鋸葉棕體細(xì)胞胚胎發(fā)生及植株再生體系的建立

彭欣怡 程琴 黃秋偉 李慧敏 王麗萍

摘 要 從鋸葉棕成熟種子中成功實(shí)現(xiàn)體細(xì)胞胚胎發(fā)生和植株再生。成熟種子放在MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，加入0.15%活性炭，452 μmol/L 2，4-D和14.7 μmol/L N6-2iP，所有成熟合子胚培養(yǎng)5周后長(zhǎng)出體胚簇，12周后，外植體轉(zhuǎn)移到2，4-D濃度減到90.4 μmol/L的MS培養(yǎng)基中進(jìn)行體胚增殖，之后體胚轉(zhuǎn)移到含有0.9， 9 μmol/L TDZ或沒(méi)有生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的基本培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)化成小植株。9 μmol/L TDZ對(duì)植株再生是無(wú)效的，然而，在0.9 μmol/L TDZ中作次培養(yǎng)有12%胚胎能長(zhǎng)成完整植株，沒(méi)有生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑中35%胚胎長(zhǎng)出嫩枝，這些嫩枝轉(zhuǎn)移到含有22.2 μmol/L NAA的培養(yǎng)基中全部都會(huì)生根。picloram和2，4-D對(duì)鋸葉棕幼苗愈傷的誘導(dǎo)效果最佳，6-BA次之，對(duì)子葉來(lái)說(shuō)，picloram和2，4-D對(duì)愈傷的誘導(dǎo)起不到任何作用，而對(duì)莖尖的誘導(dǎo)效果最好。

關(guān)鍵詞 離體培養(yǎng) ；鋸葉棕 ；體細(xì)胞胚胎 ；愈傷誘導(dǎo)

中圖分類(lèi)號(hào) S792.91 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.07.011

鋸葉棕[Serenoa repens（bartram）small]，又名鋸棕葉或鋸棕櫚，學(xué)名“沙巴棕”，屬于棕櫚科灌木植物，主要生長(zhǎng)在佛羅里達(dá)州以及南北美洲的氣候炎熱地區(qū)[1]。鋸葉棕是最理想的景觀植物，它是一種堅(jiān)韌，低維護(hù)的綠色植物，其生長(zhǎng)少受水分脅迫及植物病害和蟲(chóng)害的影響[2]。其成熟的干燥果實(shí)可供藥用，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)其提取物治療良性前列腺增生（BPH）和下尿路（LUTS）癥狀效果顯著，現(xiàn)已成為最有效的3種治療BPH植物藥物之一[3-4]。鋸葉棕作為草藥制劑價(jià)值連城，受歡迎程度也正在日益增長(zhǎng)。

鋸葉棕通過(guò)傳統(tǒng)種子繁育存在一定的局限性[5]，自然萌發(fā)需4～6個(gè)月，幼苗生長(zhǎng)緩慢，一般需要2～6年[6]，將種子繁育溫度提高到35℃，萌發(fā)時(shí)間縮短至約1個(gè)月[5]，然而，很少人清楚鋸葉棕在自然條件下的最佳生長(zhǎng)和結(jié)果條件。

植物組織培養(yǎng)是植物快速繁育的重要技術(shù)手段，通過(guò)組織培養(yǎng)可以大規(guī)模繁育基因優(yōu)良物種，進(jìn)行種質(zhì)資源保護(hù)，也可以進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。國(guó)內(nèi)尚無(wú)鋸葉棕組織培養(yǎng)的報(bào)道。本研究的宗旨是為了發(fā)展鋸葉棕體外再生的組織培養(yǎng)體系，以期為快速繁育國(guó)內(nèi)優(yōu)良稀缺植物資源提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

廣西亞熱帶作物研究所與美國(guó)加州灣食品科技公司合作引種、試種生長(zhǎng)10年的鋸葉棕種子[7]。

1.2 方法

1.2.1 外植體準(zhǔn)備

將收獲放置在陰暗干燥環(huán)境下保存1年的種子，剝?nèi)スず头N皮，在超凈臺(tái)上用無(wú)菌水洗1遍，再用0.1% 升汞搖晃消毒8 min，去掉消毒液，用無(wú)菌水沖洗3遍，每次5 min。將消毒好的種子用枝剪進(jìn)行橫切和縱切，露出種子凝膠狀的胚乳和圓錐形的胚。1粒種子1個(gè)培養(yǎng)皿。

1.2.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

用1.0 mol/L NaOH 將全部培養(yǎng)基pH值調(diào)節(jié) 為5.8，121℃高壓滅菌20 min。根據(jù)不同試驗(yàn)在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加不同種類(lèi)和濃度的激素，26℃黑暗培養(yǎng)。鋸葉棕體胚再生培養(yǎng)基和愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基見(jiàn)表1。

1.2.3 愈傷組織的誘導(dǎo)

選取已經(jīng)萌發(fā)成苗的小植株的莖尖、根尖及側(cè)根、子葉等部位以及胚簇進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)，并設(shè)置不同激素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，26℃暗培養(yǎng)40 d，觀察愈傷組織分化情況，比較愈傷組織誘導(dǎo)的結(jié)果，以確定根系外植體的最佳部位。

2 結(jié)果與分析

2.1 體細(xì)胞胚胎發(fā)生與植株再生

機(jī)械破損處理能大幅度提高鋸葉棕發(fā)芽率，發(fā)芽率可達(dá)到90%，機(jī)械破損處理是鋸葉棕最有效的促芽方式[11]，用枝剪進(jìn)行橫切和縱切，露出種胚以提高種子的萌發(fā)率。將處理好的種子每6周轉(zhuǎn)接一次新鮮MS1培養(yǎng)基（圖1a）。12周后，外植體轉(zhuǎn)移到2，4-D濃度減到90.4 μmol/L的MS2培養(yǎng)基中增殖，每個(gè)原始合子胚增殖為大約200個(gè)體細(xì)胞胚胎（圖1b），在35周內(nèi)，增殖會(huì)繼續(xù)，但在此培養(yǎng)基上培養(yǎng)不能再維持。

將體細(xì)胞胚胎分別轉(zhuǎn)移到TDZ濃度為0，0.9和9 μmol/L 的MS3培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為25℃，光照16 h/d（圖1c）。每個(gè)處理用100個(gè)體細(xì)胞胚胎實(shí)驗(yàn)，在TDZ為0的培養(yǎng)條件下，35%的胚胎長(zhǎng)出嫩芽，但不長(zhǎng)根；在0.9 μmol/L TDZ的培養(yǎng)中有12%的胚胎產(chǎn)生芽與初級(jí)根（圖1d），在含有9 μmol/L TDZ培養(yǎng)基中既不出芽也不生根。沒(méi)有生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和含有0.9 μmol/L TDZ培養(yǎng)基中誘導(dǎo)得到的小苗轉(zhuǎn)移到含有22.2 μmol/L NAA的MS4培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，培養(yǎng)8周后，所有的47株外植體都能產(chǎn)生初級(jí)根和次生根（圖1e）。

2.2 體胚愈傷組織誘導(dǎo)

棕櫚科植物誘導(dǎo)愈傷難，時(shí)間長(zhǎng)，但近期報(bào)道從油棕未成熟雄性花序成功誘導(dǎo)愈傷，其中加有激素picloram的愈傷誘導(dǎo)率為82%，萘乙酸的誘導(dǎo)率為54%[10]。鐵皮石斛已經(jīng)建立了一個(gè)高效愈傷誘導(dǎo)率的體系，將原球莖片段放在1/2 MS培養(yǎng)基上，輔有NAA，6-BA，2，4-D等激素，其中以8.8 μmol/L 6-BA的培養(yǎng)基中愈傷誘導(dǎo)率最高[9]。綜合以上信息，采用愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)已經(jīng)萌發(fā)成苗的小植株的莖尖、根尖及側(cè)根、子葉等部位以及胚簇進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)，結(jié)果顯示（表2），子葉和莖尖部位可以形成愈傷，根部和剛萌發(fā)出的體胚不能形成愈傷組織。picloram和2，4-D誘導(dǎo)莖尖效果最好，6-BA次之，picloram和2，4-D對(duì)子葉愈傷組織誘導(dǎo)無(wú)效，結(jié)果表明，莖尖是鋸葉棕最佳的愈傷誘導(dǎo)材料。

3 討論

鋸葉棕跟其他棕櫚一樣，是多年生木本單子葉植物，未成熟合子胚是胚胎發(fā)生最好的外植體。但本試驗(yàn)利用的是成熟的種子，體胚的形成也只需約1.5月。油棕成熟合子胚添加450 μmol/L picloram和2.5 g/L活性炭的胚性愈傷組織誘導(dǎo)率可以達(dá)到97.5%[10]?；钚蕴坑捎谄淠芪椒枷阕寤衔?，因此可以吸附酚類(lèi)物質(zhì)，使多酚氧化酶和過(guò)氧化物酶失活[12]，此特性在棕櫚組織培養(yǎng)中降低外植體的褐化、增強(qiáng)再生方面起到非常重要的作用[13]。因此，棕櫚組培中加活性炭是常見(jiàn)的方法[14]。不加活性炭的培養(yǎng)基，氧化性太高，所有的合子胚都褐化而不能萌發(fā)，一旦加有活性炭，沒(méi)有氧化和酶類(lèi)積累，在2周內(nèi)胚可以膨大到原來(lái)體積的4倍。5周后所有的外植體開(kāi)始長(zhǎng)出半透明的胚簇。由于活性炭也可以吸附植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子，它也可能對(duì)組培產(chǎn)生負(fù)面影響。通過(guò)放射性示蹤劑顯示，100 μmol/L 2，4-D在5 d內(nèi)被0.25%的活性炭吸附掉99.5%[15]，然而，本試驗(yàn)使用半固體培養(yǎng)基、減少活性炭濃度和增加2，4-D濃度可以增加2，4-D可利用率。雖然還不清楚在含有0.15%活性炭的半固體培養(yǎng)基中，452 μmol/L 2，4-D可利用的準(zhǔn)確百分比，但是這些培養(yǎng)條件大大增加了自由2，4-D的數(shù)量，這樣就有足夠的可利用2，4-D來(lái)誘導(dǎo)胚胎發(fā)生。

棕櫚植物主要用種子進(jìn)行繁殖，棕櫚植物的種子播種后發(fā)芽難，發(fā)芽時(shí)間長(zhǎng)，出苗不整齊是其特點(diǎn)，也是生產(chǎn)中的難點(diǎn)[16]。幼苗的愈傷誘導(dǎo)中，莖尖是最好的誘導(dǎo)材料，2，4-D和picloram是最佳的激素誘導(dǎo)劑，但在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，從1粒種子誘導(dǎo)出的愈傷組織只分化成2～3株小苗，從接種到分化成苗，花時(shí)間半年有余，還達(dá)不到擴(kuò)大數(shù)量的目的，所花時(shí)間、物力和人力也不少，所以在短期內(nèi)用少量珍稀珍貴的引種品種，進(jìn)行大量繁殖推廣較難，后續(xù)工作還需進(jìn)一步研究。

4 小結(jié)

本研究中，鋸葉棕不經(jīng)過(guò)愈傷過(guò)程直接再生，可以維護(hù)外植體來(lái)源的完整性，體細(xì)胞無(wú)性系變異較少，因此，這種再生體系更有利于繁殖棕櫚獨(dú)特基因型和種質(zhì)資源保護(hù)。更多的研究旨在考察不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合，以及不同基因型的響應(yīng)，以便建立鋸葉棕最優(yōu)的體外再生系統(tǒng)。

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