白僵菌孢子懸液添加促進(jìn)劑對(duì)茶毛蟲幼蟲侵染的對(duì)比試驗(yàn)

李靜　馬媛　趙洪

摘要：將15%乙醇、2%吐溫、2.5%肥皂水分別添加進(jìn)5個(gè)濃度梯度的白僵菌孢子懸液進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)。結(jié)果表明：添加促進(jìn)劑能使茶毛蟲幼蟲半數(shù)死亡時(shí)間提前，添加15%乙醇提前10 d、添加2%吐溫提前7 d、添加2.5%肥皂水提前7 d。根據(jù)以上結(jié)果可知，對(duì)比添加乙醇最好，但考慮添加的量和成本問題，添加肥皂水最經(jīng)濟(jì)。

關(guān)鍵詞：白僵菌；孢子；茶毛蟲；半數(shù)死亡時(shí)間

中圖分類號(hào)： S435.711 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2016）07-0170-02

白僵菌（Beauveria bassiana）是昆蟲病原真菌之一，遍布全世界，寄主范圍廣，是用于生物防治的真菌，近年來較多應(yīng)用在蝗蟲、松毛蟲、玉米螟等重大害蟲的防治上[1]。白僵菌殺蟲機(jī)理是其孢子接觸害蟲后產(chǎn)生芽管，牙管分泌一種溶解幾丁酶，溶解蟲體表面的幾丁質(zhì)后進(jìn)入蟲，牙管不斷生長(zhǎng)伸入蟲體內(nèi)壁，并伸長(zhǎng)變?yōu)榫z，不但吸取蟲體的水分和養(yǎng)分而不斷生長(zhǎng)、伸長(zhǎng)、分枝、增殖，擾亂蟲體的新陳代謝，直到整個(gè)蟲體充滿菌絲而死亡[2]。采用白僵菌制成的殺蟲劑對(duì)人、畜無毒，對(duì)作物安全，無殘留、無污染，對(duì)鱗翅目、鞘翅目、同翅目等昆蟲有毒害作用，是一類比較理想的綠色環(huán)保型生物殺蟲劑[3-4]。

茶毛蟲是茶樹的主要害蟲之一，主要危害茶樹的是幼蟲，茶毛蟲的幼蟲取食是茶樹的葉片，大量發(fā)生時(shí)將茶樹芽葉、嫩梢、樹皮咀食殆盡，嚴(yán)重影響茶葉的產(chǎn)量和茶樹的長(zhǎng)勢(shì)[5]。長(zhǎng)期以來茶毛蟲的發(fā)生產(chǎn)生危害時(shí)還是以化學(xué)防治為主，農(nóng)藥殘留嚴(yán)重影響和制約了茶葉的產(chǎn)業(yè)發(fā)展，尋找一種高效、無污染、無農(nóng)藥殘留、無副作用的新技術(shù)防控茶毛蟲對(duì)茶葉的危害，是目前茶樹病蟲害防治中的重要工作之一。

在白僵菌的前期研究中發(fā)現(xiàn)，白僵菌侵染茶毛蟲到致死所需要的時(shí)間較長(zhǎng)，采用紫外線誘變，篩選優(yōu)良菌株效果不理想。白僵菌殺蟲見效慢，是白僵菌用作生物農(nóng)藥的瓶頸，因此本研究采用在白僵菌孢子懸液里添加促進(jìn)劑，以期縮短侵染時(shí)間，提高死亡率，為白僵菌對(duì)茶毛蟲的生物防治提供了一些參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種 白僵菌菌由黔南民族師范學(xué)院生命科學(xué)系微生物實(shí)驗(yàn)室從白僵蠶分離得到。

1.1.2 供試蟲源 在貴州省都勻毛尖茶茶園基地采集到茶毛蟲1齡幼蟲。

1.2 方法

1.2.1 昆蟲飼養(yǎng) 采集1齡幼蟲，放入廣口瓶中，瓶口用紗布封口，紗布上放3層濕面紗，瓶?jī)?nèi)放蘸濕的棉花保濕，每瓶加入3～5張鮮葉為飼料，瓶?jī)?nèi)葉片大多被食用時(shí)，及時(shí)去除殘片，加入新葉。培養(yǎng)瓶放在溫度23.5 ℃左右、相對(duì)濕度70%～80%、光—暗周期12 h—12 h的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[6]，培養(yǎng)到3齡幼蟲，用于后面的試驗(yàn)。

1.2.2 菌種活化 采用滅菌PDA培養(yǎng)基上，在超凈工作臺(tái)中，接種白僵菌在平板培養(yǎng)基中，將平板培養(yǎng)基放入26 ℃的恒溫箱中進(jìn)行培養(yǎng)；培養(yǎng)7～10 d后，白僵菌長(zhǎng)滿整個(gè)平板后備用。

1.2.3 孢子懸液的制備 在長(zhǎng)滿白僵菌的平板上加入10 mL 的無菌水，用無菌棉花過濾，濾液用5 000 r/min的離心機(jī)清洗3次。采用平板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)清洗后的孢子懸液濃度為297×108 CFU/mL，采用濃度梯度法配制2.97×107、2.97×106、2.97×104、2.97×102 CFU/mL共5個(gè)濃度梯度的孢子懸液。

1.2.4 孢子懸液的侵染方法 取6個(gè)直徑為120 mm的培養(yǎng)皿，分別放入20頭茶毛蟲3齡幼蟲，在飼養(yǎng)方法不變的條件下，利用注射器分別用以上5種濃度梯度的白僵菌孢子懸液噴水到蟲體上，并用無菌水作空白對(duì)照，每天噴霧1次，連續(xù)噴霧3 d，然后觀察茶毛蟲的活動(dòng)狀況。

1.2.5 添加促進(jìn)劑在孢子懸液的方法 按15%乙醇、2%吐溫、2.5%肥皂水，分別添加進(jìn)5個(gè)濃度梯度的白僵菌孢子懸液，用以上孢子懸液的侵染方法感染茶毛蟲，觀察茶毛蟲的死亡情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶毛蟲幼蟲（茶毛幼）形態(tài)特點(diǎn)及生活習(xí)性觀察

2.1.1 茶毛幼形態(tài)特點(diǎn) 1齡幼蟲體長(zhǎng)為2 mm左右，淡黃褐色，體被褐色短毛和黃色長(zhǎng)毛，到5～7齡時(shí)，蟲體長(zhǎng) 18～26 mm，體色均為黃褐色。

2.1.2 茶毛幼生活習(xí)性 茶毛蟲幼蟲共有6～7個(gè)齡期，每年發(fā)生3～4代[7]。（1）群集性：1～2齡幼蟲時(shí)，群集性強(qiáng)，幾十頭至百余頭幼蟲聚集在茶葉的背面取食。3齡幼蟲開始分群，10頭至幾十頭不等群集，移動(dòng)時(shí)，1頭帶頭遷移，后面的緊追不舍。人為地將它們?cè)谕伙曫B(yǎng)裝置中分散，約20 min后它們又群聚在一起。到5齡幼蟲以后，個(gè)體各自分散行動(dòng)。（2）取食性：1～2齡幼蟲聚集在茶葉的背面，僅啃食葉的下表皮和葉肉，使葉片呈薄膜狀，3齡幼蟲，開始葉片全食，造成葉片大面積缺口，到5齡幼蟲以后，各自尋找食物，葉片全食，吃光1張，再移1張。（3）取食時(shí)間：在野外茶毛幼在08：00左右開始取食，在10：00 左右停止，中途因?yàn)樘鞖鉄幔团赖街車^陰涼的雜草中躲藏；下午在17：00左右，出現(xiàn)在茶葉上取食。在室內(nèi)培養(yǎng)，一般08：00—11：00取食，中途到茶葉背面躲藏，不取食，到16：00—19：00取食，晚上也到背面躲藏，不取食。

2.2 不同濃度孢子懸液的白僵菌對(duì)茶毛幼觸殺的影響

采用5個(gè)濃度梯度的孢子懸液和1個(gè)空白對(duì)照，對(duì)每組20頭茶毛幼進(jìn)行噴灑觸殺，15 d后有蟲死亡。

由表1和圖1可知，白僵菌孢子濃度在2.97×108 CFU/mL時(shí)，茶毛幼半數(shù)致死時(shí)間最短，需要20 d，隨著孢子濃度降低，半數(shù)死亡時(shí)間延長(zhǎng)，致死率也逐漸降低。白僵菌濃度在2.97×104、2.97×102 CFU/mL時(shí)，死亡率達(dá)不到100%。

2.3 不同濃度白僵菌孢子懸液添加15%乙醇對(duì)茶毛幼觸殺的影響

添加15%乙醇到5個(gè)濃度梯度的孢子懸液和15%乙醇作為空白對(duì)照，對(duì)每組20條茶毛幼進(jìn)行噴灑觸殺，2 d后有蟲死亡。

根據(jù)表1和表2、圖2的數(shù)據(jù)對(duì)比，添加15%乙醇茶毛幼殺蟲半數(shù)致死時(shí)間提前了10 d，添加乙醇的白僵菌孢子隨著濃度的降低需要的半數(shù)死亡時(shí)間延長(zhǎng)；在5～8 d時(shí)，茶毛幼死亡數(shù)都為0，說明前期茶毛幼死亡是由乙醇導(dǎo)致的。

2.4 不同濃度白僵菌孢子懸液添加2%吐溫對(duì)茶毛幼觸殺的影響

添加2%吐溫到5個(gè)濃度梯度的孢子懸液和2%吐溫作為空白對(duì)照，對(duì)每組20條茶毛幼進(jìn)行噴灑觸殺，11 d后有蟲死亡。

根據(jù)表3、圖3和表1的數(shù)據(jù)對(duì)比，添加2%吐溫白僵菌孢子懸液茶毛幼殺蟲半數(shù)致死時(shí)間提前了7 d，添加吐溫的白僵菌孢子隨著濃度的降低半數(shù)致死時(shí)間延長(zhǎng)；茶毛幼死亡時(shí)間集中在15～16 d，死亡較為集中整齊。

2.5 不同濃度白僵菌孢子懸液添加2.5%肥皂水對(duì)茶毛幼觸殺的影響

添加2.5%肥皂水到5個(gè)濃度梯度的孢子懸液和2.5%肥皂水作為空白對(duì)照，對(duì)每組20頭茶毛幼進(jìn)行噴灑觸殺，12 d 后有蟲死亡。

根據(jù)表4、圖4和表1的數(shù)據(jù)對(duì)比，添加2.5%肥皂水白僵菌孢子懸液茶致死毛幼殺蟲半數(shù)時(shí)間提前了7 d，隨著孢子濃度的降低，致死率也逐漸降低。茶毛幼死亡時(shí)間集中在15～18 d。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

茶毛蟲具有年幼時(shí)聚集在一起、成蟲時(shí)分開的特性，取食時(shí)具有早晚陰涼時(shí)取食、中午為避開炎熱躲藏起來的特性。

茶毛幼隨著白僵菌孢子濃度降低需要的半數(shù)死亡時(shí)間逐漸延長(zhǎng)；并隨著孢子濃度的降低，致死率也逐漸降低。

添加促進(jìn)劑能使茶毛幼半數(shù)致死時(shí)間提前，添加15%乙醇提前10 d、添加2%吐溫提前了7 d、添加2.5%吐溫提前了7 d。根據(jù)以上對(duì)比添加乙醇最好，但考慮添加的量和成本問題，添加肥皂水最經(jīng)濟(jì)。

白僵菌孢子濃度在2.97×108、2.97×107、2.97×106 CFU/mL 時(shí)，茶毛幼死亡率均為100%，2.97×108、297×107 CFU/mL侵染茶毛幼差異明顯，建議孢子濃度在2.97×107個(gè)/mL較為適宜。

3.2 討論

添加促進(jìn)劑15%乙醇2 d就能使茶毛幼死亡，與未添加的相比時(shí)間提前13 d，但在5～8 d時(shí)死亡率都為0，根據(jù)空白對(duì)照可知，15%乙醇就可以使茶毛幼死亡，所以確定白僵菌致死茶毛幼需要的時(shí)間是實(shí)際提前9 d，比不添加促進(jìn)的白僵菌提前6 d，促進(jìn)作用還是很明顯。

添加乙醇有促進(jìn)白僵菌致死茶毛幼的作用，可能是因?yàn)橐掖加袧B透作用，促進(jìn)白僵菌孢子進(jìn)入茶毛幼基體內(nèi)，白僵菌在蟲體內(nèi)生長(zhǎng)；而吐溫和肥皂水都是表面活性劑，由于白僵菌孢子懸液進(jìn)入蟲體較困難，一是蟲體表面被毛，二是表面有活性張力，而吐溫和肥皂水都有降低表面活性張力的作用，促進(jìn)白僵菌孢子進(jìn)入蟲體，白僵菌在蟲體萌發(fā)生長(zhǎng)，達(dá)到致死茶毛幼的作用，促進(jìn)作用較乙醇差一些。

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