巨噬細(xì)胞移動抑制因子缺失加重苯腎上腺素誘導(dǎo)的小鼠心肌肥厚

肖珍，朱杰寧，唐春梅，林秋雄，胡志琴，張灼，符永恒，張夢珍，單志新

（廣東省人民醫(yī)院廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院廣東省心血管病研究所醫(yī)學(xué)研究部，廣州510080）

巨噬細(xì)胞移動抑制因子缺失加重苯腎上腺素誘導(dǎo)的小鼠心肌肥厚

肖珍，朱杰寧，唐春梅，林秋雄，胡志琴，張灼，符永恒，張夢珍，單志新

（廣東省人民醫(yī)院廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院廣東省心血管病研究所醫(yī)學(xué)研究部，廣州510080）

研究巨噬細(xì)胞移動抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF）缺失對皮下注射苯腎上腺素（phenylephrine，PE）誘導(dǎo)的小鼠心肌肥厚的影響.利用MIF敲除（MIF-knockout，MIF-KO）小鼠及其野生型對照小鼠，分別建立皮下注射PE誘導(dǎo)的小鼠心肌肥厚模型.小動物心臟B超檢測到小鼠心臟結(jié)構(gòu)功能的改變.末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺節(jié)末端標(biāo)記（terminal deoxynucleotidyl transferase（TdT）-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）法檢測到小鼠心肌細(xì)胞凋亡.分別用實時定量逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)（quantitative reverse-transcription-polymerase chain reaction，qRT-PCR）和Western Blot方法檢測SOD1，SOD2和Trx2的表達(dá).①連續(xù)3d 20 mg/（kg·d）皮下注射PE可誘導(dǎo)小鼠發(fā)生心肌肥厚，注射PE誘導(dǎo)MIF-KO小鼠發(fā)生心肌肥厚的程度高于野生型對照小鼠；②TUNEL結(jié)果顯示，注射PE誘導(dǎo)MIF-KO小鼠心肌發(fā)生凋亡的程度高于野生型對照小鼠；③注射PE誘導(dǎo)MIF-KO小鼠心肌中SOD1和Trx2表達(dá)水平降低，而且MIF-KO小鼠心肌中Trx2表達(dá)水平顯著低于野生型對照小鼠.MIF缺失會降低SOD1和Trx2的表達(dá)水平，進(jìn)而加重苯腎上腺素誘導(dǎo)的小鼠心肌細(xì)胞凋亡和心肌肥厚.

巨噬細(xì)胞移動抑制因子；苯腎上腺素；心肌細(xì)胞；心肌肥厚

心肌肥厚是心血管疾病中最為常見的并發(fā)癥之一，長期的心肌肥厚很容易導(dǎo)致心力衰竭或猝死.長期壓力和（或）容積負(fù)荷過度、機械性刺激和神經(jīng)體液因素均可通過調(diào)節(jié)肥厚相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)心肌細(xì)胞的肥大.心肌肥厚的分子機制非常復(fù)雜，發(fā)生心肌肥厚時多條信號通路介導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大過程，而且多條通路之間相互作用，形成錯綜復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò).盡管研究人員姜展心肌肥厚的相關(guān)研究已有幾十年，但對于心肌肥大發(fā)生和維持的確切機制仍不清楚.

巨噬細(xì)胞移動抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF）是一種細(xì)胞因子，具有抗氧化作用，在T淋巴細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、肝細(xì)胞和心肌細(xì)胞等多種組織細(xì)胞中均有表達(dá)；并參與多種有炎癥反應(yīng)的疾病過程，包括系統(tǒng)性感染、自身免疫性疾病、癌癥、代謝性疾病如糖尿病和肥胖等［1］.近期研究發(fā)現(xiàn)，MIF參與了心肌肥厚過程［2-3］，但是具體作用機制尚不明確.本研究旨在探討MIF缺失對皮下注射苯腎上腺素（phenylephrine，PE）誘導(dǎo)的小鼠心肌肥厚的影響.

1　材料和方法

1.1實驗試劑與儀器

Trizol試劑盒（Invitrogen，Carlsbad，CA），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Invitrogen，Carlsbad，CA），2×SYBR Green Mix（TaKaRa，Japan），RNAase free water（TaKaRa，Japan），BCA蛋白定量試劑盒（Thermo，USA），SDS-PAGE凝膠配置試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所，中國），TUNEL檢測試劑盒（Roche，USA）.抗體：GAPDH，anti-Rabbit，anti-Mouse（Protein Technology，UK），心鈉素（atrial natriuretic peptide，ANP，Abcam，UK），β肌球蛋白重鏈（β-myosin heavy chain，β-MHC，Sigma，USA），SOD1，SOD2，Trx2（Proteintech，USA）.蛋白Marker（Fermentas，USA），4×SDS loading buffer（Invitrogen，Carlsbad，CA），PVDF膜（Whatman，UK），ECL發(fā)光液（Bioword，USA），DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基（Hyclone，USA），特級澳洲胎牛血清（Gibco，USA），苯腎上腺素（Sigma，USA），胰蛋白酶粉末（廣州威佳科技有限公司，中國）.其他生化試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純.

蛋白電泳、電轉(zhuǎn)系統(tǒng)（BioRad，USA），超高分辨率VEVO2100小動物彩色B超儀MPX（二維M型，Visual Sonics，Canada），熒光定量PCR儀（MJ Research Opticon2，ViiA 7 Life Technologies，USA），倒置熒光顯微鏡（Olympus，Japan）.

1.2實驗方法

1.2.1皮下注射PE誘導(dǎo)小鼠心肌肥厚模型

參照文獻(xiàn)［4］，選用8～12周齡MIF敲除和正常對照雄性小鼠（美國Jakson實驗室），體重20～25 g.將PE以20 mg/（kg·d）皮下注射3 d，繼續(xù)飼養(yǎng)5 d，通過小動物心臟B超檢測心臟結(jié)構(gòu)，判定是否造模成功.對照組注射同量的生理鹽水.

1.2.2小動物心臟B超檢測小鼠心臟結(jié)構(gòu)功能

小鼠在麻醉（異氟烷和氧氣混合氣麻醉）狀態(tài)下，利用超高分辨率VEVO2100小動物彩色B超儀（二維M型）的13-MHz傳感器進(jìn)行超聲心動圖檢查.檢測指標(biāo)包括左室前壁舒張末期厚度（left ventricular anterior wall end-diastolic，LVAWd）、左室前壁收縮末期厚度（left ventricular anterior wall end-systolic，LVAWs）、左室后壁舒張末期厚度（left ventricular posterior wall end-diastolic，LVPWd）、左室后壁收縮末期厚度（left ventricular posterior wall end-systolic，LVPWs）、左室射血分?jǐn)?shù)（ejection fraction，EF）、左室短軸縮短率（fraction shortening，F(xiàn)S）.

1.2.3末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺節(jié)末端標(biāo)記（terminal deoxynucleotidyl transferase（TdT）-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）檢測

TUNEL檢測方法簡述如下：將小鼠心肌組織固定在10%福爾馬林中隔夜.石蠟包埋樣品，切出4μm厚度的貼片.心肌組織切片進(jìn)行20μg/mL蛋白酶K處理.用Cy5-dUTP標(biāo)記發(fā)生凋亡細(xì)胞中損傷的DNA鏈.利用熒光顯微鏡檢測5個不同視野（每個視野大約有200個細(xì)胞）中TUNEL陽性細(xì)胞的數(shù)量.

1.2.4實時定量逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)（quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測基因表達(dá)

用Trizol試劑盒提取心肌細(xì)胞總RNA.取2.0μg總RNA，加入5×逆轉(zhuǎn)錄試劑4μL（逆轉(zhuǎn)錄試劑盒），用oligo（dT）15和random primers逆轉(zhuǎn)錄出cDNA，用于檢測目標(biāo)基因mRNA表達(dá)水平.以磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為內(nèi)參照基因，利用合成的cDNA模板和特異的PCR引物檢測目標(biāo)基因mRNA的表達(dá)水平.擴增的DNA產(chǎn)物以熒光染料SYBR GreenⅠ標(biāo)記，PCR反應(yīng)在ViiA 7儀器上運行.以2-ΔΔCt法計算目標(biāo)基因的相對表達(dá)水平.本研究所用PCR引物序列如表1所示.

1.2.5Western Blot檢測蛋白表達(dá)

收集處理后的心肌細(xì)胞，加入RIPA蛋白裂解液，冰上裂解，于4°C 12 000 r/min離心10 min，取上清進(jìn)行蛋白定量后分裝，加入4×SDS loading buffer，于100°C加熱10 min使蛋白變性，然后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳.用聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，分別用相應(yīng)的抗體anti-ANP（1∶5 000），anti-β-MHC（1∶1 000），anti-SOD1（1∶5 000），anti-SOD2（1∶1 000），anti-Trx2（1∶1 000）4°C孵育過夜.TBST洗膜后，加入二抗（1∶5 000）4°C孵育2 h.用ECL發(fā)光試劑盒顯影，以GAPDH（1∶5 000）為內(nèi)參照，掃描灰度值并分析蛋白表達(dá)相對含量.

表1　qRT-PCR引物序列Table 1 Sequences of the primers for qRT-PCR

1.2.6統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析.數(shù)據(jù)均采用“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，組間比較采用單因素方差分析（one way ANOVA），兩兩比較獨立樣本t檢驗分析方法.P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性.

2　實驗結(jié)果

2.1MIF缺失加重皮下注射PE誘導(dǎo)的小鼠心肌肥厚

小動物心臟B超結(jié)果顯示，皮下注射PE可誘發(fā)小鼠發(fā)生明顯的心肌肥厚.與對照組相比，PE注射模型組心臟LVAWd，LVAWs，LVPWd，EF顯著增加，而FS顯著降低.與野生型小鼠相比，PE注射后MIF-KO小鼠心臟LVAWd和EF增加，F(xiàn)S降低更明顯（見表2）.小鼠心臟重量與體重比值結(jié)果也顯示，PE注射可誘發(fā)小鼠發(fā)生明顯的心肌肥厚，而MIF-KO小鼠心臟的肥大程度顯著高于野生型小鼠（見圖1）.圖1中HW（heart weight）為心臟重量，BW（body weight）為體重，相對于WT-saline，?為P＜0.05，??為P＜0.01，n=5～8.同樣，Western Blot檢測結(jié)果也證實，心肌肥大基因ANP，β-MHC表達(dá)水平在PE誘發(fā)心肌肥厚的小鼠心肌中顯著升高，而MIF-KO小鼠心肌中ANP，β-MHC表達(dá)水平明顯高于野生型小鼠（見圖2）.圖2中，相對于WT-saline，?為P＜0.05，??為P＜0.01，n=5～8.

表2　利用超聲心動圖檢測心臟功能Table 2 Assessment of the cardiac function by echocardiography

2.2MIF缺失加劇皮下注射PE誘導(dǎo)的小鼠心肌細(xì)胞凋亡

本研究利用TUNEL法檢測小鼠的心肌細(xì)胞凋亡水平.TUNEL染色結(jié)果顯示，皮下注射PE誘發(fā)心肌肥厚的小鼠心肌細(xì)胞凋亡水平明顯升高；與野生型小鼠相比，PE注射后MIFKO小鼠心肌細(xì)胞凋亡率顯著增加（見圖3）.圖3中，相對于MIF-KO-saline，#為P＜0.01，##為P＜0.001，n=3～5.

圖1　皮下注射PE誘發(fā)的小鼠心肌肥厚Fig.1 Heart morphology of mice received hypodermic injection of PE

圖2　皮下注射PE后小鼠心肌中ANP，β-MHC蛋白表達(dá)水平Fig.2 Protein expression of ANP and β-MHC in myocardium of mice received hypodermic injection of PE

圖3　TUNEL法檢測皮下注射PE后小鼠心肌細(xì)胞凋亡水平Fig.3 Apoptosis of myocytes in myocardium of mice received hypodermic injection of PE by TUNEL assay

2.3MIF缺失降低小鼠心肌細(xì)胞中SOD1，Trx2表達(dá)水平

分別利用qRT-PCR和Western Blot法檢測小鼠心肌中SOD1，SOD2和Trx2表達(dá)水平.qRT-PCR結(jié)果顯示，與注射生理鹽水對照組相比，PE注射后MIF-KO小鼠心肌中SOD1和Trx2表達(dá)水平明顯降低（見圖4）.Western Blot結(jié)果亦確認(rèn)PE注射后MIF-KO小鼠心肌中SOD1和Trx2表達(dá)水平明顯降低.同時發(fā)現(xiàn)，PE注射后MIF野生型小鼠心肌中Trx2表達(dá)水平明顯降低，而MIF-KO小鼠心肌中Trx2表達(dá)水平明顯低于野生型小鼠（見圖4）.圖4中，相對于WT-saline?為P＜0.05，??為P＜0.01，n=5～8.

圖4　皮下注射PE后小鼠心肌中SOD1，SOD2和Trx2的表達(dá)水平Fig.4 Expression of SOD1，SOD2 and Trx2 in the mouse myocardium after hypodermic injection of PE

3　討論

MIF是一種由垂體和多種細(xì)胞分泌的多效蛋白分子，具有細(xì)胞因子、神經(jīng)內(nèi)分泌激素和酶等生物活性.MIF具有氧化還原酶活性，它包含一個巰基蛋白基序（cys57-x-x-cys60），具有類似過氧化物酶家族的氧化還原催化劑作用［5-6］.已有研究發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注后心肌中MIF分子Cys81的S-亞硝基化修飾增加，進(jìn)而提高了MIF的抗氧化能力，降低了心肌細(xì)胞凋亡水平和心肌梗死面積［7］.同時，MIF分子Cys81的S-亞硝基化修飾也有助于降低MIF與Jab1/CSN5的結(jié)合，從而保證心肌再灌注中MIF能夠發(fā)揮生物學(xué)作用［8］.也有研究發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注中MIF可能通過維持較高的GSH/GSSG水平，降低蛋白氧化和線粒體損傷，從而減少心肌梗死面積并增強心肌收縮功能［9］.除了內(nèi)源性MIF的抗氧化活性，分泌到細(xì)胞外的MIF通過其CD74/CD44受體激活A(yù)MPK，Akt和ERK1/2信號通路，提高細(xì)胞存活率［10-11］.

本研究利用皮下注射PE的方式誘導(dǎo)小鼠發(fā)生心肌肥厚.PE是α1腎上腺素能受體（α1-adrenoceptor，α1-AR）激動劑，可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大［12］.本研究證實皮下注射PE可誘發(fā)明顯的小鼠心肌肥厚，使心肌肥厚標(biāo)志蛋白ANP和β-MHC表達(dá)水平升高，同時伴有細(xì)胞凋亡水平升高和心臟功能降低.與野生型小鼠相比，MIF-KO小鼠發(fā)生心肌肥厚、心臟功能降低和心肌細(xì)胞凋亡的程度均顯著增加.上述研究結(jié)果表明，MIF缺失會加重PE誘導(dǎo)的心肌肥厚和心臟功能降低，提示MIF對心肌肥厚的發(fā)生有抑制作用.與本研究結(jié)果一致，已有研究顯示利用MIF敲除小鼠建立的腹主動脈縮窄（abdominal aortic constriction，AAC）模型的心肌肥厚程度增加［2］.同樣地，通過建立小鼠橫向主動脈弓縮窄（transverse aortic constriction，TAC）模型發(fā)現(xiàn)，MIF敲除小鼠的心肌肥厚程度和心肌纖維化程度顯著增加［3］.

氧化應(yīng)激被認(rèn)為是心肌肥厚發(fā)生的重要促發(fā)因素［13-14］.本研究中，連續(xù)過量注射PE會對小鼠心臟造成毒害作用，引起較強的氧化應(yīng)激反應(yīng)和心肌細(xì)胞凋亡.與野生型小鼠相比，注射PE后MIF-KO小鼠心肌細(xì)胞凋亡的比例明顯增加，更易引發(fā)代償性的病理性心肌肥厚，這可能是導(dǎo)致MIF-KO小鼠心肌肥厚程度更顯著的直接原因.檢測抗氧化相關(guān)基因SOD1，SOD2和Trx2表達(dá)水平后發(fā)現(xiàn)，注射PE后MIF-KO小鼠心肌中SOD1和Trx2表達(dá)水平明顯降低，尤其是MIF-KO小鼠比野生型小鼠心肌中Trx2表達(dá)水平降低更明顯.因此，MIF缺失的小鼠心肌細(xì)胞中SOD1和Trx2表達(dá)水平降低可能促進(jìn)了PE誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和心肌肥厚.與本研究結(jié)果相類似，已有研究發(fā)現(xiàn)，與野生型小鼠相比，在TAC誘發(fā)心肌肥厚的MIF-KO小鼠心肌中與ROS生成相關(guān)的NOX4顯著上調(diào)，而清除ROS相關(guān)的SOD2和UCP3水平顯著降低［3］.

因此，本研究發(fā)現(xiàn)注射PE后MIF-KO小鼠比野生型小鼠發(fā)生心肌細(xì)胞調(diào)亡和心肌肥厚的程度顯著增加，其可能的原因是MIF-KO小鼠心肌中發(fā)揮抗氧化作用的SOD1和Trx2表達(dá)水平顯著降低所致.在后續(xù)研究中將進(jìn)一步探討MIF缺失降低抗氧化相關(guān)基因表達(dá)的分子機制.

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Macrophage migration inhibitory factor deficiency aggravates cardiac hypertrophy induced by phenylephrine in mice

XIAO Zhen，ZHU Jiening，TANG Chunmei，LIN Qiuxiong，HU Zhiqin，ZHANG Zhuo，F(xiàn)U Yongheng，ZHANG Mengzhen，SHAN Zhixin
（Research Department of Medical Science，Guangdong Cardiovascular Institute，Guangdong Academy of Medical Sciences，Guangdong General Hospital，Guangzhou 510080，China）

To investigate the effect of macrophage migration inhibitory factor（MIF）deficiency on the cardiac hypertrophy induced by hypodermic injection of phenylephrine（PE）in mice.A mouse model of cardiac hypertrophy induced by hypodermic injection of PE was established based on MIF-knockout（MIF-KO）mouse and the wide type control（WT）mouse.The left ventricular（LV）structure and function variables were assessed by transthoracic echocardiography.Terminal deoxynucleotidyl transferase（TdT）-mediated dUTP nick end labeling（TUNEL）assay was performed to detect cardiomyocyte apoptosis.Expressions of SOD1，SOD2 and Trx2 were determined by real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction（qRT-PCR）and Western Blot assay，respectively.①A mouse model of cardiac hypertrophy was achieved，induced by hypodermic injection of 20 mg/（kg·d）PE for 3 d.Compared with WT mice，PE injection induced more severe cardiac hypertrophy in MIF-KO mice.②TUNEL assay revealed that the level of PE injection-induced cardiomyocte apoptosis in the myocardium of MIF-KO mouse was higher than that in WT mice.③Expressions of SOD1 and Trx2 were significantly decreased in the myocardium of MIF-KO mice after PE injection，and reduction of Trx2 protein in myocardium of MIF-KO mice was more than that in WT mouse.MIF deficiency attenuates the expressions of SOD1 and Trx2，contributing to the aggravation of cardiomyocyte apoptosis and cardiac hypertrophy induced by hypodermic injection of PE in mice.

macrophage migration inhibitory factor（MIF）；phenylephrine；cardiomyocyte；cardiac hypertrophy

R 329.21

A

1007-2861（2016）03-0336-08

10.3969/j.issn.1007-2861.2016.03.011

2016-04-19

國家自然科學(xué)基金資助項目（81270222，81470439）；廣東省自然科學(xué)基金資助項目（2014A030313635）；廣東省醫(yī)學(xué)研究基金資助項目（A2015187）

單志新（1972—），男，研究員，博士生導(dǎo)師，博士，研究方向為心肌重構(gòu)和心肌保護(hù).

E-mail：zhixinshan@aliyun.com