2種口腔常見菌在3種RPD常用基托材料表面粘附性能的比較

王建青, 蘇　彬, 劉素輝, 張曉波, 程路峰

(烏魯木齊市口腔醫(yī)院1修復(fù)科, 2溫泉門診部, 烏魯木齊　830002; 新疆醫(yī)科大學(xué)3基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物教研室, 4厚博學(xué)院微生物教研室,5基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室, 烏魯木齊　830011)

?

2種口腔常見菌在3種RPD常用基托材料表面粘附性能的比較

王建青1, 蘇彬2, 劉素輝3, 張曉波4, 程路峰5

(烏魯木齊市口腔醫(yī)院1修復(fù)科,2溫泉門診部, 烏魯木齊830002; 新疆醫(yī)科大學(xué)3基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物教研室,4厚博學(xué)院微生物教研室,5基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室, 烏魯木齊830011)

目的比較可摘局部義齒(RPD)修復(fù)初期變形鏈球菌和白假絲酵母菌在純鈦基托、鈷鉻合金基托和樹脂基托3種義齒材料的表面粘附性能。方法將3種RPD基托材料制成統(tǒng)一規(guī)格的試件，分別放入含變形鏈球菌CDC厭氧培養(yǎng)液和白假絲酵母菌的沙堡弱培養(yǎng)液中。于6、24、48 h定量檢測試件表面粘附的細(xì)菌數(shù)量。結(jié)果變形鏈球菌在3種基托材料表面粘附6 h后均檢出細(xì)菌，以粘附24 h后檢出菌落最多。白假絲酵母菌在3種材料表面粘附24 h后均檢出細(xì)菌，也以粘附24 h后檢出菌落最多。2種細(xì)菌在3種材料中的粘附能力比較順序由小到大均為：純鈦<鈷鉻合金<樹脂基托材料。結(jié)論3種基托材料口腔放置后6 h是變形鏈球菌定殖的關(guān)鍵期，而24 h是白假絲酵母菌定殖的關(guān)鍵期。純鈦基托與鈷鉻合金基托和樹脂基托比較，粘附的細(xì)菌最少。

細(xì)菌粘附； 變形鏈球菌； 白假絲酵母菌

在人體口腔中粘附大量的細(xì)菌，健康的機(jī)體口腔微生物與宿主細(xì)胞之間保持相對平衡的狀態(tài)。然而，當(dāng)口腔使用了修復(fù)體之后，牙周病、義齒性口炎、齲壞以及種植體周圍炎等醫(yī)源性口腔疾病發(fā)生率明顯增加，這類疾病和相應(yīng)的并發(fā)癥也是導(dǎo)致口腔修復(fù)治療失敗的原因之一[1]。修復(fù)體表面粗糙、外形不佳及自潔作用差從而引起病原微生物的粘附是這些疾病發(fā)生、發(fā)展的主要原因[2-3]。在不同細(xì)菌對口腔修復(fù)體的粘附研究中發(fā)現(xiàn)：不同種類的細(xì)菌往往表現(xiàn)出不同的粘附能力[4]。因此，在口腔治療中，選用具有良好的性能且不易被細(xì)菌粘附的材料是口腔學(xué)研究者共同關(guān)心的問題[5]。

本研究以常見口腔致病菌變形鏈球菌和白假絲酵母菌為觀察對象，檢測2種菌體在鈷鉻合金基托、純鈦基托和樹脂基托3種常用可摘局部義齒(RPD)材料表面粘附的情況，分析RPD修復(fù)初期，變形鏈球菌和白假絲酵母菌在修復(fù)體表面粘附的先后順序和定殖數(shù)量，旨在為臨床選擇合適的義齒基托材料并盡可能減少細(xì)菌在修復(fù)體表面粘附和定殖提供理論參考。

1　材料與方法

1.1實驗材料本實驗菌株變形鏈球菌和白假絲酵母菌均購自中科院北京微生物研究所。實驗試件中常用基托材料，包括純鈦、鈷鉻合金及樹脂基托材料等均由廣東省口腔醫(yī)院粵誠義齒技術(shù)開發(fā)中心統(tǒng)一制作。變形鏈球菌細(xì)菌培養(yǎng)使用CDC培養(yǎng)基，真菌的培養(yǎng)使用沙堡弱培養(yǎng)基，以上培養(yǎng)基均購自杭州天和微生物試劑有限公司。一次性厭氧培養(yǎng)袋購自法國生物梅里埃有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1基托材料制作與菌種復(fù)蘇基托材料制作參照文獻(xiàn)[6]。實驗所用變形鏈球菌干燥管中加入無菌生理鹽水，待細(xì)菌溶解后，接種于CDC培養(yǎng)基平板，裝入?yún)捬醮N，置于37℃培養(yǎng)箱，進(jìn)行菌種復(fù)蘇，培養(yǎng)3～5 d，鑒定備用。實驗所用白假絲酵母菌接種于沙堡弱瓊脂培養(yǎng)基，置于35℃培養(yǎng)箱，有氧條件下24～48 h傳代培養(yǎng)、鑒定后備用。1.2.2實驗菌液配制(1)用無菌接種環(huán)刮取CDC培養(yǎng)基平板上的變形鏈球菌菌落，溶于無菌生理鹽水中，用麥?zhǔn)媳葷峁鼙葷?，初步判斷菌液濃度?09～1010CFU/mL，采用倍比稀釋法稀釋做傾注平板計數(shù)，以106～107CFU/mL為工作濃度。以傾注平皿計數(shù)結(jié)果為準(zhǔn)，記錄為最終實驗濃度。變形鏈球菌計數(shù)濃度3.6×109CFU/mL，工作濃度為3.5×108CFU/mL。(2)用無菌接種環(huán)刮取沙堡弱瓊脂培養(yǎng)基平板上的白假絲酵母菌落，溶于無菌生理鹽水中，用麥?zhǔn)媳葷岱?，初步判斷菌液濃度?04～105CFU/mL，采用倍比稀釋法做傾注平板計數(shù)，工作濃度為103～104CFU/mL。以傾注平皿計數(shù)結(jié)果為準(zhǔn)，記錄為最終實驗濃度。白假絲酵母菌液濃度為3.1×104CFU/mL，工作濃度為3.1×103CFU/mL。

1.2.3菌種粘附實驗所有基托材料在75%的酒精中浸泡24 h，紫外燈下正反面照射4 h。然后將18個基托材料置于內(nèi)徑90 mm的培養(yǎng)皿中，在面朝上的實驗面上加入20 mL的人工唾液，合蓋后在超凈工作臺上常溫靜置1 h。以上實驗結(jié)束后，用無菌鑷子取出實驗試件，置于另一干凈的培養(yǎng)皿中，其中9個基托材料各加入1 mL變形鏈球菌懸液后快速放置厭氧袋中進(jìn)行培養(yǎng)；另外9個基托材料則加入白假絲酵母菌懸液各1 mL后快速放置35℃培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.4細(xì)菌粘附量的測定分別于6、24、48 h后，取出純鈦、鈷鉻合金、樹脂基托材料各3個。將各試件用PBS緩沖液沖洗5次，放入5 mL離心管中，分別加入2 mL相應(yīng)變形鏈球菌或白假絲酵母菌的培養(yǎng)液。將各離心管放在漩渦混合器上振蕩30 s，用微量取樣槍取0.1 mL菌液，注于培養(yǎng)基平板上充分涂布均勻，培養(yǎng)6、24、48 h后，進(jìn)行菌落形成單位計數(shù)。所有樣本的細(xì)菌計數(shù)均采用細(xì)菌菌落形成單位(CFU/mL)表示。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用 SPSS22.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行分析。各項指標(biāo)經(jīng)正態(tài)性及方差齊性檢驗，多組比較采用ANOVA單因素方差分析(F檢驗)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

3種基托材料包埋6 h均可檢出變形鏈球菌菌落，于24 h變形鏈球菌菌落數(shù)粘附均達(dá)高峰，48 h后均回落減少，甚至未檢出菌落(圖1A)。同一材料3個時間點(diǎn)變形鏈球菌菌落粘附量總體差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.01)，進(jìn)一步兩兩比較，除樹脂基托材料6 h與48 h時變形鏈球菌菌落粘附量差異無統(tǒng)計學(xué)意義外，其余時間點(diǎn)兩兩之間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.01)。在3個時間點(diǎn)，3種基托材料表面檢出變形鏈球菌菌落數(shù)由少到多依次為：純鈦<鈷鉻合金<樹脂基托材料，總體差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.01)。6 h和24 h時，3種材料表面檢出變形鏈球菌菌落數(shù)，兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.01)(表1)。3種基托材料包埋6 h白假絲酵母菌均未檢出，于24 h細(xì)菌菌落數(shù)粘附均達(dá)高峰，48 h后均回落減少，甚至未檢出菌落(圖1B)。同一材料3個時間點(diǎn)白假絲酵母菌菌落粘附量總體差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.01)，進(jìn)一步兩兩比較，除純鈦與鈷鉻合金基托材料6 h與48 h菌落粘附量差異無統(tǒng)計學(xué)意義外，其余時間點(diǎn)兩兩之間菌落粘附量差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.01)。在24 h和48 h時，3種基托材料表面檢出白假絲酵母菌菌落數(shù)由少到多依次均為：純鈦<鈷鉻合金<樹脂基托材料，總體差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.01)。進(jìn)一步兩兩比較，24 h和48 h時，3種基托材料白假絲酵母菌菌落粘附量差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P24 h均<0.01，P48 h均<0.05)(表1)。

表1　6、12及24 h時變形鏈球菌和白假絲酵母菌在3種基托材料的粘附力檢測結(jié)果(CFU/mL， ±s)

A: 變形鏈球菌粘附菌落數(shù) B: 白假絲酵母菌粘附菌落數(shù)

圖1不同時間點(diǎn)3種基托材料粘附菌落數(shù)

3　討論

RPD在口腔的植入可能誘發(fā)口腔黏膜損傷而致義齒性口炎、牙周病、黏膜刺激性增生和創(chuàng)傷性潰瘍等并發(fā)癥的發(fā)生。這除了與個體易感性及口腔衛(wèi)生有關(guān)外，還與口腔病原微生物致創(chuàng)面感染及修復(fù)體表面的粘附有關(guān)。因此，關(guān)于細(xì)菌在RPD表面早期粘附的研究則顯得較為重要。變形鏈球菌與白假絲酵母菌是2種重要口腔致病菌。變形鏈球菌與牙齒表面細(xì)菌生物膜的形成和積聚有著密切關(guān)系[7]，而RPD材料表面細(xì)菌生物膜的形成與促進(jìn)微生物致口腔內(nèi)組織的腐蝕之間有著高度相關(guān)性[8]。唾液中白假絲酵母菌數(shù)量的增加可能是導(dǎo)致義齒性口炎的重要潛在因素[9-10]。所以，一種好的義齒修復(fù)材料需同時具備良好的機(jī)械性能和生態(tài)學(xué)性能，以維持口腔微生態(tài)的相對平衡，防止微生態(tài)失調(diào)出現(xiàn)新的疾患[11-12]。

本研究結(jié)果表明，6 h時3種基托材料均有變形鏈球菌檢出，24 h細(xì)菌菌落最多，因此6 h對于變形鏈球菌來說是關(guān)鍵期，此期應(yīng)做好義齒和口腔的清潔，防止基牙齲壞。而對于白假絲酵母菌，6 h時3種基托材料均未檢出，而24 h細(xì)菌菌落數(shù)最多，因此24 h是白假絲酵母菌的關(guān)鍵期，此期做好義齒和口腔的清潔有利于防止義齒性口炎的發(fā)生。2種細(xì)菌在3種基托材料的粘附能力表明，在不同時間點(diǎn)，均為樹脂基托材料菌落數(shù)最多，純鈦基托材料最少。這可能是因為樹脂易發(fā)生變性、老化，細(xì)菌易于粘附；鈷鉻合金中的金屬離子與細(xì)菌結(jié)合形成絡(luò)合物，破壞了細(xì)菌生物膜性能，故細(xì)菌粘附作用較弱；純鈦因含有強(qiáng)烈鈍化傾向的鈦成分而形成穩(wěn)定的氧化膜而阻止了微生物的侵入[13]，故細(xì)菌粘附最少，表現(xiàn)出良好的抗菌能力。

綜上，3種材料口腔放置后6 h是變形鏈球菌定殖的關(guān)鍵期，此期應(yīng)做好義齒的清潔，防止基牙齲壞的發(fā)生。而24 h是白假絲酵母菌定殖的關(guān)鍵期，此期應(yīng)做好義齒的清潔，可以防止義齒性口炎的發(fā)生。純鈦基托與樹脂基托和鈷鉻合金基托相比，各實驗時間段粘附的細(xì)菌數(shù)較少。本研究結(jié)果為新型義齒材料的進(jìn)一步優(yōu)化及完善奠定了實驗室研究基礎(chǔ)。

[1]王曉偉, 姚國強(qiáng), 高鵬飛，等. 乳酸菌對重金屬污染的生物修復(fù)作用[J]. 中國微生態(tài)學(xué)雜志, 2014, 26(8):968-972.

[2]劉濤, 呂一品, 姚辰琛，等. 口腔微生態(tài)的研究進(jìn)展[J]. 生命科學(xué)研究, 2012, 16(5):466-470.

[3]熊萍, 唐運(yùn)濤, 陳宏剛，等. 種植體周圍炎病菌變化研究[J]. 現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué), 2014, 41(22):4189-4191.

[4]MacInnes SJ, Vescovo D, Kiss-Toth E, et al. Genetic variation in inflammatory and bone turnover pathways and risk of osteolytic responses to prosthetic materials[J]. J Orthop Res, 2015, 33(2):193-198.

[5]Filiz Aykent, Isa Yondem, Atilla G, et al. Effect of different finishing techniques for restorative materials on surface roughness and bacterial adhesion[J]. J Prosthet Dent, 2010, 103:221-227.

[6]丁寧, 張祖太, 何敏,等. 幾種常用口腔材料細(xì)菌粘附性能比較[J]. 北京口腔醫(yī)學(xué), 2014, 22(5):258-260.

[7]劉奕, 費(fèi)偉, 王麗娜,等. 十肽對變異鏈球菌生物膜生長和結(jié)構(gòu)影響的實驗研究[J]. 國際口腔醫(yī)學(xué)雜志, 2015, 42(4):401-405.

[8]Simón-Soro A, Mira A. Solving the etiology of dental caries[J]. Trends Microbiol, 2015, 23(2):76-82.

[9]Dovigo LN, Carmello JC, de Souza Costa CA, et al. Curcumin-mediated photodynamic inactivation of Candida albicans in a murine model of oral candidiasis[J]. Med Mycol, 2013, 51(3):243-251.

[10]Salvatori O, Puri S, Tati S, et al. Innate immunity and saliva in Candida albicans-mediated oral diseases[J]. J Dental Res, 2016, 95(4):365-371.

[11]劉濤, 呂一品, 姚辰琛,等. 口腔微生態(tài)的研究進(jìn)展[J]. 生命科學(xué)研究, 2012, 16(5):466-470.

[12]Carinci F, Scapoli L, Girardi A, et al. Oral microflora and periodontal disease:new technology for diagnosis in dentistry[J]. Ann Stomatol, 2013, 4(2):170-173.

[13]孫皎. 近五年我國口腔材料的研究概況[J]. 口腔材料器械雜志, 2014, 23(1):1-8.

(本文編輯周芳)

A comparison of adhesion status of 2 oral common bacteria on the surface of 3 types of RPD common denture base materials

WANG Jianqing1, SU Bing2, LIU Suhui3, ZHANG Xiaobo4, CHENG Lufeng5

(1DepartmentofProsthodontics,2SPADepartment,UrumqiStomatologicalHospital,Urumqi830002,China;3DepartmentofMicrobiology,SchoolofPre-clinicalMedicine,4DepartmentofMicrobiology,SchoolofHoubo,5DepartmentofPharmacology,SchoolofPre-clinicalMedicine,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China)

ObjectiveTo compare with adhesive capability of 2 oral common bacteria on the surface of 3 types of base materials at the earlier RPD restoration. MethodsManufactured uniform test specimens for pure titanium, cobalt chromium (Co-Cr) alloy and resin denture base, and then put them into CDC anaerobic culture medium containing Streptococcus mutans and Sabourauad culture medium containing Candida albicans, after 6 h, 12 h and 24 h, quantitatively detected and compared the adhesive quantities on the surface of the materials respectively. ResultsStreptococcusM. could be detected out from the 3 denture bases after 6 h, especially bacterial colonies were the most at 24 h, while Candida A. could not be detected out from the 3 denture bases at 24 h, and also bacterial colonies were the most at 24 h. The sequence of the adhesive capability of the 2 bacteria on the surface of the 3 denture bases were: pure titanium denture

pure titanium; bacteria adhesion; Streptococcus Mutant; Candida Albicans

烏魯木齊市衛(wèi)生局科學(xué)技術(shù)計劃項目(201319)

王建青(1979-)，女，碩士，副主任醫(yī)師，研究方向：口腔修復(fù)學(xué)。

程路峰，男，博士，教授，研究方向：免疫藥理學(xué)，E-mail: lewis_clf@163.com。

R780.2

A

1009-5551(2016)10-1250-04

10.3969/j.issn.1009-5551.2016.10.010

2016-06-17]