PD-L1疫苗中引入不同免疫原性氨基酸對T細(xì)胞亞群分化的影響

陳紅梅，康彥良，劉 利，姚文兵，田 浤

（中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇省生物藥物成藥性研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210009）

免疫原性氨基酸是一類能增強(qiáng)多肽、蛋白免疫原性的非天然氨基酸，如硝基苯丙氨酸、硝基酪氨酸等［1-2］，對自身免疫性疾病的發(fā)病、腫瘤的免疫逃逸等生理病理過程有重要影響。免疫原性氨基酸改變蛋白質(zhì)免疫原性的作用在免疫病理學(xué)、腫瘤免疫學(xué)等領(lǐng)域中受到了廣泛關(guān)注。

含有免疫原性氨基酸的蛋白質(zhì)可以在多種病理?xiàng)l件下自發(fā)形成，如：酪氨酸的硝基化修飾與自身免疫性疾病密切相關(guān)。例如，在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的滑液和系統(tǒng)性紅斑狼瘡或急性肺損傷的患者血清中已鑒定出抗硝基酪氨酸抗體［3-5］。含有酪氨酸硝基化修飾的蛋白質(zhì)具有潛在的免疫原性［6］，高水平的酪氨酸硝基化蛋白會(huì)激活免疫系統(tǒng)，可能在維持自身性免疫疾病中起重要作用。此外，也有研究人員用化學(xué)或生物學(xué)的方法將免疫原性氨基酸引入蛋白質(zhì)或多肽中，以此改變目標(biāo)分子的免疫原性。例如：Hardy 等［7］曾經(jīng)將3-硝基酪氨酸（3-nitrotyrosine，3NO2Tyr）引入到抗原表位肽的特定位置，通過改變MHC I 限制性抗原接觸位置間接影響T細(xì)胞的識(shí)別。課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，將 4- 硝 基 苯 丙 氨 酸（4-nitrophenylalanine，4NO2Phe）定點(diǎn)引入到人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）、細(xì)胞程序性死亡配體1（programmed death ligand 1，PD-L1）等自體蛋白中，不僅能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高滴度抗HER2、抗PD-L1的抗體，還能刺激CD4+T細(xì)胞激活，輔助CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的殺傷作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）和細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞（cytotoxic lymphocyte，CTL）介導(dǎo)的殺傷效應(yīng)，成為有效的腫瘤疫苗候選分子［8-10］。

盡管硝基取代的苯丙氨酸和酪氨酸均是免疫原性氨基酸，但3-硝基酪氨酸在各種病理?xiàng)l件下由一氧化氮合酶催化產(chǎn)生，屬于酪氨酸的衍生物，而4-硝基苯丙氨酸并不能在機(jī)體內(nèi)自發(fā)形成，屬于非天然的外源氨基酸，兩者在機(jī)體內(nèi)誘發(fā)的免疫應(yīng)答可能存在差異，尤其是這兩種免疫原性氨基酸對T細(xì)胞亞群分化的影響，可能對機(jī)體免疫耐受和自身免疫之間的平衡存在重要影響。然而，關(guān)于免疫原性氨基酸對T 細(xì)胞亞群分化影響的研究報(bào)道較少。

為了解決這一問題，本文利用遺傳密碼擴(kuò)充技術(shù)在PD-L1 疫苗的相同位點(diǎn)分別引入了3-硝基酪氨酸和4-硝基苯丙氨酸，比較二者對CD4+T細(xì)胞不同亞群的影響以及CD8+T細(xì)胞的激活情況，從而分析二者的引入對機(jī)體免疫耐受和自身免疫之間的平衡是否存在不同的影響，為后續(xù)基于免疫原性氨基酸的蛋白疫苗的設(shè)計(jì)提供指導(dǎo)。

1 材 料

1.1 試 劑

3-硝基酪氨酸、4-硝基苯丙氨酸（上海吉爾生化有限公司）；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、L-阿拉伯糖（L-Ara）、卡那霉素（Kan）、氯霉素（Cm）（南京鼎國生物技術(shù)有限公司）；BCA 蛋白定量分析試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG、CpG（美國Sigma 公司）；白細(xì)胞激活刺激劑（Leukocyte Activation Cocktail，with BD GolgiPlug?）、流式固定/破膜液（Cytofix/Cytoperm Soln Kit）、流式抗體等（美國BD公司）。

1.2 儀 器

Multiscan 自動(dòng)酶標(biāo)儀、高速冷凍離心機(jī)、恒溫培養(yǎng)箱（美國Thermo 公司）；Countstar 全細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（上海澤權(quán)儀器設(shè)備有限公司）；水平離心機(jī)（湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；Accuri C6 Plus 流式細(xì)胞儀（美國BD公司）。

1.3 動(dòng) 物

清潔級(jí)C57BL/6 雌性小鼠（6～8 周齡）購自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心，合格證號(hào)：SCXK（蘇）2017-0001。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合動(dòng)物倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 菌種和質(zhì)粒

E.coliBL21（AI）為中國藥科大學(xué)江蘇省生物藥物成藥性研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

2 方 法

2.1 WT PD-L1疫苗分子的表達(dá)

將實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的WT PD-L1 疫苗分子的甘油菌pET28-PD-L1 BL21（DE3）接種于20 mL LB培養(yǎng)基小瓶中（Kan），37 ℃，220 r/min 培養(yǎng)過夜，取活化的菌液接種于至200 mL LB（Kan）培養(yǎng)基大瓶中，37 ℃，220 r/min 培養(yǎng)3 h 后，測得A600為0.6～0.8，加入終濃度為1 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)8 h，取誘導(dǎo)前后的菌液進(jìn)行SDS-PAGE 驗(yàn)證蛋白是否表達(dá)，8 000 r/min 離心10 min 收集菌體，保存于-20 ℃。

2.2 3-硝基酪氨酸和4-硝基苯丙氨酸取代的PDL1表達(dá)菌株的構(gòu)建

將編碼PD-L1 疫苗分子的11 位氨基酸密碼子突變?yōu)殓昝艽a子TAG，將突變體基因片段和質(zhì)粒載體pET28a 利用NcoⅠ、Hind Ⅲ進(jìn)行雙酶切，膠回收酶切產(chǎn)物，T4 DNA 連接酶16 ℃過夜連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliDH10B 大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)過夜。次日挑取陽性克隆，接種在含Kan 性的液體LB 培養(yǎng)基中，37 ℃，220 r/min 過夜培養(yǎng)。取菌液測序，測序正確的質(zhì)粒命名命名為pET28a-3NO2Tyr11PD-L1。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的含pAC-3NO2TyrRS 質(zhì)粒的E.coliBL21（AI）感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于Kan/Cm 雙抗的LB 平板，37 ℃倒置培養(yǎng)過夜。挑取陽性克隆并進(jìn)行表達(dá)驗(yàn)證，菌命名為3NO2Tyr11PD-L1-BL21（AI）。4-硝基苯丙氨酸取代的PDL1 質(zhì)粒以及表達(dá)菌株按同樣方法的構(gòu)建，質(zhì)粒命名為pET28a-4NO2Phe11PD-L1，菌命名為4NO2Phe11PD-L1-BL21（AI）。

2.3 3-硝基酪氨酸和4-硝基苯丙氨酸取代的PDL1蛋白的表達(dá)與純化

將保存的3NO2Tyr11PD-L1-BL21（AI）菌種接種于2 mL LB 培養(yǎng)基的試管中（Kan/Cm）振蕩培養(yǎng)過夜。將活化的菌液接種于至200 mL LB（Kan/Cm）培養(yǎng)基大瓶中，37 ℃，220 r/min 培養(yǎng)3 h 后，測得A600為0.6～0.8，加 入 終 濃 度 為0.15% L-Ara、1 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)劑及終濃度0.1 mol/L 的3NO2Tyr，誘導(dǎo)8 h，8 000 r/min 離心10 min 收集菌體，稱重，按1∶10（g/mL）的比例加入包涵體洗滌液，4 ℃攪拌30 min。超聲破碎，離心收集沉淀，加入包涵體洗滌液清洗，去除雜蛋白以及核酸。隨后按1∶10（g/mL）的比例加入含有8 mol/L 脲素的變性液，4 ℃攪拌變性過夜。變性液經(jīng)鎳親和色譜柱純化后將目的蛋白按1∶4 比例進(jìn)行復(fù)性。將復(fù)性液于20 mmol/L Tris-HCL 沖液透析除鹽，超濾濃縮。所獲得的的目的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 檢測和Western blot 鑒定。不含免疫原性氨基酸的野生型PD-L1（WT PD-L1）和4NO2Phe11PD-L1 按同樣方法制備。

2.4 動(dòng)物分組及免疫方案

將6～8 周雌 性C57BL/6 小鼠隨機(jī)分為PBS、WT PD-L1、3NO2Tyr11PD-L1、4NO2Phe11PD-L1 共4組，每組8 只。與CpG 佐劑聯(lián)合使用皮下免疫小鼠，每周免疫1 次，每次每只給藥劑量為50 μg，佐劑10 μg，一共免疫3次，第28天處死小鼠。

2.5 流式細(xì)胞術(shù)測定各組對T 細(xì)胞亞群分化的影響

處死小鼠后，浸泡于75%乙醇中5 min，無菌條件下取出小鼠脾臟，研磨過70 μm 篩網(wǎng)，加入PBS 1 mL 于培養(yǎng)皿中洗殘留細(xì)胞并過篩，1 200 r/min 離心5 min 收集細(xì)胞。用PBS 重懸洗滌細(xì)胞1次，加入裂解液輕柔吹懸準(zhǔn)確控制時(shí)間裂解10～15 min，1 200 r/min離心5 min。收集細(xì)胞用PBS輕柔洗滌1 次，棄上清液，加入適量無菌RPMI 1640培養(yǎng)基（含10%FBS）對細(xì)胞進(jìn)行重懸，計(jì)數(shù)，稀釋為每毫升1×106個(gè)細(xì)胞備用。

細(xì)胞標(biāo)記：Th1（CD4-FITC、IFN-γ-Cy5.5），Th2（CD4-FITC、IL-4-APC），Treg（CD4-FITC、CD3-Cy5.5、Foxp3-PE、CD25-APC），Th17（CD4-FITC、CD3-Cy5.5、IL17-APC），CD8（CD8-FITC、IFN-γ-Cy5.5）。

設(shè)置單染組：空染組（加轉(zhuǎn)錄因子緩沖液）、CD4 組（先加CD4 抗體，后加Cytofix/Cytoperm Soln Kit）、IL-4 組（先加Cytofix/Cytoperm Soln Kit，后加IL-4 抗體）、IFN-γ 組（先加Cytofix/Cytoperm Soln Kit，后加IFN-γ抗體）、CD8組（先加CD8抗體，后加Cytofix/Cytoperm Soln Kit）、CD25（先加CD25 抗體，后加轉(zhuǎn)錄因子緩沖液）、FOXP3（先加轉(zhuǎn)錄因子緩沖液，后加FOXP3 抗體）、IL17（先加Cytofix/Cytoperm Soln Kit，后加IL-17抗體）。

CD8/Th1/Th2/Th17 細(xì)胞染色：取每個(gè)小鼠脾臟細(xì)胞1×106個(gè)鋪板于24 孔板，每孔1 mL，每孔加入Leukocyte Activation Cocktail，with BD GolgiPlug?2 μL 刺激，孵育5 h。 離心收集細(xì)胞收集細(xì)胞于2 mL EP 管中（以下所有溶液提前4 ℃預(yù)冷），離心（4 ℃，1 000 r/min，5 min），加入PBS 1 mL，離心（4 ℃，1 000 r/min，5 min），加入CD4/CD8 抗體，冰上避光孵育30 min，然后加入PBS 1 mL，離心（4 ℃，1 300 r/min，5 min），每孔加入細(xì)胞破膜液250 μL，冰上避光孵育15 min，然后加入工作洗滌液1 mL，離心（4 ℃，1 300 r/min，5 min），棄上清液，再加入工作洗滌液1 mL，離心（4 ℃，1 300 r/min，5 min）。分別加入對應(yīng)的流式抗體，冰上避光孵育30 min。再加入工作洗滌液1 mL，離心（4 ℃，1 300 r/min，5 min）。加入PBS 300 μL 重懸。流式細(xì)胞儀檢測。

Treg 細(xì)胞染色：取每個(gè)小鼠脾臟細(xì)胞1×106個(gè)鋪板于24 孔板，每孔1 mL，每孔加入Leukocyte Activation Cocktail，with BD GolgiPlug?2 μL 刺激，孵育5 h。離心收集細(xì)胞收集細(xì)胞于2 mL EP 管中（以下所有溶液提前4 ℃預(yù)冷），離心（4 ℃，1 000 r/min，5 min），加入PBS 1 mL，離心（4 ℃，1 000 r/min，5 min），加入CD4 和CD25 抗體，冰上避光孵育25 min，然后加入PBS 1 mL，離心（4 ℃，1 300 r/min，5 min），每孔加入轉(zhuǎn)錄因子緩沖液1 mL，冰上避光孵育40 min。然后加入工作洗滌液2 mL，離心（4 ℃，1 300 r/min，5 min），棄上清液，重復(fù)1 次。加入FOXP3 抗體，冰上避光孵育50 min。再加入工作洗滌液2 mL，離心（4 ℃，1 300 r/min，5 min）。加入PBS 300 μL重懸。流式細(xì)胞儀檢測。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 7 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用One-Way ANOVA 進(jìn)行數(shù)據(jù)顯著性比較，P ＜0.05為顯著性差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 3NO2Tyr11PD-L1和4NO2Phe11PD-L1菌株的構(gòu)建

3NO2Tyr11PD-L1 和4NO2Phe11PD-L1 的質(zhì)粒構(gòu)建圖譜如圖1 所示，在PD-L1 相同位點(diǎn)分別引入3NO2Tyr 和4NO2Phe，用 于PD-L1 突 變 體 蛋 白 的表達(dá)。

Figure 1 Plasmid map of 3NO2Tyr11PD-L1（A）and 4NO2Phe11PD-L1（B）

3.2 WT PD-L1、3NO2Tyr11PD-L1 和4NO2Phe11PDL1蛋白的表達(dá)

對WT PD-L1、3NO2Tyr11PD-L1 和4NO2Phe11PD-L1 蛋白進(jìn)行表達(dá)，取誘導(dǎo)前后全菌進(jìn)行SDSPAGE。結(jié)果如下圖2 所示，誘導(dǎo)后菌體在相對分子質(zhì)量27 kD 左右的位置出現(xiàn)條帶，與目的蛋白的相對分子質(zhì)量大小相符。

3.3 WT PD-L1、3NO2Tyr11PD-L1、4NO2Phe11PD-L1蛋白的純化及Western blot鑒定

用鎳親和色譜柱對WT PD-L1、3NO2Tyr11PDL1、4NO2Phe11PD-L1 進(jìn)行純化，目的蛋白經(jīng)過復(fù)性、透析、超濾濃縮之后，進(jìn)行SDS-PAGE 以及Western blot 鑒定。如圖3 所示獲得純度大于90%的WT PD-L1及突變體蛋白，且經(jīng)Western blot驗(yàn)證表明WT PD-L1及突變體正確表達(dá)。

3.4 4NO2Phe11PD-L1 和3NO2Tyr11PD-L1 免疫對小鼠脾臟內(nèi)Th1、Th2細(xì)胞亞群的影響

流式細(xì)胞術(shù)分析4NO2Phe11PD-L1 以及3NO2Tyr11PD-L1 免疫后小鼠脾臟內(nèi)Th1、Th2 細(xì)胞比例變化，結(jié)果如圖4 所示，4NO2Phe11PD-L1 免疫組小鼠脾臟內(nèi)Th1 細(xì)胞比例（2.52 ± 0.04）%顯著高 于PBS 組（1.99 ± 0.08）%，而Th2 細(xì) 胞 比 例（0.26 ± 0.04）%顯 著 低 于PBS 組（P＜0.05）。3NO2Tyr11PD-L1 免疫組小鼠脾臟內(nèi)Th2 細(xì)胞比例為（0.20 ± 0.02）%，顯著低于PBS 組，但3NO2Tyr11PD-L1 免疫對Th1 細(xì)胞的比例無明顯影響（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，4-硝基苯丙氨酸在PD-L1疫苗中的引入能使Th1/Th2細(xì)胞平衡趨向Th1細(xì)胞。

Figure 2 SDS-PAGE analysis of the expression WT PD-L1 and mutated PD-L1A:WT PD-L1;B:3NO2Tyr11PD-L1;C:4NO2Phe11PD-L1. M:Marker,1:Before IPTG induction,2:After IPTG induction

Figure 3 SDS-PAGE analysis and Western blot identification of WT PD-L1 and mutated PD-L1(A)WT PD-L1. M:Marker,1:Purified WT PD-L1;(B)3NO2Tyr11PD-L1. M:Marker,1:Purified 3NO2Tyr11PD-L1;(C)4NO2Phe11PD-L1. M:Marker,1:Purified 4NO2Phe11PD-L1

3.5 4NO2Phe11PD-L1 和3NO2Tyr11PD-L1 免疫小鼠對脾臟內(nèi)Treg細(xì)胞比例的影響

流式細(xì)胞術(shù)分析4NO2Phe11PD-L1 以及3NO2Tyr11PD-L1 免疫后小鼠脾臟內(nèi)Treg 細(xì)胞比例變化，結(jié)果如圖5 所示，與PBS 組（3.78 ± 0.06）%相比，4NO2Phe11PD-L1 組小鼠脾臟內(nèi)Treg 細(xì)胞比例（2.90 ± 0.20）% 顯 著 降 低（P＜0.01），而3NO2Tyr11PD-L1 組Treg 細(xì)胞比例（5.34 ± 0.44）%與PBS組相比則明顯提高（P＜0.05）。

3.6 4NO2Phe11PD-L1以及3NO2Tyr11PD-L1免疫小鼠后脾臟內(nèi)Th17細(xì)胞比例

通過流式細(xì)胞術(shù)測定脾臟內(nèi)Th17 細(xì)胞的比例，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，如圖6 所示，與其他各組相比，3NO2Tyr11PD-L1 免疫小鼠后，脾臟內(nèi)Th17 細(xì)胞的比例顯著增高，4NO2Phe11PD-L1免疫后對小鼠脾臟內(nèi)Th17 細(xì)胞比例沒有明顯影響。隨后分析了Th17/Treg 細(xì)胞的比例，發(fā)現(xiàn)3NO2Tyr11PD-L1 組與4NO2Phe11PD-L1 組 無 顯 著 性 差 異［（0.33 ±0.06）%vs（0.28 ± 0.03）%］，上述結(jié)果提示，3-硝基酪氨酸可能在體內(nèi)作為一種炎癥信號(hào)發(fā)揮作用，對Th17細(xì)胞亞群影響較大，而4-硝基苯丙氨酸對Treg 細(xì)胞亞群作用更明顯，提示機(jī)體可能把含4-硝基苯丙氨酸的蛋白質(zhì)作為外源蛋白處理。

3.7 4NO2Phe11PD-L1 和3NO2Tyr11PD-L1 免疫小鼠對脾臟內(nèi)CD8+T細(xì)胞的影響

Figure 4 Immunization of 4NO2Phe11PD-L1 and 3NO2Tyr11PD-L1 induces polarization of na?ve CD4+T cells to Th1 cells(±s,n=8)A:Frequency of Th1 cells;B:Frequency of Th2 cells;C:Rations of Th1/Th2 cells*P＜0.05, **P ＜0.01;ns:not significant

Figure 5 Effect of 4NO2Phe11PD-L1 and 3NO2Tyr11PD-L1 immunization on the frequency of Treg cells(±s,n=8)*P＜0.05, **P ＜0.01

通過流式細(xì)胞術(shù)分析4NO2Phe11PD-L1 和3NO2Tyr11PD-L1 免疫后小鼠脾臟內(nèi)CD8+T 細(xì)胞的激活情況，結(jié)果如圖7 所示，與PBS 組相比，3NO2Tyr11PD-L1 以及4NO2Phe11PD-L1 免疫后小鼠脾臟中的CD8+IFNγ+T 細(xì)胞比例均顯著增加，但是3NO2Tyr11PDL 組CD8+IFNγ+T 細(xì)胞比例［（4.50 ±0.43）%］顯著低于4NO2Phe11PD-L1 組［（6.97 ±0.78）%］。這可能是由于兩者對CD4+T 細(xì)胞亞群的作用差異造成的。

Figure 6 Effect of 4NO2Phe11PD-L1 and 3NO2Tyr11PD-L1 immunization on the frequency of Th17 cells(±s,n=8)**P ＜0.01;ns:not significant

Figure 7 Effect of 4NO2Phe11PD-L1 and 3NO2Tyr11PD-L1 immunization on the frequency of CD8+T cells(±s,n=8)*P＜0.05, **P ＜0.01, ****P ＜0.000 1

4 討 論

本研究利用遺傳密碼擴(kuò)充技術(shù)，將兩種免疫原性氨基酸4-硝基苯丙氨酸和3-硝基酪氨酸分別引入到PD-L1疫苗的相同位點(diǎn)，獲得具有3-硝基酪氨酸以及4-硝基苯丙氨酸的兩種PD-L1 突變體。遺傳密碼擴(kuò)充技術(shù)中，非天然氨基酸由琥珀終止密碼子TAG 編碼，蛋白表達(dá)過程中，攜帶非天然氨基酸的tRNA 會(huì)和TAG 釋放因子競爭結(jié)合TAG，因此，相較于原型蛋白，突變目的蛋白的產(chǎn)量較低，造成了后續(xù)純化困難，其表達(dá)和純化效率有待進(jìn)一步提高。

研究發(fā)現(xiàn)4-硝基苯丙氨酸在PD-L1 疫苗中的引入，能夠顯著提高脾臟內(nèi)Th1 細(xì)胞比例，同時(shí)Th2 細(xì)胞比例顯著降低，促進(jìn)Th1 細(xì)胞的極化。3-硝基酪氨酸在PD-L1 疫苗中的引入對Th1/Th2 比例無影響。有研究顯示，腫瘤患者具有較低的Th1/Th2 比值，而相較于趨向于Th2 細(xì)胞反應(yīng)的患者，趨向于Th1反應(yīng)的患者主要表現(xiàn)出較高的生存率和較低的腫瘤復(fù)發(fā)率。因此，Th1/Th2 平衡向Th1細(xì)胞反應(yīng)的轉(zhuǎn)變有助于腫瘤的有效治療［11］。

隨后本研究分析了二者在PD-L1 疫苗中的引入對Treg 細(xì)胞比例的影響，4-硝基苯丙氨酸的在PD-L1疫苗中的引入顯著降低Treg細(xì)胞的比例，而3-硝基酪氨酸的引入顯著提高Treg 細(xì)胞比例。Treg 細(xì)胞是腫瘤免疫微環(huán)境中有效的免疫抑制細(xì)胞，特異性表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子FOXP3，可通過分泌細(xì)胞因子（IL-10/TGF-β）或者細(xì)胞間的直接接觸來抑制CD8+T 細(xì)胞使機(jī)體產(chǎn)生免疫耐受，維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)［12］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，機(jī)體可能把4-硝基苯丙氨酸的蛋白質(zhì)作為外源蛋白處理，因此可能打破免疫耐受的能力更強(qiáng)。

值得關(guān)注的是，3-硝基酪氨酸的引入與4-硝基苯丙氨酸相比，能顯著提高Th17 細(xì)胞的比例，而很早有文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)在患有不同炎癥相關(guān)疾病（例如急性肺損傷、心血管疾病和系統(tǒng)性紅斑狼瘡）的患者血漿中［13-15］，均可分離出識(shí)別3-硝基酪氨酸的免疫球蛋白，并且由于這些蛋白持續(xù)產(chǎn)生會(huì)激活免疫系統(tǒng)，因此可能在維持自身性免疫疾病中起作用。而Th17 細(xì)胞能夠通過分泌炎癥介質(zhì)IL-17誘導(dǎo)嚴(yán)重的自身免疫反應(yīng)［16-17］，上述結(jié)果提示，3-硝基酪氨酸可能在機(jī)體內(nèi)作為一種炎癥信號(hào)發(fā)揮作用。

本研究還分析了二者在PD-L1 疫苗中的引入對CD8+T 細(xì)胞的影響，它們均能有效地促進(jìn)CD8+T 細(xì)胞的激活，但4-硝基苯丙氨酸在PD-L1 疫苗中的引入對CD8+T細(xì)胞的激活作用更強(qiáng)，這一結(jié)果與4-硝基苯丙氨酸的引入能顯著提高Th1 細(xì)胞的比例相一致，提示4-硝基苯丙氨酸更適用于抗腫瘤疫苗的開發(fā)。