MALAT1在膀胱癌中的表達(dá)及其臨床意義

章成玉，崔雨，陳金波，李超

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院1.手術(shù)部，2.泌尿外科，湖南長(zhǎng)沙410008）

MALAT1在膀胱癌中的表達(dá)及其臨床意義

章成玉1，崔雨2，陳金波2，李超2

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院1.手術(shù)部，2.泌尿外科，湖南長(zhǎng)沙410008）

目的探討膀胱癌中長(zhǎng)鏈非編碼R NA肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1（MALAT1）的表達(dá)及其與膀胱癌患者預(yù)后的相關(guān)性。方法原位雜交方法檢測(cè)120例膀胱癌組織中MALAT1的表達(dá)，分析MALAT1表達(dá)與膀胱癌臨床特征及預(yù)后的相關(guān)性；Kaplan-Meier生存法及Log-rank檢驗(yàn)分析MALAT1表達(dá)強(qiáng)度與膀胱癌患者生存時(shí)間的關(guān)系；Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型評(píng)價(jià)影響膀胱癌生存危險(xiǎn)性的個(gè)體變量。結(jié)果高表達(dá)的MALAT1與高組織學(xué)分級(jí)、高臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性相關(guān)（P<0.05），而與患者的性別、年齡及腫瘤的大小、數(shù)目無(wú)關(guān)（P> 0.05）；Kaplan-Meier生存分析顯示，MALAT1高表達(dá)組的總生存期短于低表達(dá)組；Cox回歸多變量分析表明，高臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性和高表達(dá)量的MALAT1為影響膀胱癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。結(jié)論MALAT1的表達(dá)隨著組織學(xué)分級(jí)、臨床分期的升高，以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性而顯著上調(diào)，其高表達(dá)可作為判斷膀胱癌預(yù)后的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

長(zhǎng)鏈非編碼R NA；肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1；膀胱癌

在我國(guó)，膀胱癌發(fā)病率居泌尿生殖系腫瘤的第1位，居所有惡性腫瘤發(fā)病率的第6位[1]。50～70歲為膀胱癌高發(fā)年齡段，男性發(fā)病率高于女性，約為女性的3.3倍[2]。膀胱癌具有反復(fù)復(fù)發(fā)、局部浸潤(rùn)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的生物學(xué)特征，可分為非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌（non muscle-invasive bladder cancer，NMIBC）和肌層浸潤(rùn)性膀胱癌（Muscle-invasive bladder cancer，MIBC），后者具有極強(qiáng)的侵襲轉(zhuǎn)移能力，預(yù)后較差，5年存活率不足五成[3]。

肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1），定位于染色體11q13.1，全長(zhǎng)8.7 kb。2003年由JI等[3]在非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者的腫瘤細(xì)胞中首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道。近年來(lái)隨著研究的不斷深入，證實(shí)MALAT1參與包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，與腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為緊密相關(guān)。在乳腺癌、胰腺癌、肺癌、結(jié)腸癌和肝癌等惡性腫瘤中均有相關(guān)研究報(bào)道[4-8]，但目前國(guó)內(nèi)關(guān)于MALAT1與膀胱癌的相關(guān)研究較少。在本研究中，筆者通過(guò)原位雜交的方法檢測(cè)120例膀胱癌病理標(biāo)本中MALAT1的表達(dá)，分析MALAT1表達(dá)與膀胱癌臨床特征及預(yù)后的相關(guān)性，為膀胱癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)、診斷及治療后的預(yù)后判斷等提供新的生物標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1一般資料

選取2008年1月-2012年12月在中南大學(xué)湘雅醫(yī)院就診的120例膀胱癌患者病理標(biāo)本。所有患者經(jīng)過(guò)手術(shù)治療（膀胱電切或膀胱根治性切除），且術(shù)前未行放、化療等輔助治療，隨診時(shí)間3～5年，前2年每3個(gè)月隨訪1次，之后每6個(gè)月1次。收集患者的臨床資料，包括患者的年齡、性別、生存時(shí)間和腫瘤的大小、數(shù)目、分級(jí)、分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

原位雜交寡核苷酸探針序列為：TATGACACTT TCCTTGCCCA，3'-和5'-末端均采用地高辛標(biāo)記，以增加信號(hào)強(qiáng)度。探針序列利用Primer Primier 5.0設(shè)計(jì)，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。探針試劑盒購(gòu)自瑞士Roche公司，光學(xué)顯微鏡使用重慶奧特光學(xué)儀器有限公司的產(chǎn)品（型號(hào)B203LED）。實(shí)驗(yàn)步驟：組織芯片脫蠟，滴加胃蛋白酶置于37℃水浴鍋漂洗30min，依次浸泡在梯度酒精中脫水。37℃環(huán)境下預(yù)雜交2h后，地高辛標(biāo)記的MALAT1探針恒溫雜交，置于42℃水浴鍋過(guò)夜，滴加生物素化鼠抗地高辛，置于37℃水浴鍋中1 h，0.5 mol磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌后加入二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色液50μl，在顯微鏡下觀察顯色結(jié)果。最后蘇木素染核、脫水、封片、觀察拍照。

1.3判定標(biāo)準(zhǔn)

MALAT1表達(dá)強(qiáng)度用陰性、弱陽(yáng)性、中等陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性4個(gè)不同等級(jí)表示，依次對(duì)應(yīng)1～4分。標(biāo)本一式4份，兩位病理醫(yī)生雙盲看片，確定每個(gè)標(biāo)本的染色強(qiáng)度及相應(yīng)分?jǐn)?shù)，取均數(shù)作為對(duì)應(yīng)標(biāo)本的MALAT1表達(dá)量（表達(dá)強(qiáng)度）。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料用率或百分比表示，用χ2檢驗(yàn)。Kaplan-Meier生存法及Log-rank檢驗(yàn)分析MALAT1表達(dá)強(qiáng)度與膀胱癌患者術(shù)后生存時(shí)間的關(guān)系，Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型評(píng)價(jià)影響膀胱癌生存危險(xiǎn)性的個(gè)體變量，用Wald's檢驗(yàn)決定單變量和多變量Cox回歸模型的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1MALAT1在膀胱癌組織中的表達(dá)

原位雜交結(jié)果顯示，120例患者標(biāo)本中，MALAT1表達(dá)陰性為24例，弱陽(yáng)性為32例，中等陽(yáng)性為26例，強(qiáng)陽(yáng)性為38例。將所有患者M(jìn)ALAT1表達(dá)強(qiáng)度的均值（2.64）作為截?cái)嘀?，分為高表達(dá)組（n=64）和低表達(dá)組（n=56）。見(jiàn)圖1。

2.2MALAT1與膀胱癌臨床特征的關(guān)系

高表達(dá)的MALAT1與高組織學(xué)分級(jí)、高臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05）。而與患者的性別、年齡及腫瘤的大小、數(shù)目比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表1。

2.3MALAT1表達(dá)與膀胱癌患者預(yù)后的關(guān)系

使用Kaplan-Meier生存法及Log-rank檢驗(yàn)分析MALAT1表達(dá)強(qiáng)度與膀胱癌患者生存時(shí)間的關(guān)系。Kaplan-Meier曲線顯示，MALAT1高表達(dá)組的生存曲線在低表達(dá)組之下，高表達(dá)組的總生存期短于低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.421，P=0.017）。見(jiàn)圖2。

2.4MALAT1表達(dá)與膀胱癌預(yù)后的危險(xiǎn)因素分析

使用逐步Cox回歸模型分析影響膀胱癌生存預(yù)后的個(gè)體變量。除MALAT1表達(dá)量外，其他變量包括患者性別、年齡和腫瘤大小、數(shù)目、分級(jí)、分期，以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。單變量分析顯示，組織學(xué)分級(jí)、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及MALAT1的表達(dá)與膀胱癌的總生存期相關(guān)（P<0.05）。對(duì)以上有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量行進(jìn)一步的多變量分析，結(jié)果表明高臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性和MALAT1高表達(dá)為影響膀胱癌預(yù)后的危險(xiǎn)因素（P<0.05）。見(jiàn)表2。

圖1　原位雜交檢測(cè)MALAT1在膀胱癌組織中的表達(dá)強(qiáng)度（×100）

表1　MALAT1表達(dá)與膀胱癌臨床特征的關(guān)系例

圖2　MALAT1表達(dá)強(qiáng)度與膀胱癌患者生存時(shí)間關(guān)系的Kaplan-Meier曲線

表2　膀胱癌預(yù)后因素的多變量Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析

3 討論

膀胱癌是一類發(fā)生在膀胱黏膜上的惡性腫瘤，也是我國(guó)泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，全球每年約有40萬(wàn)新發(fā)病例；在西方，居泌尿系惡性腫瘤的第2位，其發(fā)病率僅次于前列腺癌[2]。大部分膀胱癌初診患者為非肌層浸潤(rùn)性尿路上皮癌，行內(nèi)鏡手術(shù)切除腫瘤和膀胱灌注治療后，一半以上患者在5年內(nèi)復(fù)發(fā)，且有進(jìn)一步發(fā)展為肌層浸潤(rùn)性尿路上皮癌的風(fēng)險(xiǎn)。肌層浸潤(rùn)性尿路上皮癌具有較強(qiáng)的侵襲能力，患者的預(yù)后較差，5年生存率<50%[9]。因此，進(jìn)一步探究膀胱癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，尋找可靠的生物標(biāo)志物和有效的分子治療靶點(diǎn)對(duì)提高膀胱癌患者生存率的意義重大而深遠(yuǎn)。

通過(guò)對(duì)全基因組研究發(fā)現(xiàn)，編碼功能基因的DNA僅僅占整個(gè)基因組的2%，剩余絕大部分的基因組為非編碼DNA，而該類DNA轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物即為非編碼RNA。依據(jù)非編碼RNA堿基序列長(zhǎng)度的不同，可將其分為3種類型，即長(zhǎng)鏈、中鏈和短鏈非編碼RNA。長(zhǎng)度>200nt的即為長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）[10]。過(guò)去一直認(rèn)為lncRNA作為一種非編碼RNA，僅僅是基因轉(zhuǎn)錄的噪音，而未引起足夠重視[11]。然而近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA廣泛參與人體多種生物學(xué)過(guò)程，具備多種生物學(xué)功能，包括轉(zhuǎn)錄干擾、基因剪接、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，基因組印跡、X染色體失活、細(xì)胞周期調(diào)控、染色質(zhì)修飾、表觀遺傳學(xué)修飾及免疫應(yīng)答等[12]。

FAN等[13]在研究TGF-β誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)，TGF-β能夠促進(jìn)MALAT1的表達(dá)及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)MALAT1可與多梳蛋白SUZ12結(jié)合，導(dǎo)致上皮型標(biāo)志基因E-鈣黏蛋白表達(dá)降低，間質(zhì)型標(biāo)志物N-鈣黏蛋白表達(dá)增加。在干擾MALAT1或SUZ12后，能夠抵消TGF-β對(duì)細(xì)胞的作用。在國(guó)內(nèi)的研究中，王沛等[14]發(fā)現(xiàn)干擾MALAT1在膀胱癌細(xì)胞株UMUC-3中的表達(dá)，能夠抑制UMUC-3細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲?？寺⌒纬山Y(jié)果顯示，MALAT1的表達(dá)受到干擾后，克隆集落數(shù)明顯減少；同時(shí)采用基因芯片篩選異常表達(dá)的基因，發(fā)現(xiàn)P53相關(guān)信號(hào)通路發(fā)生明顯變化，MEG3、MMP9等基因表達(dá)也發(fā)生明顯變化。綜上看來(lái)，MALAT1作為一個(gè)原癌基因，能增強(qiáng)膀胱癌遷移及（Ta+T1期）MALAT1介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞遷移機(jī)制，可為分子靶向治療膀胱癌提供新的理論依據(jù)。

有少量文獻(xiàn)報(bào)道，MALAT1在膀胱癌組織中存在較高表達(dá)，尤其是在轉(zhuǎn)移性膀胱癌中[15]。但是在KOHLS等[16]的研究中，其檢測(cè)泌尿系腫瘤患者血清中的MALAT1表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)與非腫瘤患者血清中的MALAT1表達(dá)水平無(wú)明顯差異，推測(cè)可能是循環(huán)系統(tǒng)與實(shí)體腫瘤組織存在差異所致。本研究發(fā)現(xiàn)，在45例低級(jí)別尿路上皮癌中，MALAT1高表達(dá)18例，占40.0%（18/45），而在75例高級(jí)別尿路上皮癌中，MALAT1高表達(dá)46例，占61.3%（46/75），經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.143，P=0.023），高級(jí)別尿路上皮癌對(duì)比低級(jí)別尿路上皮癌，具有更高的MALAT1表達(dá)率。在52例非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌（Ta+T1期）中，MALAT1高表達(dá)20例，占38.5%（20/ 52），而在68例肌層浸潤(rùn)性膀胱癌（T2～T4期）中，MALAT1高表達(dá)44例，占64.7%（44/68），經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.154，P=0.004），MALAT1在非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌（Ta+T1期）中的表達(dá)率低于在肌層浸潤(rùn)性膀胱癌（T2～T4期）中的表達(dá)率。在92例無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的膀胱癌組織中，MALAT1高表達(dá)43例，占46.7%（43/92），而在28例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的膀胱癌組織中，MALAT1高表達(dá)21例，占75.0%（21/ 28），經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.889，P= 0.009），有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的膀胱癌比無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的膀胱癌具有更高的MALAT1表達(dá)率。可見(jiàn)，高表達(dá)的MALAT1與高組織學(xué)分級(jí)、高臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性相關(guān)。這也提示MALAT1在膀胱癌進(jìn)展中發(fā)揮重要的作用。

另外，Kaplan-Meier曲線顯示MALAT1高表達(dá)組的總生存期短于低表達(dá)組（P<0.05），結(jié)合Cox回歸多變量分析的結(jié)果進(jìn)一步表明，高表達(dá)量的MALAT1為影響膀胱癌患者術(shù)后總生存期的獨(dú)立危險(xiǎn)因子。該研究結(jié)果為深入探索膀胱癌的發(fā)病機(jī)理提供較好的補(bǔ)充，也為今后臨床上膀胱癌的檢測(cè)和治療提供新的生物標(biāo)志物及分子治療靶點(diǎn)。

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（童穎丹編輯）

Expression of metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1 in bladder cancer and its clinical significance

Cheng-yu Zhang1，Yu Cui2，Jin-bo Chen2，Chao Li2
（1.Department of Operation；2.Department of Urology，Xiangya Hospital，Central South University，Changsha，Hunan 410008，China）

Objective To study the expression of long non-coding RNA（lncRNA）metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1（MALAT1）and explore its relationship with prognosis in bladder cancer patients.Methods A total of 120 bladder cancer pathological specimens were obtained from Xiangya Hospital，and the expression ofMALAT1was tested byin situhybridization.The association betweenMALAT1expression and overall survival of bladder cancer patients was evaluated by Kaplan-Meier analysis and log-rank tests.To identify the risk factors associated with overall survival of bladder cancer patients，several factors were evaluated by Cox univariate and multivariate analyses.Results HighMALAT1expression was associated with advanced histological grade，high tumor stage and positive lymph-node metastasis（P＜0.05），and not related to gender，age，tumor size or tumor number（P＞0.05）.Kaplan-Meier survival analysis indicated that the overall survival time of the bladder cancer patients with highMALAT1expression was significantly shorter than that of the patients with lowMALAT1expression.Multivariate analysis showed that high tumor stage，positive lymph-node metastasis and highMALAT1expression were the independent risk factors for prognosis of bladder cancer.Conclusions The expression ofMALAT1is obviously increased in bladder cancer patients with advanced histological grade，high clinical stage and lymph node metastasis.Therefore，highMALAT1 expression can be served as an independent risk factor for prognosis of bladder cancer.

long non-coding RNA；metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1；bladder cancer

R 737.14

B

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.17.025

1005-8982（2016）17-0116-05

2016-06-01

李超，E-mail：li4307chao@126.com