蚯蚓小分子多肽提取物的制備及抗氧化活性

劉廷強(qiáng)　嚴(yán)澤民　周華峰

摘要：研究了自溶酶解制備蚯蚓小分子多肽提取物的工藝，并對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行了初步研究。通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)法，以肽的得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定了最佳制備工藝：反應(yīng)時(shí)間1 h，料液比1.0 g ∶ 1.5 mL，溫度35 ℃，pH值676。在此工藝條件下，1.7 kg鮮蚯蚓制自溶酶解，酶解液經(jīng)分子膜截留并冷凍干燥，共得到了103.39 g蚯蚓小分子多肽提取物。該產(chǎn)品為微黃色粉末，略帶獨(dú)特香味，主要為相對(duì)分子質(zhì)量3 000以下的小分子多肽和氨基酸。在濃度為10、30 mg/mL時(shí)，蚯蚓小分子多肽提取物對(duì)DPPH自由基和超氧陰離子自由基的清除率分別為91.1%、53.0%。

關(guān)鍵詞：蚯蚓；自溶酶解；小分子多肽；抗氧化

中圖分類號(hào)： TS201.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2016）07-0463-04

蚯蚓為環(huán)節(jié)動(dòng)物門（Annelida）寡毛綱（Oligochaeta）動(dòng)物，可改良土壤，促進(jìn)農(nóng)業(yè)增產(chǎn)，在物質(zhì)循環(huán)、生物多樣性、保護(hù)生態(tài)環(huán)境等方面發(fā)揮著特殊作用。此外，蚯蚓還是我國(guó)常用中藥，名為地龍。研究發(fā)現(xiàn)，蚯蚓具有治療心血管疾病[1-2]、癌癥[3]、哮喘[4-5]等多種藥理作用，同時(shí)還具有增強(qiáng)免疫力[6-7]、促進(jìn)傷口愈合[8]等作用。蚯蚓中含有豐富的人體所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[9-10]，包括蛋白質(zhì)、核酸、微量元素、維生素等，其中蛋白質(zhì)總量約占干質(zhì)量的45.90%～68.11%。蚯蚓經(jīng)酶水解可獲得小分子多肽和氨基酸，不僅可以提供均衡的、易于吸收的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而且蚯蚓肽還具有抗氧化[11]、增強(qiáng)免疫[12]、抗菌[13]等生理活性，在保健食品領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用前景。蚯蚓自身含有豐富的蛋白酶，在一定條件下容易發(fā)生自溶酶解。目前，通過(guò)外源蛋白酶或自身酶水解制備蚯蚓酶解物研究已有相關(guān)報(bào)道[14-17]，但制備工藝主要以生成氨基酸為主。本研究以肽的得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，結(jié)合單因素法和正交試驗(yàn)法，對(duì)蚯蚓自溶酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化，采用分子膜截留技術(shù)，去除蚯蚓自身腥味，制備略帶香味的蚯蚓小分子多肽提取物，并考察其抗氧化活性，旨在為開發(fā)高附加值的蚯蚓保健食品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

赤子愛(ài)勝蚓（Eisenia foelide，天津賈立明蚯蚓養(yǎng)殖有限公司）；溶菌酶（14 000 Da，華美生物工程公司）；胰島素（5 733 Da，徐州萬(wàn)邦金橋制藥有限公司）；桿菌肽（1 422 Da，Sigma公司）；谷胱甘肽還原型（307 Da，Sigma公司）、DPPH（Sigma公司）；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭OSOH TSK-Gel-2000 SWXL色譜柱（300 mm×7.8 mm）；Agilent 1200系列高效液相色譜儀；TU1900紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；L-8900氨基酸分析儀（日本日立公司）。

1.2 方法

1.2.1 自溶酶解處理方法 將鮮蚯蚓洗凈，置于純凈水中讓其盡量吐出體內(nèi)的食物殘?jiān)?。用高速搗碎機(jī)將洗凈的鮮蚯蚓搗碎，蚯蚓搗碎液即為鮮蚯蚓原液。在蚯蚓原液中加入一定體積的去離子水，混勻，在一定條件下進(jìn)行自溶酶解反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，于沸水浴酶滅活5 min，經(jīng)12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心 10 min，上清液即為自溶酶解液。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2 肽得率測(cè)定方法 采用雙縮脲試劑法[18]，檢測(cè)蚯蚓自溶酶解液中肽的濃度。自溶酶解液加入等體積的10% TCA溶液，靜置30 min，離心，取1 mL上清液，補(bǔ)水至2 mL，在540 nm處測(cè)定D值。以桿菌肽為對(duì)照，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程y=0.061 49x+0.004 22 （r2=0.996 58），計(jì)算肽濃度。肽得率計(jì)算公式如下：

肽得率=肽的濃度×酶解液體積/樣品濕質(zhì)量×100%。

1.2.3 蚯蚓自溶酶解工藝的優(yōu)化

1.2.3.1 pH值對(duì)自溶酶解條件的影響 取 1 g蚯蚓搗碎液，加入1 mL去離子水，混勻，經(jīng)測(cè)定混合液pH值為6.76。分別在pH值為6.0、6.5、6.76、7.0、7.5、8.0條件下進(jìn)行自溶酶解，于最佳反應(yīng)溫度條件下反應(yīng)4 h。分別檢測(cè)自溶酶解液中肽的濃度，計(jì)算肽得率。

1.2.3.2 溫度對(duì)自溶酶解條件的影響 取1 g蚯蚓搗碎液，加入1 mL去離子水，混勻，分別于30、35、40、45、50、55、60 ℃下反應(yīng)4 h。分別檢測(cè)自溶酶解液中肽濃度，計(jì)算肽得率。

1.2.3.3 料液比對(duì)自溶酶解條件的影響 取 1 g蚯蚓搗碎液，分別加入不同體積的去離子水，混勻，配制成1.0 g ∶ 1.0 mL、1.0 g ∶ 1.5 mL、1.0 g ∶ 2.0 mL、1.0 g ∶ 2.5 mL、1.0 g ∶ 3.0 mL料液比的蚯蚓混合液，于最佳pH值和溫度條件下反應(yīng)4 h。分別檢測(cè)自溶酶解液中肽的濃度，計(jì)算肽的得率。

1.2.3.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)自溶酶解條件的影響 于最佳pH值、溫度和料液比條件下，分別自溶酶解1、2、3、4、5、6、7 h。反應(yīng)結(jié)束后，分別檢測(cè)自溶酶解液中肽的濃度，計(jì)算肽的得率。

1.2.3.5 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，按照表1所示的4因素3水平設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。

1.2.4 HPLC檢測(cè)肽的分子量分布情況 采用HPLC對(duì)蚯蚓自溶酶解物中肽的分子量分布情況進(jìn)行分析。檢測(cè)條件：乙腈 ∶ 水 ∶ 三氟乙酸=20 ∶ 80 ∶ 0.1；流速：0.5 mL/min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm。采用溶菌酶、胰島素、桿菌肽、谷胱甘肽還原型為對(duì)照，以相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)對(duì)保留時(shí)間作線性回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=8.342-028x（r2=0.988 25）。

1.2.5 蚯蚓小分子多肽提取物的制備 在自溶酶解最優(yōu)工藝條件下，對(duì)1.7 kg鮮蚯蚓進(jìn)行自溶酶解。酶解原液首先經(jīng)相對(duì)分子質(zhì)量為3 000的超濾膜進(jìn)行超濾，濾液再經(jīng)相對(duì)分子質(zhì)量為300的納濾膜進(jìn)行截留，截留液冷凍干燥，即為蚯蚓小分子多肽提取物。采用HPLC檢測(cè)肽的分子量分布情況。

1.2.6 蚯蚓小分子多肽提取物總氮含量及游離氨基酸含量的檢測(cè) 參照GB 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》規(guī)定的方法，采用凱氏定氮法，對(duì)蚯蚓小分子多肽提取物總氮含量進(jìn)行分析。參照GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的測(cè)定》規(guī)定的方法，用3%磺基水酸溶液溶解樣品并定容，樣品溶液搖勻后過(guò)濾、離心，采用日立L-8900氨基酸分析儀測(cè)定上清液，對(duì)蚯蚓小分子多肽提取物中16種游離氨基酸進(jìn)行分析。

1.2.7 蚯蚓小分子多肽提取物的體外抗氧化活性檢測(cè) 參照前人研究方法[19]，分別以α-熊果苷和維生素C為陽(yáng)性對(duì)照，檢測(cè)蚯蚓小分子多肽提取物對(duì)DPPH自由基和超氧陰離子的清除作用，考察其體外抗氧化活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH值對(duì)蚯蚓自溶酶解的作用

以肽的得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察pH值對(duì)自溶酶解的作用。由圖1可知，當(dāng)pH值低于7.0（即6.0、6.5、6.76）時(shí)，肽的得率差別不大。當(dāng)pH值大于6.76時(shí)，肽得率開始下降并趨于穩(wěn)定。蚯蚓勻漿液和水混合時(shí)，其pH值為6.76左右，因此選擇6.76作為自溶酶解試驗(yàn)的pH值。

2.2 溫度對(duì)蚯蚓自溶酶解的作用

由圖2可知，在35 ℃自溶酶解時(shí)，肽的得率最高。隨著溫度的上升，肽的得率緩慢下降。但在60 ℃時(shí)，肽的得率反而增大。雖然在60 ℃時(shí)仍可以獲得較高得率，但是溫度過(guò)高容易導(dǎo)致蛋白質(zhì)、肽活性發(fā)生改變。因此，選擇35 ℃為自溶酶解試驗(yàn)的溫度。

2.3 料液比對(duì)蚯蚓自溶酶解的作用

由圖3可知，隨著加水量的增大，蚯蚓肽的得率首先緩慢上升，然后緩慢下降，在料液比為1.0 g ∶ 2.0 mL時(shí)達(dá)到最大。因此，選擇料液比為1.0 g ∶ 2.0 mL。

2.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)蚯蚓自溶酶解的作用

由圖4可知，在自溶時(shí)間為1 h時(shí)，肽的得率最高，隨著自溶時(shí)間的延長(zhǎng)，肽的得率逐漸降低。

2.5 正交試驗(yàn)法優(yōu)化蚯蚓自溶水解條件

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過(guò)正交試驗(yàn)考察各因素之間的關(guān)系，結(jié)果如表2所示。

由表2可知，蚯蚓自溶酶解時(shí)間、料液比對(duì)肽的得率影響較大。最佳自溶條件為時(shí)間1 h，料液比為1.0 g∶ 1.5 mL，溫度為35 ℃，pH值為6.76。在此條件下，肽的得率可達(dá)到163%。

2.6 蚯蚓小分子多肽提取物的小試制備

1.7 kg鮮蚯蚓在最優(yōu)工藝條件下進(jìn)行自溶酶解，自溶酶解原液經(jīng)相對(duì)分子質(zhì)量為3 000的超濾膜過(guò)濾，濾液再經(jīng)相對(duì)分子質(zhì)量為300的納濾膜截留，截留液冷凍干燥，共制備得到103.39 g蚯蚓小分子多肽提取物，去除蚯蚓本身腥味，略帶獨(dú)特香味。經(jīng)雙縮脲試劑法檢測(cè)，肽的含量約為27.8%。采用HPLC法對(duì)自溶酶解原液和蚯蚓小分子多肽提取物分別進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖5所示。

經(jīng)對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)蛋白出峰時(shí)間，蚯蚓自溶酶解原液中主要為小分子多肽和氨基酸，但仍有較多的大分子肽和蛋白質(zhì)。與自溶酶解原液相比，通過(guò)分子截留技術(shù)獲得的蚯蚓小分子多肽提取物主要為相對(duì)分子質(zhì)量3 000（保留時(shí)間為17.352 min）以下的小分子多肽及氨基酸，不含大分子的多肽和蛋白質(zhì)。

2.7 蚯蚓小分子多肽提取物總氮含量及游離氨基酸含量

經(jīng)凱氏定氮法檢測(cè)，每100 g蚯蚓小分子多肽提取物樣品中總氮含量為12.0 g，以換算系數(shù)6.25計(jì)算，蛋白質(zhì)含量約為75%左右。如表3所示，蚯蚓小分子多肽提取物樣品中16種游離氨基酸總含量為35.5%。每100 g樣品中含有賴氨酸1.59 g，苯丙氨酸2.79 g，蘇氨酸3.18 g，異亮氨酸 2.43 g，亮氨酸5.65 g，纈氨酸2.48 g。

2.8 蚯蚓小分子多肽提取物的抗氧化活性

采用DPPH法檢測(cè)蚯蚓小分子多肽提取物對(duì)DPPH自由基的清除作用，以α-熊果苷為陽(yáng)性對(duì)照，結(jié)果如圖6所示。

由圖6可知，低濃度時(shí)，α-熊果苷對(duì)DPPH自由基的清除作用較為明顯，0.8 mg/mL α-熊果苷處理下，DPPH自由基清除率達(dá)84.3%。低濃度LMWPEE處理下，蚯蚓小分子多肽提取物對(duì)DPPH自由基具有清除作用，但效果不明顯，隨著LMWPEE濃度的升高，對(duì)DPPH自由基的清除作用逐漸增強(qiáng)。當(dāng)LMWPEE濃度升至5 mg/mL時(shí)，DPPH自由基清除率為48.3%；當(dāng)LMWPEE濃度進(jìn)一步升高至10 mg/mL時(shí)，DPPH 自由基清除率達(dá)91.1%。

采用鄰苯三酚法檢測(cè)蚯蚓小分子多肽提取物對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用，以維生素C為陽(yáng)性對(duì)照，結(jié)果如圖7所示。維生素C濃度較低時(shí)，維生素C對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用較為明顯；當(dāng)維生素C濃度為0.5 mg/mL時(shí)，清除率達(dá)92.5%。LMWPEE對(duì)超氧陰離子自由基有一定的清除作用，當(dāng)LMWPEE濃度為10 mg/mL時(shí)，超氧陰離子自由基清除率為20.7%；當(dāng)LMWPEE濃度達(dá)30 mg/mL時(shí)，超氧陰離子自由基清除率達(dá)到53.0%。

綜合體外抗氧化活性的檢測(cè)結(jié)果，蚯蚓小分子多肽提取物對(duì)自由基的清除作用具有一定的選擇性，高濃度下對(duì) DPPH 自由基的清除作用較為明顯，對(duì)超氧陰離子自由基具有一定的清除作用。

3 結(jié)論

目前，蚯蚓蛋白質(zhì)水解工藝主要以生成氨基酸為主。劉波等通過(guò)外源酶和內(nèi)源酶水解獲得的產(chǎn)物中，相對(duì)分子質(zhì)量220以下的含量約72%，即氨基酸含量都接近72%[15-16]。李國(guó)雷等通過(guò)加長(zhǎng)自溶酶解時(shí)間至48 h，獲得的酶解產(chǎn)物中氨基酸含量更高，約78%[14]。這些研究報(bào)道并未對(duì)水解產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步處理，水解液不僅仍帶有蚯蚓自身的腥味，且不利于保存。本研究首次采用雙縮脲試劑法，以肽的得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)蚯蚓自溶酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化。確定了蚯蚓自溶酶解的最佳制備工藝為：反應(yīng)時(shí)間1 h，料液比1.0 g ∶ 1.5 mL，溫度35 ℃，pH值6.76。同時(shí)，采用分子膜截留技術(shù)和冷凍干燥技術(shù)，對(duì)酶解液進(jìn)行處理，制備獲得了蚯蚓小分子多肽提取物。去除了蚯蚓自身所帶的腥味，產(chǎn)品為微黃色、略帶香味的粉末，主要含有相對(duì)分子質(zhì)量3 000以下的小分子多肽和氨基酸，16種游離氨基酸總含量為35.5%。通過(guò)雙縮脲試劑法檢測(cè)，肽的含量為27.8%，由于該檢測(cè)法對(duì)二肽靈敏度不高，因此肽的實(shí)際含量應(yīng)更高。在濃度為10、30 mg/mL時(shí)，蚯蚓小分子多肽提取物對(duì)DPPH自由基和超氧陰離子自由基的清除率分別為91.1%、53.0%。本研究制備工藝簡(jiǎn)單，不引入其他外源蛋白酶，去除了蚯蚓自身腥味，制備獲得了微黃色粉末狀、略帶香味的蚯蚓小分子多肽提取物。該產(chǎn)品不僅具有均衡的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而且具有較好的抗氧化活性，可應(yīng)用于抗衰老和增強(qiáng)免疫等功能的保健食品開發(fā)。

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