節(jié)律基因hBmal1在人結(jié)腸癌中的表達(dá)及臨床意義

魯力　熊治國　謝敏　熊莉娜

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節(jié)律基因hBmal1在人結(jié)腸癌中的表達(dá)及臨床意義

魯力1熊治國1謝敏1熊莉娜2

目的 檢測hBmal1在人結(jié)腸癌中的表達(dá)，探討其臨床意義。方法 應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測湖北省腫瘤醫(yī)院30例人結(jié)腸癌患者中hBmal1的表達(dá)，以圖像分析軟件進(jìn)行相關(guān)測定，并分析其表達(dá)與臨床及病理常用指標(biāo)的關(guān)系。結(jié)果 人結(jié)腸癌組織和癌旁正常對照組織中hBmal1表達(dá)陽性率為76.67%（23/30） vs 26.67%（8/30）（χ2=15.016，P＜0.01）；hBmal1在人結(jié)腸癌Dukes分期B、C期中強(qiáng)陽性表達(dá)率為46.15%（6/13） vs 88.24%（15/17）（χ2=6.212，P=0.013）。結(jié)論 hBmal1在人結(jié)腸癌組織中有高表達(dá)，可能與癌癥的發(fā)生發(fā)展侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。

結(jié)腸腫瘤； 基因表達(dá)； 節(jié)律基因； hBmal1基因

生物鐘是地球上的生命體為適應(yīng)周圍的環(huán)境，與外界環(huán)境（尤其是日出、日落）同步而在長期的進(jìn)化過程中形成的內(nèi)在節(jié)律。近日節(jié)律的研究涉及衰老、時差、睡眠障礙、輪班工作、節(jié)食和人類腫瘤發(fā)生、發(fā)展等問題。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)晝夜節(jié)律的打亂與乳腺癌［1］、卵巢癌、前列腺癌、腎癌［2］、非小細(xì)胞肺癌［3］、胰腺癌［4］、胃腸癌［5］等的發(fā)生相關(guān)。節(jié)律基因通過調(diào)控、干擾癌基因、抑癌基因、生物周期、血管內(nèi)皮生長因子及對于內(nèi)分泌通路的作用等多方面參與了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展［6］。本實(shí)驗(yàn)選取人結(jié)腸癌為研究對象，探討hBmal1在人結(jié)腸癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)變化，及其在不同Dukes分期結(jié)腸癌的表達(dá)。

資料與方法

一、臨床資料

選取2009年至2015年湖北省腫瘤醫(yī)院胃腸外科人結(jié)腸癌手術(shù)患者組織標(biāo)本30例，其中結(jié)腸腺癌27例（其中低分化6例，中低分化8例，中分化8例，中高分化4例，高分化1例），粘液腺癌2例，腺鱗癌1例；腫瘤侵犯及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：Dukes分期：B期13例，C期17例。自手術(shù)切除的人結(jié)腸癌及癌旁組織取材，以癌中心組織為癌癥組，以癌旁正常組織為正常對照組。30例人結(jié)腸癌患者中男19例，女11例，年齡分布于35～77歲，平均年齡59.86歲。所有病例均無糖尿病、糖耐量異常病史，術(shù)前均未作放療、化療及免疫治療。所有癌癥組織均經(jīng)病理組織學(xué)檢測確診，所有作為正常對照的斷端組織均未發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞。

二、方法

免疫組織化學(xué)染色方法檢測hBmal1的表達(dá)，采用鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物法（SABC法）對hBmal1的蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測。以磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對照，以隨試劑所附已知陽性對照片作為陽性對照。

三、染色結(jié)果觀察

使用顯微鏡及顯微攝影儀對染色組織切片進(jìn)行觀察、照相，使用全自動彩色圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析。癌癥細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為hBmal1蛋白染色陽性表達(dá)，隨機(jī)觀察5個高倍鏡視野計算均值。按癌癥細(xì)胞中陽性比例計算百分率，＜5%為-，5%～25%為1+，26%～50%為2+，＞50%為3+區(qū)分染色強(qiáng)度。最后隨機(jī)攝取5個高倍鏡視野照相。

四、統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，計數(shù)資料以百分?jǐn)?shù)表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)　果

一、hBmal1的表達(dá)和分布

hBmal1在絕大部分癌癥組標(biāo)本（23/30，76.67%）中可見著色，hBmal1蛋白以細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞（圖1）。結(jié)腸癌組織中hBmal1陽性表達(dá)率也顯著高于正常對照組織（χ2=15.016，P＜0.01）（表1）。

圖1　hBmal1的表達(dá)（×200）

表1　hBmal1在結(jié)腸癌組織、癌旁正常組織中的表達(dá)［例（%）］

二、hBmal1的表達(dá)和臨床病理因素的關(guān)系

hBmal1在Dukes分期B期中強(qiáng)陽性表達(dá)率為46.15%（6/13），C期中強(qiáng)陽性表達(dá)率為88.24%（15/17），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=6.212，P＜0.05）（表2）。

表2　hBmal1在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)和分化程度的關(guān)系［例（%）］

討　論

近日節(jié)律是身體內(nèi)部的時鐘，通過控制能量、警惕性、生長、情緒和衰老的影響來調(diào)節(jié)器官和活動、休息周期。生物鐘節(jié)律存在于健康人，然而，在早期的胃腸癌患者中，這種節(jié)律是紊亂的［7-8］。細(xì)胞生物鐘機(jī)制的變更可能在相當(dāng)大的程度上影響腫瘤的進(jìn)程和對化療藥物的耐藥性，同時，晝夜節(jié)律活動的改變和腎上腺皮質(zhì)的分泌活動伴隨著結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移患者的低存活率［9］。目前根據(jù)腫瘤生長的節(jié)律特點(diǎn)，選擇最適合時間進(jìn)行治療，以達(dá)到最大的療效和最小的毒副作用，即腫瘤時間治療在臨床已經(jīng)取得了滿意的效果［10-12］。

Bmal1（brain and muscle ARNT-like-1），又名MOP3和芳烴受體核轉(zhuǎn)位蛋白3（ARNT3），是1997年Ikeda和Nomura發(fā)現(xiàn)，長32 kb，其編碼產(chǎn)物也屬bHLH-PAS家族成員。Bmal1在小鼠的視交叉上核中的表達(dá)呈明顯的近日節(jié)律，Bmal1敲除的小鼠在持續(xù)黑暗的條件下近日節(jié)律完全喪失。Bmal1除了參與生物鐘的調(diào)控外，與糖代謝、能量守恒及衰老也有明顯的關(guān)系。有研究報道，Npas2是機(jī)體維持正常節(jié)律所必需的基因，當(dāng)其突變或缺失后，會引起節(jié)律系統(tǒng)的紊亂，同時，Npas2可以和Bmal1形成Npas/Bmal1異二聚體，同靶基因啟動子E-box結(jié)合，調(diào)控Per和Cry基因的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)生物鐘節(jié)律，最近的研究發(fā)現(xiàn)，植入到小鼠體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞VEGF mRNA水平表現(xiàn)出近日節(jié)律性，而這種節(jié)律性與近日表達(dá)的Per2 及Cry1 抑制了VEGF基因啟動子的活性有關(guān)，表現(xiàn)出小鼠血漿中 VEGF 的濃度在白天升高，夜間下降，這為臨床抗血管生成因子的擇時治療提供了參考。原位雜交顯示，hclock基因mRNA和hBmal1基因mRNA均與結(jié)腸腫瘤的發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移有相關(guān)性，免疫組織化學(xué)提示clock蛋白參與了結(jié)腸腫瘤的發(fā)生，并沒有顯示其與結(jié)腸腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)。由此推測hclock基因與hBmal1基因一起構(gòu)成異二聚體，介導(dǎo)及調(diào)控其他鐘基因的轉(zhuǎn)錄過程［13］，除這兩種基因之外的其他鐘基因亦會參與結(jié)腸腫瘤的發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，（1）hBmal1基因蛋白在人癌變結(jié)腸組織和癌旁正常組織中均有以細(xì)胞質(zhì)棕黃色染色為主的陽性表達(dá)，在30例人結(jié)腸癌組織中表達(dá)陽性率為76.67%（23/30），在30例癌旁組織中表達(dá)陽性率為26.67%（8/30），兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；（2）Dukes分期中，hBmal1蛋白在人癌變結(jié)腸組織B期中強(qiáng)陽性表達(dá)率為46.15%（6/13），C期中強(qiáng)陽性表達(dá)率為88.24%（15/17），兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。提示hBmal1基因蛋白與人結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)系，而且hBmal1蛋白可以作為人結(jié)腸癌生物學(xué)行為及預(yù)后的一個評價指標(biāo)，其陽性表達(dá)提示腫瘤惡性程度高、預(yù)后相對較差。

另外，時辰化療被廣泛運(yùn)用于臨床，它是根據(jù)正常組織、腫瘤組織和藥物代謝的生物節(jié)律，選擇腫瘤組織對藥物最敏感和/或?qū)C(jī)體毒性最低的時間給藥，提高化療藥物的療效。歐洲3個國家9個研究中心報道，116例轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌，時間化療和常規(guī)化療各93例，兩組有效率分別為51%與29%，因此目前認(rèn)為，對晚期結(jié)腸癌患者采用近日節(jié)律性用藥方案與傳統(tǒng)以5-FU為主的聯(lián)合化療方案相比，客觀有效率可提高 2～6 倍，中位生存期可提高50%，不良反應(yīng)率降低2～10倍左右。

在針對Bmal1和時辰化療的研究中，Gorbacheva等發(fā)現(xiàn)對晝夜節(jié)律基因Bmal1基因敲除鼠與野生鼠對環(huán)磷酰胺毒性的時辰敏感性進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)兩組之間對環(huán)磷酰胺的化療敏感性有明顯差異，其中Bmal1基因敲除鼠無論何時均對環(huán)磷酰胺敏感［14］。還有研究報道，結(jié)腸癌細(xì)胞中Bmal1過度表達(dá)能夠抑制細(xì)胞的生長，而且，Bmal1表達(dá)變化還影響了紫杉醇的化療敏感性［15］。

目前，EGFR作為大腸癌治療的靶點(diǎn)普遍被看好，已出現(xiàn)了多種針對EGFR的靶向抑制劑，如西妥昔單抗、吉非替尼、埃羅替尼等藥物。厄洛替尼是第一代EGFR酪氨酸激酶抑制劑（TKI），其時辰化療的作用機(jī)制可能與EGFR-AKT-CyclinD-CDK-4通路有關(guān)。晝夜節(jié)律紊亂會導(dǎo)致多種疾病或者機(jī)體生理功能失調(diào)，且與腫瘤的關(guān)系密切。目前的研究主要針對褪黑素，褪黑素作為體現(xiàn)中樞晝夜節(jié)律的主要激素，由于其對于免疫系統(tǒng)的廣泛的調(diào)節(jié)作用，將神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)、精神和軀體、以及免疫系統(tǒng)聯(lián)結(jié)成為一個整體，影響著腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移。既往實(shí)驗(yàn)動物腫瘤模型的研究支持褪黑素抑制腫瘤細(xì)胞增殖，抑制EGFR和MARK通路［16］分化和凋亡的作用。

生物鐘同腫瘤分子生物學(xué)整合而產(chǎn)生的新興交叉學(xué)科必將拓展人類對腫瘤發(fā)生發(fā)展的認(rèn)識，同時也為腫瘤的治療提供了新的思路。下一步的研究是如何利用細(xì)胞生物鐘機(jī)制控制腫瘤的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程，控制腫瘤患者對化療藥物的耐藥性，提高結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移患者的存活率［17-19］。

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Significance and expression of hBmal1 in human colon carcinoma

Lu Li1， Xiong Zhiguo1， XieMin1，Xiong Lina2.
1Department of Gastrointestinal Surgery， Cancer Hospital of Hubei Province， Wuhan 430000，China；2Department of Digestive Disease， Liyuan Hospital， Huazhong University of Science & Technology，Wuhan 430077， China

Xiong Lina， Email: xionglina1978@163.com

Objective The aim of study is to investigate the expression of hBmal1 gene in human colon carcinoma tissue and their relation to invasion and metabasis of colon carcinoma. Methods Immunochemical staining was performed to detect the expression of hBmal1 protein in 30 cases of colon carcinoma tissues and 30 cases of normal tissues from Cancer Hospital of Hubei Province. Results The positive expression rate of hBmal1 in colon carcinoma tissues and in adjacent noncancerous tissues were 76.67% （23/30） vs 26.67% （8/30） （χ2=15.016， P＜0.01）. The strong positive expression rate of hBmal1 in B and C Dukes stage of were 46.15% （6/13） vs 88.24% （15/17） （χ2=6.212，P=0.013）. Conclusions Increased expression of hBmal1 gene contributes to occurrence and development of colon carcinoma.

Colon neoplasms； Gene expression； Rhythm gene； hBmal1 gene

2016-05-21）

（本文編輯：姜爭）

10.3877/cma.j.issn.2095-3224.2016.04.007

湖北省自然科學(xué)基金資助項目（No.2013CFB117）；華中科技大學(xué)青年教師基金資助項目（No.2013QN128）

430000 武漢，湖北省腫瘤醫(yī)院胃腸外科1；華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院消化內(nèi)科2

熊莉娜，Email：xionglina1978@163.com

魯力， 熊治國， 謝敏， 等. 節(jié)律基因hBmal1在人結(jié)腸癌中的表達(dá)及臨床意義［J/CD］. 中華結(jié)直腸疾病電子雜志， 2016，5（4）: 315-318.