兒童患者中分離189株卡他莫拉菌的分布和耐藥性分析

鄭紅艷，宋文琪， 董 方，劉錫青，甄景慧

·論著·

兒童患者中分離189株卡他莫拉菌的分布和耐藥性分析

鄭紅艷，宋文琪， 董 方，劉錫青，甄景慧

目的 研究兒童患者中分離的卡他莫拉菌臨床分布及耐藥性，指導(dǎo)臨床合理用藥。方法 對2013－2014年北京兒童醫(yī)院臨床送檢標(biāo)本分離出的189株卡他莫拉菌的分布、產(chǎn)酶情況和藥敏結(jié)果進(jìn)行回顧性分析。采用紙片擴(kuò)散法作藥敏試驗，頭孢硝噻吩紙片法測定β內(nèi)酰胺酶。依照2013年CLSI M45-A2標(biāo)準(zhǔn)判斷結(jié)果。結(jié)果 卡他莫拉菌多分離于嬰幼兒患者，?；旌掀渌?xì)菌。β內(nèi)酰胺酶陽性率為95.7 %，對阿莫西林-克拉維酸、甲氧芐啶-磺胺甲唑、四環(huán)素耐藥率分別為0、2.1 %和4.2 %。對紅霉素和阿奇霉素耐藥嚴(yán)重，耐藥率達(dá)到了82.5 %和83.1 %。結(jié)論 兒童患者攜帶的卡他莫拉菌β內(nèi)酰胺酶陽性率很高， 其高產(chǎn)酶特點使青霉素類藥物不能作為臨床一線用藥。卡他莫拉菌對大環(huán)內(nèi)酯類耐藥性較高，應(yīng)引起臨床重視，并加強(qiáng)對其耐藥監(jiān)測。

卡他莫拉菌； β內(nèi)酰胺酶； 耐藥性； 兒童

卡他莫拉菌（Moraxella catarrhalis），是一種寄生于上呼吸道黏膜的條件致病菌.可以單獨或與其他病原菌共同作用引起多種急慢性感染。LEESIK等［1］報道，卡他莫拉菌是兒童社區(qū)獲得性肺炎的第3位最常見致病菌，僅次于流感嗜血桿菌和肺炎鏈球菌，該菌還可引起感染性心內(nèi)膜炎、血流感染、骨髓炎等嚴(yán)重感染［2］。在我國兒科臨床中，頭孢菌素類、青霉素類及大環(huán)內(nèi)酯類抗生素是治療呼吸道感染的主要經(jīng)驗性用藥。隨著臨床抗生素的廣泛應(yīng)用，卡他莫拉菌的耐藥菌株也日益增多，給臨床治療帶來很大困難。本研究對臨床分離的189株卡他莫拉菌進(jìn)行回顧性調(diào)查研究，以期為臨床合理應(yīng)用抗菌藥物提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 189株卡他莫拉菌分離自2013年1月1日－2014年12月31日北京兒童醫(yī)院細(xì)菌室門診及住院患兒的各種標(biāo)本，剔除同一患者相同部位的重復(fù)菌株。

1.1.2 試劑來源 標(biāo)準(zhǔn)抗菌藥物紙片阿莫西林-克拉維酸（30 μg）、四環(huán)素（10 μg）、紅霉素（5 μg）、阿奇霉素（15 μg）、甲氧芐啶-磺胺甲唑（25 μg）和用于測定β內(nèi)酰胺酶的頭孢硝噻吩紙片均購自英國OXOID公司。血、麥康凱以及巧克力平皿購自法國生物梅里埃公司，MH培養(yǎng)基由本室自行配制并施行嚴(yán)格的質(zhì)量控制，MH干粉購自英國OXOID公司。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 標(biāo)本類型包括痰、支氣管灌洗液、鼻咽分泌物、咽拭子、眼分泌物、皮膚分泌物。其中痰標(biāo)本先進(jìn)行涂片鏡檢，每個低倍鏡視野內(nèi)鱗狀上皮細(xì)胞少于10個，白細(xì)胞大于25個，視為合格標(biāo)本。

1.2.2 細(xì)菌培養(yǎng)及鑒定 所有標(biāo)本按《全國臨床檢驗操作規(guī)程》第3版進(jìn)行分離培養(yǎng)。將合格標(biāo)本以劃線分離法分別接種于1塊巧克力平皿、1塊麥康凱平皿和1塊血平皿，5 % CO2孵箱37℃ 培養(yǎng)18 ～24 h。根據(jù)血平皿上菌落形態(tài)（灰白色、濕潤、有珠光且用接種環(huán)推之可移動）、革蘭染色（陰性雙球菌）、生化反應(yīng)（氧化酶陽性、DNA酶陽性、硝酸鹽還原試驗陽性、葡萄糖陰性）等鑒定。

1.2.3 藥敏試驗 根據(jù)少見細(xì)菌/苛養(yǎng)菌的藥敏指南2013年CLSI M45-A2，使用紙片擴(kuò)散法，對阿莫西林-克拉維酸、四環(huán)素、甲氧芐啶-磺胺甲唑、阿奇霉素和紅霉素進(jìn)行藥敏試驗。具體操作：挑取瓊脂平皿上形態(tài)相同的菌落，用等滲鹽水制成0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙?，用無菌棉拭子均勻涂布于MH平皿，待培養(yǎng)基表面水分被瓊脂完全吸收后，貼藥敏紙片，每張紙片間距不小于24 mm，紙片中心距平皿邊緣不小于15 mm。在37℃，5 % CO2環(huán)境下培養(yǎng)16～18 h后，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑并記錄結(jié)果。

1.2.4 β內(nèi)酰胺酶測定 頭孢硝噻吩紙片濕潤，涂上卡他莫拉菌菌落，觀察紙片顏色變化，10 min內(nèi)變紅表示β內(nèi)酰胺酶陽性，不變色為陰性。

1.2.5 統(tǒng)計分析 采用WHONET 5.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 菌株分布

2.1.1 年齡 患兒年齡為1個月～17歲， 男111例，女78例。189株卡他莫拉菌中分離自1個月～1歲59例（31.2 %），＞1～3歲78例（41.3 %），4～6歲36例（19.0 %），＞6～17歲16例（8.5 %）。

2.1.2 科室 189株卡他莫拉菌分離自住院患者186株，占98.4 %；門診3株，占1.6 %。住院患者分布15個科室，其中以呼吸科的檢出率最高為40.7 %；其次是內(nèi)科綜合病房（中西醫(yī)結(jié)合病房）為20.1 %，兒童重癥監(jiān)護(hù)病房（PICU）7.4 %，耳鼻喉科4.8 %，皮膚科4.2 %，內(nèi)分泌科3.7 %，外科及神經(jīng)內(nèi)科均占3.2 %，消化科2.7 %，感染科、新生兒內(nèi)科及風(fēng)濕免疫科均占2.1 %，血液科1.1 %，腎內(nèi)科及心內(nèi)科均占0.5 %。

2.1.3 標(biāo)本類型 主要來源于呼吸道分泌物，共183株占96.8 %，其中上呼吸道分泌物24株（12.7 %），包括咽拭子8株（4.2 %）、鼻咽分泌物16株（8.5 %），下呼吸道分泌物159株（84.1 %），包括痰121株（64.0 %）、支氣管灌洗液38株（20.1 %），陰道分泌物2株（1.0 %），眼分泌物1株（0.5 %），皮膚分泌物3株（1.6 %），其中口周2株（1.0 %）、鼻部1株（0.5 %）。

2.2 復(fù)數(shù)菌分離情況

在189例分離出卡他莫拉菌的患兒中，121例（64.0 %）單純分離出卡他莫拉菌；同時分離出復(fù)數(shù)菌68例（36.0 %），并存1種菌64例（33.9 %）；并存2種菌4例（2.1 %），以肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌最多，分別占18.5 %和9.5 %，其他依次為腸桿菌科4.8 %、金黃色葡萄球菌4.2 %，鏈球菌屬1.1 %。表明呼吸道感染患兒同時攜帶多種呼吸道條件致病菌的情況較為多見。

2.3 藥敏試驗

189株卡他莫拉菌中β內(nèi)酰胺酶陽性株占95.7 %。藥敏試驗結(jié)果顯示，189株卡他莫拉菌對阿莫西林-克拉維酸100 %敏感，對甲氧芐啶-磺胺甲唑和四環(huán)素也較為敏感，耐藥率僅2.1 %和4.2 %，對紅霉素和阿奇霉素則耐藥嚴(yán)重，耐藥率分別達(dá)到了82.5 %和83.1 %。見表1。

表1 卡他莫拉菌對抗菌藥物的敏感率和耐藥率Table1 Susceptibility of the Moraxella catarrhalis strains form children to antimicrobial agents

3 討論

卡他莫拉菌是引起嬰幼兒呼吸系統(tǒng)感染的常見病原菌之一，并在健康嬰幼兒鼻咽部具有較高的定植率。此外，該菌偶爾定植于結(jié)膜和生殖道。研究表明，定植是感染發(fā)生的前提［3］。當(dāng)呼吸道局部免疫功能低下或黏膜屏障受損時，該菌可自呼吸道定植的部位向鄰近區(qū)域擴(kuò)散出現(xiàn)感染的臨床癥狀。本次檢測結(jié)果，卡他莫拉菌主要分離自呼吸道分泌物，占96.8 %，尤其以下呼吸道為主，占84.1 %，陰道分泌物、眼分泌物分別占1.0 %、0.5 %， 皮膚分泌物來自口周和鼻部?？ㄋ陌l(fā)病機(jī)制主要包括：通過黏附因子黏附于呼吸道，侵入呼吸道上皮細(xì)胞與咽部淋巴組織，血清抵抗型菌株抑制補(bǔ)體激活，破壞先天性免疫反應(yīng)，形成細(xì)菌生物膜等。

從卡他莫拉菌陽性患兒的年齡構(gòu)成中，我們發(fā)現(xiàn)該菌的感染多見于嬰幼兒。本次檢測結(jié)果顯示，卡他莫拉菌主要感染≤3歲患兒，占72.5 %。楊海娟等［4］研究也顯示，3歲及以下患兒卡他莫拉菌感染率明顯高于4歲以上患兒；王傳清等［5］研究卡他莫拉菌感染病例中3歲以內(nèi)兒童占85.9 %；說明3歲以下嬰幼兒是卡他莫拉菌感染的高危人群。其易感原因可能是嬰幼兒攜帶卡他莫拉菌數(shù)量較大。有報道，77.5 %兒童在2歲以前都曾攜帶過卡他莫拉菌，其攜帶率隨著年齡的增長而減少［6］。兒童呼吸道局部免疫功能低下或黏膜屏障受損可以成為該菌主要感染誘發(fā)因素。3歲以上兒童，免疫系統(tǒng)的發(fā)育逐漸完善，而且隨年齡的增長，氣道局部分泌型IgA 增加，呼吸道局部黏膜的防御能力增強(qiáng)，感染率降低［7］。

卡他莫拉菌陽性患兒同時分離出其他呼吸道病原菌的情況較為多見。羅蓉等［8］分離到666株卡他莫拉菌中，42 %同時分離到其他細(xì)菌，其中肺炎鏈球菌12 %、副流感嗜血桿菌11.4 %。本研究結(jié)果與之相似，189株卡他莫拉菌中，36.0 %同時分離到其他細(xì)菌，肺炎鏈球菌18.5 %、流感嗜血桿菌9.5 %。有研究顯示，卡他莫拉菌產(chǎn)酶耐藥株與其他致病菌（肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌等）感染共存時，耐藥菌株不僅可以保護(hù)自身不被殺滅，其產(chǎn)生的β內(nèi)酰胺酶還可使對其他抗菌藥物敏感的細(xì)菌得以生存，進(jìn)而間接發(fā)揮致病作用［9］。因此，在臨床治療時應(yīng)同時考慮這3種常見菌的耐藥情況，合理選用抗生素。

卡他莫拉菌耐藥的主要原因是產(chǎn)β內(nèi)酰胺酶。該酶稱為BRO內(nèi)酰胺酶，是一種由染色體基因編碼合成的脂蛋白，可快速水解氨芐西林，使其耐藥率升高。BRO內(nèi)酰胺酶分為BRO-1、BRO-2及BRO-3，其中90 %左右產(chǎn)酶株有BRO-1基因，僅不到10 %有BRO-2基因，產(chǎn)BRO-3的菌株少見［10］。有研究表明，不同的BRO酶對抗生素的耐藥性有不同的影響，以產(chǎn)BRO-1的菌株耐藥性最強(qiáng)［11］，且更易與細(xì)菌或病毒合并存在，臨床癥狀更重，治愈率更低。本組分離的189株卡他莫拉菌的產(chǎn)酶率高達(dá)95.7 %，與相關(guān)報道的產(chǎn)酶率類似［9，12］。產(chǎn)β內(nèi)酰胺酶類菌株通常對阿莫西林、氨芐西林等青霉素類抗生素高度耐藥，臨床不宜用這些抗菌藥物治療卡他莫拉菌所致感染。

卡他莫拉菌對大環(huán)內(nèi)酯類的耐藥率存在顯著差別。本組資料中細(xì)菌對紅霉素和阿奇霉素耐藥率分別達(dá)到了82.5 %和83.1 %。 與潘韶霞等［13］和胡龍華等［14］分離出的卡他莫拉菌中70.0 %和92.3 %菌株對紅霉素耐藥的結(jié)果相近。明顯高于張泓等［15］報道的45.1 %菌株對阿奇霉素耐藥以及付盼等［16］報道的對紅霉素和阿奇霉素的耐藥率均在40 %左右。分析其耐藥性差異原因可能是：①流行區(qū)域差異。有資料顯示，不同城市間卡他莫拉菌對大環(huán)內(nèi)酯類的不敏感率存在顯著差別，相對靠北部城市如北京和濟(jì)南，其不敏感率明顯高于相對靠南部城市［17］，這與不同城市間抗生素的使用和管理程度不同、人口密度不同、社會經(jīng)濟(jì)條件的差異性等有關(guān)；②菌株來源不同。本研究為兒童，且98.4 %均為住院患者， 可能與近年來呼吸道感染患兒大量接受大環(huán)內(nèi)酯類藥物治療，促進(jìn)了耐藥菌株的產(chǎn)生有關(guān)；③其他因素。推測在我國食用動物飼料中存有大環(huán)內(nèi)酯類抗生素可能是導(dǎo)致該類抗生素耐藥性增加的原因［18］。

到目前為止，卡他莫拉菌對大環(huán)內(nèi)酯類耐藥的具體機(jī)制仍不清楚，有研究稱可能與23S rRNA位點發(fā)生突變有關(guān)，在23S rRNA中，A2982T、A2796T及A2983T等突變位點與大環(huán)內(nèi)酯類耐藥可能有關(guān)［17］；王頻佳等［19］在研究中提出BRO酶不僅能夠影響β內(nèi)酰胺酶類抗生素，還能影響大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。王艷等［18］也在研究中推測導(dǎo)致紅霉素的耐藥機(jī)制可能與編碼β內(nèi)酰胺酶的基因存在某種聯(lián)系。兩者是否存在聯(lián)系，還有待進(jìn)一步研究。

總之，目前卡他莫拉菌分離株中產(chǎn)酶株比例極高，對大環(huán)內(nèi)酯類耐藥性明顯上升，應(yīng)長期連續(xù)監(jiān)測卡他莫拉菌的感染及耐藥情況，以便提示臨床正確選擇抗生素，防止濫用抗生素而誘導(dǎo)細(xì)菌的耐藥性變遷。

［1］LEESIK H，ANI U，JUHANI A，et a1. Microbial pathogens of adult comnlunity-acquired pneumonia in Southern Estonia［J］. Medicina（Kaunas），2006，42（5）：384-394.

［2］WIRTH T，MORELLI G，KUSECEK B，et a1. The rise and spread of a new pathogen：seroresistant Moraxella caratrhalis ［J］. Genome Res，2007，17（11）：1647-1656.

［3］SY MG，ROBINSON JL.Community-acquired Moraxella catarrhalis pneumonia in previously healthy children［J］. Pediatr Puhnonol，2010，45（7）：674-678.

［4］楊海娟，陳霞，吳佳輝，等.患兒呼吸道感染91 例卡他莫拉菌及耐藥性分析［J］.陜西醫(yī)學(xué)雜志，2015，44（5）：527-529.

［5］王傳清，楊昌生，王愛敏，等. 小兒呼吸道卡他莫拉菌感染的臨床調(diào)查［J］.中華兒科雜志， 2002，40（8）：499-500.

［6］RESSEAU S，WIEEHMANN K，MODERER S，et a1. Moraxella catarrhalis-infected alveolar epithelium induced monocyte recruitment and oxidative burst［J］. Am J Respir Cell Mol Biol， 2005， 32（2）： 157-166.

［7］張玲，程方雄，劉瑾，等.卡他莫拉菌臨床分布及耐藥性分析［J］.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2014，24（3）：545-546.

［8］羅蓉，黃英，劉嵐，等.小兒下呼吸道感染中卡他莫拉菌的分離特點與耐藥性分析［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2007，29（18）：1818-1820.

［9］MORRISSEY I，MAHAR K，WILLIAMS L，et al. Nonsusceptibility trends among Haemophilus influenzae and Moraxella catarrhalis from community-acquired respiratory tract infections in the UK and Ireland，1999-2007［J］. J Antimicrob Chemother，2008，62（2）：97-103.

［10］LARK RL，CHENWETH C.Antimicrohial resistancd in conlmunity acquired respiratory tract pathogens［J］. Comp Ther，1999，25（1）：20-29.

［11］ESEL D，AY-ALTINTOP Y，YAGMUR G，et a1. Evaluation of susceptibility patterns and BRO beta-lactamase types among clinical isolates of Moraxella catarrha1is［J］. Clin Microbiol Infect，2007，13（10）：1023-1025.

［12］JACOBS MR， FELMINGHAM D， APPELBAUM PC， et al. The Alexander project 1998-2000： susceptibility of pathogens isolated from community-acquired respiratory tract infection to commonly used antimicrobial agents［J］. J Antimicrob Chemother，2003， 52（2）： 229-246.

［13］潘韶霞，徐洪玉，潘韶華，等. 卡他莫拉菌的致病性及耐藥性的臨床研究［J］. 中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2003，13（ 6）：583-585.

［14］胡龍華，余理智，賈坤如，等. 卡他布蘭漢菌感染及其耐藥分析［J］. 中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2002，12（7）：551-552.

［15］張泓，孔菁，王傳清，等.2010中國CHINET流感嗜血桿菌和卡他莫拉菌耐藥性監(jiān)測［J］.中國感染與化療雜志，2012，12（3）：180-184.

［16］付盼，何磊燕，王愛敏，等. 2006至2009年復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院呼吸道感染患兒5種常見細(xì)菌構(gòu)成比和耐藥性分析［J］.中國循證兒科雜志，2010，5（5）：371-376.

［17］劉亞麗，趙春江，陳民鈞，等.大環(huán)內(nèi)酯類不敏感卡他莫拉菌的分子流行病學(xué)特點及耐藥機(jī)制［J］.中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2012，35（3）：247-252.

［18］王艷，沈敘莊，袁林，等. 北京地區(qū)兒童攜帶卡他莫拉菌耐藥現(xiàn)狀的研究［J］.中國實用兒科雜志，2004，19（8）：491-493.

［19］王頻佳，謝成彬，吳雨露. 兒童呼吸道卡他莫拉菌分離株耐藥性與BRO基因分型研究［J］.臨床兒科雜志，2013，31（8）：719-722.

Distribution and antimicrobial resistance of 189 strains of Moraxella catarrhalis in children

ZHENG Hongyan， SONG Wenqi， DONG Fang， LIU Xiqing， ZHEN Jinghui.
（National Key Discipline of Pediatrics； Bacteriology Laboratory， Capital Medical University， Ministry of Education， Beijing Children's Hospital Affiliated to Capital University of Medical Sciences， Beijing 100045， China）

Objective To explore the distribution and antibiotic resistance of Moraxella catarrhalis strains for rational antimicrobial therapy. Methods A retrospective analysis was conducted for 189 strains of M. catarrhalis， which were isolated in our hospital during the period from January 2013 to December 2014. These M. catarrhalis strains were analyzed in terms of distribution， antimicrobial susceptibility results and the prevalence of beta-lactamase. Kirby-Bauer method was used to determine the susceptibility of these strains. Beta-lactamases were detected by nitrocefin disk test. Results were analyzed according to the CLSI M45-A2 2013 breakpoint. Results M. catarrhalis infection was popular in infants， frequently mixed with other pathogens. The prevalence of beta-lactamase positive M. catarrhalis was 95.7 %. M. catarrhalis strains showed relatively lower resistance rate to amoxicillin-clavulanic acid （0）， trimethoprim-sulfamethoxazole （2.1 %） and tetracycline （4.2 %）， but 83.1 % were resistant to azithromycin and 82.5 % resistant to erythromycin. Conclusions The prevalence of beta-lactamase positive M. catarrhalis is quite high in children. Penicillins may not be suitable for such bacterial strains. The M. catarrhalis strains from children also showed high resistance to macrolides. Attention should be paid to this issue and its monitoring.

Moraxella catarrhalis； beta-lactamase； antibiotic resistance； children

R378

A

1009-7708 （ 2016） 05-0614-04

10.16718/j.1009-7708.2016.05.015

2015-09-29

2015-12-27

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院細(xì)菌室，兒科學(xué)國家重點學(xué)科，北京 100045。

鄭紅艷（1984—），女，碩士，檢驗醫(yī)師，主要從事細(xì)菌耐藥性研究。

董方，E-mail：fangd32@163.com。