜細胞增殖及成骨分化能力的影響

張淼，劉繡華，趙紅宇

（1.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院口腔科，新疆烏魯木齊830000；2.河南大學河南省天然藥物與免疫工程重點實驗室；3.廣東省口腔醫(yī)院南方醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院）

木犀草素對人牙周膜細胞增殖及成骨分化能力的影響

張淼1，劉繡華2，趙紅宇3*

（1.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院口腔科，新疆烏魯木齊830000；2.河南大學河南省天然藥物與免疫工程重點實驗室；3.廣東省口腔醫(yī)院南方醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院）

目的：探討不同濃度木犀草素對人牙周膜細胞（PDLC）增殖及成骨分化能力的影響。方法：體外培養(yǎng)PDLC并進行組織來源鑒定，取第3代細胞進行實驗。MTT四唑鹽比色法、堿性磷酸酶（ALP）檢測試劑盒、Q-PCR檢測成骨相關基因等方法觀察不同濃度木犀草素對PDLC增殖及成骨分化能力的影響。結果：MTT結果顯示不同濃度的木犀草素可以促進PDLC增殖，ALP試劑盒檢測結果表明木犀草素也可以促進PDLC的ALP活性，且濃度為1 μmol/L的ALP OD值最高。Q-PCR結果顯示木犀草素可以上調PDLC內ALP及成骨轉錄因子mRNA的含量。結論：一定濃度的木犀草素對PDLC增殖及成骨分化能力有一定的促進作用，為未來木犀草素應用于臨床治療牙周疾病提供依據。

木犀草素；人牙周膜細胞；增殖；堿性磷酸酶；RUNX2基因

［Abstract］Objective：To evaluate the biological effects of Luteolinl on the proliferation and differentiation in human periodontal ligament cells（PDLC）.Methods：MTT，ALP kit and Q-PCR was used to detect the expression of osteogenesis related gene. Results：Luteolinl（100，10，1，0.1，0.01 μ mol/L）could increase the proliferation of PDLC，and there were significant differences compared with control group（P＜0.05）.The ALP Kit results showed that Luteolinl could increase the ALP actiuty of PDLC（P＜0.05）.The Q-PCR results showed that Luteolin could increase the expression of ALP and RUNX2（P＜0.05）. Conclution：At proper concentration，Luteolinl can increase the proliferation and differentiation of PDLC.

［Key words］Luteolinl；human periodontal ligament cell；proliferation；ALP；RUNX2

牙周膜細胞（periodontal ligament cell，PDLC）具有多向分化的潛能，可分化為成纖維細胞、成骨細胞和成牙骨質細胞，在一定的培養(yǎng)條件下可以形成骨結節(jié)，并表達骨相關蛋白，如堿性磷酸酶（ALP）、骨涎蛋白、骨鈣素等［1-4］，在牙周組織的更新和再生方面起著重要的作用。木犀草素具有抑制腫瘤、調節(jié)免疫、抗炎、抗氧化、降低破骨細胞活性等藥理活性［5-7］，Choi等［8］報道木犀草素可以促進小鼠成骨細胞MC3T3-E1 ALP及骨鈣素的增加，但木犀草素對PDLC的作用尚未見報道。本實驗旨在通過體外培養(yǎng)PDLC，觀察木犀草素作用于PDLC后細胞增殖及成骨分化能力的變化。

1　材料和方法

1.1主要試劑DMEM培養(yǎng)液（美國，Gibco），胎牛血清（FBS）（美國，Sigma），木犀草素（河南大學劉繡華教授惠贈），ALP試劑盒（南京建成生物科技有限公司）。

1.2人PDLC體外培養(yǎng)取因正畸需要而拔出的新鮮恒牙，于無菌超凈工作臺內用刀片刮取牙根中1/3牙周膜組織，充分剪碎后以一定間隔平鋪于6孔板，上置蓋玻片，加入1～2 ml DMEM培養(yǎng)液（10%FBS，1%雙抗），置于飽和濕度、5%二氧化碳、37℃環(huán)境下，每3 d換液一次，直至細胞從組織塊中游離出并長滿。胰酶消化傳代，取第3～5代細胞用于實驗。

1.3木犀草素對PDLC增殖的影響將生長狀況良好的第3代PDLC以2×l03個/ml接種于3塊96孔培養(yǎng)板，每塊96孔板分6組，每組6個復孔，每孔200 μl，周邊孔填充無菌PBS液。將3塊96孔板放在5%CO2、37℃培養(yǎng)箱內24 h，待細胞貼壁后加入不同培養(yǎng)液（100、10、1、0.1、0.01 μmol/L）200 μl，在24、48、72 h分別取一塊培養(yǎng)板每孔加入MTT 10 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去上清，每孔加二甲基亞颯（DMSO）200 μl，在振蕩器上緩慢震蕩10 min使結晶溶解，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm處測定每孔吸光度值（A490），取各孔均值，以A490數值反映活細胞數目。

1.4木犀草素對PDLC ALP活性的影響取生長狀況良好的第3～5代PDLC，以5×104個/ml的濃度鋪于96孔板，每組6個復孔，5%CO2、37℃培養(yǎng)24 h，細胞貼壁，按分組分別加入含不同濃度木犀草素（100、10、1、0.1、0.01 μmol/L）的礦化誘導液［DMEM培養(yǎng)基（10%FBS），地塞米松10-7mol/L，抗壞血酸Vc 50 μg/ml，β-甘油磷酸鈉10 mmol/L］200 μl，5%CO2、37℃培養(yǎng)72 h后，按ALP試劑盒說明書操作，酶標儀520 nm處測OD值。

1.5Q-PCR檢測木犀草素作用于PDLC后成骨相關基因的表達（1）將含100、10、1、0.1、0.01 μmol/L木犀草素的礦化誘導液分別培養(yǎng)PDLC 72 h后Trizol提取細胞內總RNA，PCR引物設計：從Genbank中查找人ALP及RUNX2基因序列，RT-PCR實驗由廣州必思恩生物科技有限公司完成。RT-PCR引物序列：Hom-ALP-F：5'-CCCC CGAGTCGGACGTGTAC-3'；Hom-ALP-R：5'-CCGC CATGGACTTTCGTCAC-3'；Hom-RUNX2-F：5'-GAG ATTTGTGGGCCGGAGTG-3'；Hom-RUNX2-R：5'-CCTAAATCACTGAGGCGGTC-3'；GAPDH-h-209-F：5'-AACGGATTTGGTCGTATTGG-3'；GAPDH-h-209-R：5'-TGGAAGATGGTGATGGGATT-3'。（2）檢測指標：讀取Ct（Cytle threshold）值，參照文獻報道的比較閾值法［1］，利用2-△△Ct進行計算。

1.6統(tǒng)計學方法應用SPSS 17.0軟件，進行多樣本間的方差分析及兩兩間的LSD檢驗，Q-PCR數據進行單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1PDLC的培養(yǎng)及篩選所選擇的細胞大部分呈長梭形，胞體飽滿，具有細而長的胞突，胞質均勻，細胞核位于細胞中央、呈圓形或卵圓形。少量細胞較小且形態(tài)不規(guī)則。10～15 d后細胞呈放射狀、旋渦狀鋪滿培養(yǎng)板。見圖1。

圖1　PDLC的形態(tài)（×40）

2.2不同濃度木犀草素對PDLC增殖的影響在24、48、72 h時，各濃度木犀草素均可促進PDLC的增殖（P＜0.05），經多樣本均數間兩兩比較顯示在24 h、48 h、72 h時各濃度組同一時間點間PDLC的增殖比較差異意義無統(tǒng)計學（P＞0.05）。見表1。

2.3不同濃度木犀草素對PDLC的ALP活性的影響各濃度木犀草素均可促進ALP活性（P＜0.05），經多樣本均數間兩兩比較顯示100 μmol/L濃度組木犀草素對PDLC中ALP活性的促進與其他組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），100 μmol/L濃度組較其他實驗組的ALP活性降低，其余各組之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表1　木犀草素對PDLC增殖的影響（OD值）（A490，±s，n=6）

表1　木犀草素對PDLC增殖的影響（OD值）（A490，±s，n=6）

注：與空白組比較，1）P＜0.05

72 h 0.541±0.0461）0.389±0.0741）0.415±0.0321）0.377±0.0991）0.417±0.0471）0.183±0.008組別100 μmol/L 10 μmol/L 1 μmol/L 0.1 μmol/L 0.01 μmol/L空白組24 h 0.364±0.0331）0.284±0.0731）0.306±0.0791）0.262±0.0211）0.280±0.0251）0.125±0.019 48 h 0.330±0.0961）0.362±0.0281）0.377±0.0211）0.365±0.0231）0.393±0.0611）0.144±0.028

表2　木犀草素作用于PDLC 72 h后ALP平均光密度值（OD值）

2.4Q-PCR檢測木犀草素作用的PDLC中骨相關基因ALP、RUNX2的表達ALP表達變化為：木犀草素作用72 h后，與空白組比較，除0.01 μmol/L組外，實驗組ALP表達均呈上調趨勢（P＜0.05），1 μmol/L組ALP表達上調明顯高于其他實驗組（P＜0.05），見表3。RUNX2表達變化為：木犀草素作用于PDLP 72 h后，1、0.1 μmol/L組較空白組RUNX2表達上調，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其他濃度組RUNX2表達較空白組上調，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），實驗組組間比較差異無統(tǒng)計學（P＞0.05），見表3。

表3　木犀草素誘導PDLC 72 h后ALP及RUNX2的相對表達量

3　討論

牙周膜是圍繞牙根并連接牙根與牙槽骨的致密結締組織，含有多種細胞。實驗證實，PDLC群在一定條件下具有多向分化能力［9］，在牙周組織的改建和修復過程中起著重要作用［10］。木犀草素又名黃色黃素或黃示靈，是一種天然四羥基黃酮化合物，分子式：C15H10O6，分子量：286.23。最初因從木犀草的葉、莖、枝中分離得到而得名，可從多種天然藥材、蔬菜果實中分離得到，如金銀花、荊芥、芹菜、卷心菜、裸花紫珠、西蘭花、蘋果皮、菊花、胡蘿卜、胡椒和洋蔥的葉子等［5］，在自然界中常以糖基化的形式存在［6］。木犀草素具有多種藥理活性，富含木犀草素的植物常被用作中藥治療疾病。而且木犀草素還具有抗炎、抗氧化、免疫調節(jié)以及降低破骨細胞活性等作用［5-7］。張毅等［11］將木犀草素用于脂多糖（LPS）干擾下的小鼠單核巨噬細胞，結果發(fā)現木犀草素抑制促炎因子PGE2等的表達，且在RNA水平抑制了COX-2的表達，說明木犀草素的抗炎作用可能與抑制PGE2和COX-2的表達有關。但是木犀草素對間充質細胞骨分化的作用尚未見報道。

MTT實驗結果表明木犀草素濃度在0.01～100 μmol/L，明顯促進人PDLC增殖，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義。

ALP是一種非特異性磷酸單酯酶，在人體內大量存在，能夠反映細胞成骨活性，是早期成骨細胞分化的標志［12］。無論是新鮮正常牙周組織，還是體外培養(yǎng)的PDLC，都具有較高的ALP活性（比牙齦組織或細胞高數倍至十幾倍）［13-14］。組織化學研究表明，牙槽骨、成骨細胞、牙周韌帶ALP染色強陽性［8］。這表明PDLC具有較強的成骨傾向。ALP活性檢測已成為PDLC成骨分化功能的一項重要指標［12］。本實驗結果表明，木犀草素可促進PDLC對ALP活性的表達，說明木犀草素具有促進PDLC向可以形成礦化組織的細胞即成牙本質細胞和成骨分化細胞分化的作用。但其作用機制還需進一步實驗研究探索。在本研究中，應用ALP試劑盒檢測不同濃度木犀草素作用于PDLC后ALP活性的變化，結果顯示：各濃度木犀草素作用于PDLC 72 h后均可促進ALP活性的增加（P＜0.05），Q-PCR檢測進一步證實各濃度的木犀草素可以使ALP表達上調（除0.01 μmol/L濃度木犀草素）（P＜0.05），且0.1 μmol/L濃度木犀草素對PDLC中ALP活性的促進與其他實驗組相比顯著增加（P＜0.05）。說明一定濃度的木犀草素可以促進PDLC的成骨分化，增強ALP活性。

RUNX2基因是一種成骨細胞分化特異性轉錄因子，在成骨細胞早期增殖的過程中起著重要的作用［15］，是檢測PDLC骨向分化的常用指標之一［16-17］。Q-PCR結果顯示：各濃度木犀草素在礦化誘導條件下均可上調RUNX2基因的表達，其中1 μmol/L組和0.1 μmol/L組RUNX2基因的表達上調與空白組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。上述結果說明一定濃度的木犀草素可以提高PDLC成骨細胞分化特異性轉錄因子，提示木犀草素可以促進PDLC成骨分化。

綜上所述，一定濃度（0.01～100 μmol/L）的木犀草素在一定條件下可以促進PDLC的增殖、蛋白合成及成骨分化，為以后的研究提供一定的基礎。

［1］劉娟，趙紅宇，軒東英，等.人牙周膜細胞群多向分化潛能的實驗研究［J］.華西口腔醫(yī)學雜志，2010，28（2）：185-189.

［2］Lekic P，Rojas J，Birek C，et al.Phenotypic comparison of periodontal ligament cells in vivo and in vitro［J］.J Periodontal Res，2001，36（2）：71-79.

［3］Murakami Y，Kojima T，Nagasawa T，et al.Novel isolation of alkalinephosphatase-positivesubpopulationfrom periodontal ligament fibroblasts［J］.J Periodontol，2003，74（6）：780-786.

［4］Wu L，Wei X，Ling J，et al.Early osteogenic differential protein profiledetectedby proteomic analysis in human periodontal ligament cells［J］.J Periodontal Res，2009，44（5）：645-656.

［5］何煜舟，丁關萍.木犀草素對H2O2氧化損傷的血管內皮細胞的影響［J］.中國病理生理雜志，2007，23（7）：1285-12881.

［6］Verbeek R，van Tol EA，van Noort JM.Oral flavonoids delay recovery from experimental autoimmune encephalomyelitis in SJL mice［J］.Biochem Pharmacol，2005，70（2）：220-228.

［7］Kim TH，Jung JW，Ha BG，et al.The effects of luteolin on osteoclast differentiation，function in vitro and ovariectomy-induced bone loss［J］.J Nutr Biochem，2011，22（1）：8-15.

［8］ChoiEM.Modulatoryeffectsofluteolinonosteoblasticfunction and inflammatorymediatorsin osteoblastic MC3T3-E1 cells［J］. Cell Bio Int，2007，31（9）：870-877.

［9］Trzeciakiewicz A，Habauzit，Mercier S，et al.Hes-peretin stimulates differentiation of primary rat osteoblasts involving the BMP signalling pathway［J］.J Nutr Biochem，2010，21（5）：424-431.

［10］Palmon A，Roos H，Edel J，et al.Inverse dose-and Time-dependment effect of basic fibroblast growth factor on the gene expression of collagen typeⅠand MMP-1 by periodontal ligament cells in culture［J］.J Periodontol，2000，71（6）：974-980.

［11］張毅，王旭光.木犀草素的體外抗炎機制研究［J］.廣州中醫(yī)藥大學學報，2007，24（3）：231-234.

［12］Coleman JE.Structure and mechanism of alkaline phosphatase［J］.Annn Rev Biophy Biomol Struct，1992，21：441-483.

［13］Arceo N，Sauk JJ，Moehring J，et al.Human periodontal cells initiatemineral-likenodulesinvitro［J］.J Periodantol，1991，62（8）：499-503.

［14］Tenorio D，Cruchley A，Haghes FJ.Immunocytochemical investigation of the rat cementoblast phenotype［J］.J Periodont Res，1993，28（6）：411-419.

［15］Dalle CarbonareL，Innamorati G，Valenti MT.Tramscription factor RUNX2 and its application to bone tissue engineering［J］. Stem Cell Rev，2012，8（3）：891-897.

［16］Lee JH，Um S，Jang JH，et al.Effects of VEGF and FGF-2 on proliferation and differentiation of human periodontal ligament stem cells［J］.Cell Tissue Res，2012，348（3）：475-484.

［17］Park JC，Kim JM，Junq IH，et al.Isolation and characterization of human periodontal ligament（PDL）stem cells（PDLSCs）from the inflamed PDL tissue：in vitro and in vivo evaluations［J］.J Clin Periodontol，2011，38（8）：721-731.

Effects of Luteolinl on the Proliferation and Differentiation in Human Periodontal Ligament Cells

ZHANG Miao1，LIU Xiuhua2，ZHAO Hongyu3*
（1.Department of Stomatology，The Xinjiang Uygur Autonomous Region People's Hospital，Urumgi 830000，China；2.Key Laboratory of Natural Medicine and Immunology，Henan University；3.Guangdong Provincial Stomatological Hospital）

R781

A

1008-2344（2016）05-0340-04

10.16753/j.cnki.1008-2344.2016.05.006

2016-03-28

（吳迪 編輯）

趙紅宇（1965—），女（漢），主任醫(yī)師，研究方向：牙周病與全身性疾病的關系.zhongyu93@163.com