同步輻射微區(qū)X射線熒光光譜法原位分析蚯蚓中K，Ca，Cu，Zn和Pb

袁靜 羅立強

摘要：為了研究重金屬元素在蚯蚓體內(nèi)的富集和存儲機制，使用同步輻射微區(qū)X射線熒光光譜法（μSRXRF）研究了K，Ca，Cu，Zn和Pb元素在生長于南京棲霞山鉛鋅礦區(qū)附近菜園土壤的蚯蚓體內(nèi)的分布特征，發(fā)現(xiàn)Pb主要富集在蚯蚓后部消化道周圍的區(qū)域，Zn，Cu在蚯蚓后部的分布規(guī)律與Pb 類似，推測后部消化道周圍區(qū)域的分布是蚯蚓為了阻斷毒性重金屬元素威脅而特有的富集和存儲方式。5種元素的相關(guān)性表明，Pb和Zn相關(guān)性最高，存儲方式最為相似，Pb與K和Ca在蚯蚓后部的分布呈顯著正相關(guān)，說明毒性元素Pb在蚯蚓體內(nèi)的富集和存儲過程可能伴隨著其它元素的吸收。本研究表明， μSRXRF在原位微區(qū)分析蚯蚓樣品的元素空間分布方面具有很大優(yōu)勢，而進(jìn)一步開展土壤及蚯蚓中Pb的形態(tài)研究，是研究重金屬脅迫下蚯蚓解毒機制的重要前提。

關(guān)鍵詞 ：同步輻射微區(qū)X射線熒光光譜法； 蚯蚓； 原位分析； 鉛； 存儲機制

1 引 言

近年來，Pb等具有潛在毒性的重金屬元素污染問題日益增多，對環(huán)境和人類存在極大的生態(tài)暴露風(fēng)險[1]。特別是因礦山開發(fā)引起的環(huán)境問題，受到了廣泛關(guān)注[2，3]。隨著研究的深入，生物對重金屬的耐性機制或解毒機理，引起研究者們廣泛關(guān)注。楊紅霞等[4]用LAICPMS對Cd超富集植物印度芥菜中的7種元素（Cd，P，S，K，Ca，Cu，Zn）進(jìn)行原位微區(qū)分析，通過研究這些元素在樣品中的分布特征，揭示超富集植物中Cd的遷移和富集規(guī)律。Shen[5]用μSRXRF研究含Pb營養(yǎng)液培養(yǎng)的超富集植物擬南芥中鉛的分布規(guī)律，獲取的元素二維分布圖顯示種皮中Pb濃度最高，根中Pb濃度比莖和葉片中高。在陸地生態(tài)毒理學(xué)中，除了土壤、植物等，蚯蚓也擔(dān)任了重要角色。蚯蚓被稱為“生態(tài)系統(tǒng)工程師”[6]，一方面，它通過自身的代謝活動在土壤生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮作用，如建立土壤團(tuán)聚體，形成利于水分和空氣流通的孔隙[7]，對土壤酶活性、土壤有機質(zhì)及植株的生長發(fā)育[8]等產(chǎn)生有益影響；另一方面，蚯蚓能夠在多種類型被污染的土壤中定居，并且在一定程度上富集重金屬，免受重金屬的毒害[9]。蚯蚓對毒性元素的耐受性引起了研究者的關(guān)注。

重金屬在生物體內(nèi)的微區(qū)分布已成為解讀生物對毒性元素耐性機制和解毒機理的關(guān)鍵信息，其重要性已得到普遍認(rèn)可。研究者采用電子探針[10]、激光剝蝕電感耦合等離子體質(zhì)譜[4]、高分辨掃描電鏡和X射線能譜Mapping技術(shù)[11]、同步輻射微區(qū)X射線熒光（μSRXRF）[12～16]等方法對元素分布進(jìn)行了大量研究。在眾多的微區(qū)分析技術(shù)中，μSRXRF技術(shù)因其光源的高亮度、光束焦斑大小、高分辨率等特性，使探測具有更高的靈敏度和更低檢出限，成為微量重金屬元素微區(qū)分布分析的有力工具。例如，有研究者對在Pb（NO3）2溶液中萌芽的玉米種子進(jìn)行SRXRF掃描，發(fā)現(xiàn)富集Pb的主要部位是種皮和胚結(jié)構(gòu)[16]。Fukuda等[12]用μSRXRF技術(shù)分析其它方法很難探測到的Cd元素，發(fā)現(xiàn)Cd高度富集在葉片表面的香毛簇。Kopittke等[13]用配備快速探測器的μSRXRF對經(jīng)過As和As浸泡24 h的新鮮豇豆根部組織進(jìn)行探測，得到的As的分布圖顯示，As主要積累在根部的內(nèi)皮和中柱鞘細(xì)胞中。Morgan等[14，15]用μSRXRF對蚯蚓組織鮮樣進(jìn)行微區(qū)掃描，獲取元素Pb， Zn， Ca的分布規(guī)律。

目前，對各類植物樣品進(jìn)行元素微區(qū)分布的研究較多，而對土壤動物蚯蚓的研究較少。本研究以鉛鋅礦區(qū)的蚯蚓樣品為研究對象，首先用同步輻射微束XRF對樣品進(jìn)行原位XRF分析，判定蚯蚓體內(nèi)富集的重金屬元素，再通過對樣品進(jìn)行掃描獲取蚯蚓體內(nèi)元素分布特征，為揭示Pb等重金屬元素從土壤到蚯蚓的遷移規(guī)律以及在蚯蚓體內(nèi)的富集機理提供有力信息。

2 實驗部分

2.1 樣品采集和處理

將蚯蚓從土壤中挖掘出來并連同土壤一同帶回實驗室。從土壤中取出蚯蚓，用水清洗多次，洗凈后再用18 MΩ cm超純水清洗3次，置于放有濕潤濾紙的皮氏培養(yǎng)皿中凈化48 h[17，18]，保證蚯蚓腸道中泥土充分排出，以防干擾蚯蚓體內(nèi)的金屬元素分布。凈化后，將蚯蚓浸入沸水中30 s[19]，整條蚯蚓粘貼在無硫膠帶上，用鋁箔包裹，留出空間以免破壞蚯蚓，用針把鋁箔刺出若干小孔，最后將樣品放入冷凍干燥機中干燥3天。用無硫膠帶固定在樣品架上待測。

3 結(jié)果與分析

3.1 實驗區(qū)概況

南京棲霞山鉛鋅礦區(qū)已有50多年的開采歷史，重金屬元素伴隨礦山開采所排放的廢氣、廢水和廢渣釋放到環(huán)境中，并不斷積累，導(dǎo)致當(dāng)?shù)氐纳鷳B(tài)環(huán)境嚴(yán)重惡化。已有研究發(fā)現(xiàn)，土壤和植物中Pb、Zn等重金屬含量較高，隨后又發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)鼐用耦^發(fā)中鉛的主要來源是外源性鉛，并且人體中血鉛和骨鉛含量均較高[20]。說明該地區(qū)重金屬污染已經(jīng)由生態(tài)環(huán)境通過食物鏈進(jìn)入到人體。表1為蚯蚓樣品采集區(qū)的土壤EDXRF分析數(shù)據(jù)，每個樣品平行測定3次取平均值，并與國家土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行對比。所選用的EDXRF分析方法為專門針對礦區(qū)土壤中Pb、Zn等幾種重金屬元素而建立的方法[21]，測定較為準(zhǔn)確。由表1可知，蚯蚓生存的土壤中Pb和Zn污染嚴(yán)重。

3.2 土壤和蚯蚓樣品μSRXRF原位分析

樣品中元素的熒光譜峰識別與準(zhǔn)確測定是進(jìn)行感興趣元素分布特征研究的前提。首先對蚯蚓樣品進(jìn)行粗掃，在Pb， Zn等重金屬元素特征峰較為顯著的點進(jìn)行單點采譜。用相同的方法也對土壤樣品進(jìn)行單點采譜，獲得的蚯蚓和土壤的熒光譜圖如圖1所示。圖1A所反映的情況基本與EDXRF測試結(jié)果吻合。圖1B中，Pb， Zn等重金屬元素均能觀察到明顯譜峰，說明此蚯蚓樣品體內(nèi)已經(jīng)富集了一定量的Pb和Zn重金屬元素。

3.3 譜線干擾識別與感興趣區(qū)的選擇

對原位μSRXRF分析獲得的譜圖進(jìn)行元素特征峰和譜線干擾識別，進(jìn)而圈定各元素的感興趣區(qū)。感興趣區(qū)能量范圍是決定掃描結(jié)果準(zhǔn)確性的關(guān)鍵。

本次實驗中，特別對Pb的感興趣區(qū)進(jìn)行了選定?？捎^察到樣品中發(fā)射出來的Pb的熒光譜線Pb L3M5（10.5515 keV）和Pb L2M4（12.614 keV），通常圈定Pb L3M5和Pb L2M4兩個感興趣區(qū)以保證有足夠的熒光強度。但從圖1可見，此樣品中含有As元素，而As KL3（10.543 keV）和Pb L3M5 （10.5515 keV）存在嚴(yán)重干擾，因而為避免與As信號重疊，選擇Pb L2M4（12.614 keV）作為Pb的分析線[21]，圈定12.35～12.90 keV作為Pb的感興趣區(qū)。值得注意的是，在Se KL3存在一個較明顯的峰，說明樣品中含有一定量的Se，而在感興趣區(qū)（12.35～12.90 keV）內(nèi)Pb L2M4與Se的Kβ（KM3，KN2，3，KM2）有重疊，盡管Pb L2M4的激發(fā)效率為0.7878，而Se的3條Kβ線的激發(fā)效率分別為0.0867，0.0046和0.0449，干擾較??； 同時， Se KL3明顯低于Pb L3M5，據(jù)此可知，在Pb L2M4峰位觀察到的譜線強度主要來自Pb本身。但為了更準(zhǔn)確甄別Pb的分布規(guī)律，仍圈定（11.00～11.50 keV）作為Se元素的感興趣區(qū)。各元素的感興趣區(qū)能量范圍參見表2。

3.4 Pb與其它元素在蚯蚓中的分布

曾有研究者將蚯蚓解剖為幾個不同的部分，用ICPOES分別進(jìn)行定量分析[22]。也有研究者對蚯蚓進(jìn)行切片后。觀察元素在切面的分布規(guī)律[14]。對整只蚯蚓進(jìn)行原位微區(qū)掃描分析的較少，本研究嘗試?yán)鋬龈稍锖笾苯舆M(jìn)行掃描，盡量減少人為操作可能帶來的元素分布差異，并能在整體水平上更直觀地觀察蚯蚓體內(nèi)元素的分布規(guī)律。

由于本研究旨在觀察每個元素在樣品中的分布規(guī)律，而非對元素進(jìn)行定量分析，因而對于普遍計數(shù)較低的圖譜可通過igor軟件進(jìn)行信號處理，以方便觀察各元素的分布規(guī)律。如圖2所示，右端是蚯蚓的頭部，左端是蚯蚓尾部，紅色代表元素含量高，紫色代表元素含量較低。以下分為3類討論：宏量營養(yǎng)元素K和Ca、必需微量元素Zn和Cu、毒性元素Pb。

K和Ca元素是生物體營養(yǎng)元素，有維持細(xì)胞正常生理狀態(tài)的功能。由圖2可見，Ca的分布主要集中在蚯蚓的前半部分，后半部分含量較低；在蚯蚓頭部和中間部位有兩個小范圍內(nèi)K濃度高，其余部位的K濃度分布較均勻，這與K遷移能力強，具有維持細(xì)胞滲透壓的功能相符。

Zn和Cu元素在蚯蚓的前半部分有明顯分布，但卻與K和Ca不同，可能是由于兩者作為生物體內(nèi)必需微量營養(yǎng)元素而發(fā)揮作用[14]。值得注意的是，Zn在蚯蚓后部消化道位置有非常明顯的分布高點，而Cu沒有這一現(xiàn)象，結(jié)合該地區(qū)土壤中Zn污染嚴(yán)重，這一分布規(guī)律可能與過量Zn元素的存儲或解毒機制有關(guān)。

Pb在蚯蚓前部分布較少，主要分布于后部消化道，佐證了一些通過蚯蚓前部和后部分離后分別進(jìn)行測定得到的結(jié)果[22]。分布規(guī)律與Zn在后部的分布相似?？紤]到Pb是該地區(qū)的主要污染元素，而Pb又非生命元素，再次印證這一分布規(guī)律與重金屬元素在蚯蚓體內(nèi)的解毒機制相關(guān)。觀察Pb和Se的分布圖，Se含量最高的部位在蚯蚓的頭部，Pb的高含量區(qū)域位于蚯蚓的后部，并且在中部有一個高點（這一規(guī)律可通過每個元素的SRXRF數(shù)據(jù)得到印證）。

以往研究表明，生物體內(nèi)細(xì)胞和組織中金屬離子的平衡常通過對金屬的鍵合或者隔離實現(xiàn)。自由的金屬通過與蛋白質(zhì)的氨基或者巰基鍵合，對細(xì)胞系統(tǒng)構(gòu)成潛在威脅，從而影響結(jié)構(gòu)和功能的完整性[23]。受體生物會對金屬的入侵進(jìn)行動態(tài)反應(yīng)調(diào)節(jié)，對于必需金屬元素Zn， Cu和Fe，通常通過復(fù)雜的通道吸收和排泄，同時采取一定的隔離或隱藏機制維持體內(nèi)這些金屬離子的生物活性水平。而對于非必需金屬或類金屬元素，在生物體內(nèi)，可能和與其配位方式及其它物理化學(xué)性能相似的金屬元素具有類似的遷移路徑[24]。因此，推測Pb， Zn， Cu等重金屬元素在蚯蚓后部消化道部位的分布屬于一種隔離或隱藏機制，以阻斷重金屬遷移到其它器官，進(jìn)而減少毒性威脅。有毒元素主要分布于蚯蚓后部消化道區(qū)域，可能是因為帶有有毒元素的物質(zhì)經(jīng)過機體消化后，最先到達(dá)該區(qū)域的細(xì)胞[25]。

3.5 元素分布的相關(guān)性分析

對SRXRF分析獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行元素相關(guān)性分析，有助于對感興趣元素之間的關(guān)系及蚯蚓體內(nèi)解毒機制的理解。相關(guān)性研究主要針對毒性元素及過量的重金屬元素，由圖2可知，毒性重金屬元素主要分布于蚯蚓的后部消化道表面區(qū)域。因此選取蚯蚓后部共1350個點進(jìn)行分析。

相關(guān)性分析結(jié)果表明，Pb與K，Ca，Cu，Zn強度分布呈正相關(guān)（R2>0.5， 樣品點數(shù)n=1350，圖3）。Pb與K，Ca具有一定的相關(guān)性，說明重金屬元素在蚯蚓后部的遷移和存儲過程可能伴隨著其它元素的吸收。而Pb與Cu，Pb與Zn呈顯著正相關(guān)（R2PbCu=0.6733， R2PbZn=0.8582， 樣品點數(shù)n=1350），說明作為非必需有毒元素Pb，在某種程度上可能與Zn和Cu這類與其配位方式相似的必需金屬元素具有相似的遷移和存儲方式。有研究顯示，Pb， Zn等重金屬元素富集存于蚯蚓后部消化道表面含有Ca和P的顆粒狀物質(zhì)“Granules”中，而Cd， Cu和As等元素存在于富含S的小顆粒中[25]。即這些重金屬元素存在于同一類物質(zhì)中，但可能以相同或不同的形態(tài)存在。這一觀點與本研究的PbZn相關(guān)性最高（R2PbZn=0.8582樣品點數(shù)n=1350）的結(jié)論符合，說明Pb和Zn元素的富集和存儲機制最為相似。

4 結(jié) 論

用μSRXRF技術(shù)原位分析了鉛鋅礦區(qū)附近菜園土壤中蚯蚓樣品的K，Ca，Pb， Cu，Zn等元素的分布特征，獲取的元素分布圖能夠簡單直觀地反映各元素的分布規(guī)律，本方法分辨率高，可多元素同時測試，是研究生物組織中元素微區(qū)分布規(guī)律的有力工具，在生態(tài)毒理學(xué)研究領(lǐng)域具有巨大應(yīng)用潛力。值得注意的是，μSRXRF掃描分析需要對每個元素的感興趣區(qū)仔細(xì)選擇才能獲得準(zhǔn)確可靠的結(jié)果。

蚯蚓能夠在重金屬污染的土壤中生存緣于其適當(dāng)?shù)慕舛緳C制，有研究表明，重金屬能夠在蚯蚓某個部位固定下來而未產(chǎn)生毒性效應(yīng)，說明這些部位可能具有儲存重金屬的容器作用[26]。本研究表明，Pb主要分布在蚯蚓后部消化道周圍，Cu和Zn在蚯蚓后部的分布規(guī)律與Pb類似，可見，在蚯蚓后部消化道表面的組織是有毒元素及過量的重金屬元素的主要富集部位，可能由于這一區(qū)域是受污染土壤經(jīng)過蚯蚓消化道之后最先到達(dá)的地方，因此在此處的富集和存儲可阻止重金屬進(jìn)一步運移到其它器官，進(jìn)而阻斷重金屬的毒性威脅。而Cu和Zn元素在前部的分布可能與其作為生物體內(nèi)必需微量元素參與生命活動有關(guān)。通過相關(guān)性分析表明，Pb和Zn的富集存儲方式最相似，并且重金屬元素在蚯蚓體內(nèi)的遷移和存儲過程伴隨著對其它元素的吸收。進(jìn)一步開展土壤及蚯蚓中Pb的形態(tài)研究，是研究重金屬脅迫下蚯蚓解毒機制的重要前提。

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Abstract To study the accumulation and storage mechanism of heavy metals in earthworms， synchrotron radiation micro Xray fluorescence （μSRXRF） was used to determine element distribution characteristics of K， Ca， Cu， Zn and Pb in earthworms living in garden around Qixiashan leadzinc mine of Nanjing. The imaging of these elements showed that Pb primarily accumulated in the region around the posterior alimentary canal. There were also Zn and Cu signals in the anterior and posterior part of earthworm， besides the distribution characters of Zn and Cu in the posterior part of earthworm were the same as that of Pb. The findings indicated that the distribution characters in the region around the posterior alimentary canal was a special accumulation and storage mechanism in earthworms for cutting the threat of toxic heavy metals. The high relationship between Pb and Zn distribution indicated that the two elements had a very similar pathway. In this study， we proved that μSRXRF had a great advantage in spatial distribution analysis of elements in earthworm samples. A further research focusing on Pb speciation in soil and earthworms is needed for understanding the detoxification mechanism in earthworms under heavy metal stress.

Keywords Synchrotron radiation micro Xray fluorescence； Earthworm； In situ analysis； Lead； Storage mechanism