基于新版本農業(yè)行業(yè)標準的水稻品種真實性SSR檢測方法

楊華　李亞春　毛從亞

摘要：新的農業(yè)行業(yè)標準NY/T 1433—2014《水稻品種鑒定技術規(guī)程：SSR標記法》于2014年6月1日實施，筆者所在實驗室依據(jù)新的標準建立了新的水稻品種真實性鑒定體系。將2個水稻樣品（編號為A、B）與其標注的品種名稱相同的標準樣品（編號：SD20140244）進行了比對，結果表明，樣品A與標準樣品無位點差異，判定為近似品種；樣品B與標準樣品有6個位點差異，判定為不同品種。

關鍵詞：水稻；行業(yè)標準；品種真實性鑒定

中圖分類號： S511.037 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）07-0087-03

水稻品種真實性鑒定即鑒定一份種子樣品與所屬的品種、種或文件描述是否相符。最初一般采取田間種植鑒定的方法對品種真實性進行鑒定，但是由于此方法周期長，有時鑒定結果出來后種子銷售已經(jīng)結束，不能滿足種子市場管理機構快速、準確鑒定種子真實性的新要求。另外由于江蘇省以常規(guī)水稻為主，部分品種親緣關系比較近，田間種植表型差異很小，甚至基本無表型差異，給鑒定工作造成了困擾。隨著生物技術的飛速發(fā)展，分子標記技術尤其是SSR分子標記技術在品種真實性鑒定工作中被廣泛應用[1-4]。SSR分子標記具有非組織和發(fā)育階段特異性、不容易受外界環(huán)境影響、多態(tài)性高、在基因組中分布廣泛、呈共線性遺傳等優(yōu)點[5-7]。采用SSR分子標記技術檢測品種真實性的方法快速、簡便且重演性高。2007年，國家出臺了農業(yè)行業(yè)標準NY/T 1433—2007《水稻品種鑒定：DNA指紋方法》，一直以來，種子檢測機構進行水稻品種真實性鑒定工作時都是以此標準作為檢測和結果判定的依據(jù)。2014年，農業(yè)部在深入研究和廣泛征求基層單位意見的基礎上更新了此標準，出臺了新的農業(yè)行業(yè)標準NY/T 1433—2014 《水稻品種鑒定技術規(guī)程：SSR標記法 》。本檢驗室依據(jù)新的技術標準建立起新的水稻品種真實性鑒定體系，并進行了大量的檢驗工作對新體系進行驗證。本研究以2個水稻樣品（編號為A、B）與其標注的品種名稱相同的標準樣品（編號：SD20140244）比對為例，說明此方法的可操作性和適用性。

1 材料與方法

1.1 標準樣品

選取保存在江蘇省農作物種子質量檢驗中心標準樣品庫中編號為SD20140244的標準樣品。

1.2 待測樣品

2個待測樣品分別來自市場抽檢中標簽標注與編號為SD20140244的標準樣品品種名稱相同的樣品，編號為A、B。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取 本試驗采用水稻干種子直接提取方法，樣品經(jīng)SPEX Geno 2010 高通量冷凍研磨機磨碎后，用Omega公司的植物基因組DNA提取試劑盒（E.Z.N.A.TM Plant DNA Kit D3485-01）提取水稻全基因組DNA，詳細方法見試劑盒說明書。用微量紫外分光光度計（Thermo Scientific ND2000）檢測DNA質量濃度，并稀釋到50 ng/μL備用。

1.3.2 PCR擴增 采用NY/T 1433—2014《水稻品種鑒定技術規(guī)程：SSR標記法》標準中規(guī)定的48對引物進行PCR擴增。采用北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司 PER001-2型號Taq酶混合物作為反應體系。反應程序為：94 ℃下預變性2 min；進行35次擴增反應循環(huán)（94 ℃下變性45 s，58 ℃下退火45 s，72 ℃下延伸1 min）；72 ℃下延伸8 min；10 ℃恒溫冷卻。

1.3.3 電泳及染色 采用NY/T 1433—2014《水稻品種鑒定技術規(guī)程：SSR標記法》中規(guī)定的非變形聚丙烯酰胺凝膠電泳和染色方法。染色結束后用Bio-RAD公司的Gel Dox XR+型號凝膠成像系統(tǒng)進行掃描成像，并用Image lab 4.1軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結果與分析

2.1 DNA提取

鑒于之前標準中需要先發(fā)芽再提取DNA的周期太長，近1周時間，本研究直接采用干種子磨碎DNA提取試劑盒的方法進行提取，每個樣品只需1.5 h就能提取到水稻全基因組DNA，提取的DNA經(jīng)過檢測質量較高（表1），完全符合PCR擴增的需要，極大提高了檢測效率。

2.2 PCR反應優(yōu)化

新標準中規(guī)定的48對引物最適合的退火溫度不同，為50～67 ℃，為最大限度地將標準樣品和待測樣品放于同一PCR板中進行檢測，經(jīng)過不同溫度試驗，選取58 ℃為退火溫度，在此溫度下48對引物均能得到特異性比較好的目的條帶（圖1、圖2）。

2.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳結果分析

依據(jù)新標準中的電泳方法、染色方法，2組比對試驗均得到了較為清楚的指紋圖譜。清晰的指紋圖譜是分析、判定結果的重要前提，不同的實驗室應根據(jù)自己的情況選擇合適的藥品和設備進行試驗，以得到特異性條帶清楚、背景干凈的圖譜，才能進行接下來的數(shù)據(jù)分析。指紋圖譜經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)成像后，導入分析軟件進行分析，分別標記泳道和條帶，計算條帶大小。按照新標準中的數(shù)據(jù)記錄方式記錄條帶信息。純合位點的基因型數(shù)據(jù)記錄為X/X，其中X為該位點等位變異的大小；雜合位點的基因型數(shù)據(jù)記錄為X/Y，其中X、Y為該位點上2個不同等位變異。小片段在前，大片段在后。缺失位點記錄為0/0。此種記錄方法的優(yōu)點是不僅能夠反映待測樣品與標準樣品的差異，還能反映位點的基因型及變異的大小，將數(shù)據(jù)記錄的結果統(tǒng)一，也便于后期指紋圖譜數(shù)據(jù)庫構建和不同實驗室之間標準樣品信息的共享（表2）。

2.4 SSR標記法鑒定水稻品種真實性結果判定

新標準對于結果判定也進行了規(guī)定，當樣品間差異位 點≥2，則判定為“不同品種”；當樣品間差異位點=1，則判定為“近似品種”；當樣品間差異位點=0，則判定為“極近似品種或相同品種”。從表2可以看出，樣品A與標準樣品之間無差異位點，即差異位點=1，所以判定樣品A與標準樣品為相同品種；樣品B與標準樣品在引物（B02、B06、B11、C02、C09、C11）擴增出的基因位點上存在差異，即樣品間差異位點為6，判定樣品B與標準樣品為“不同品種”。

3 結論與討論

江蘇省是種業(yè)大省，同時也是中國水稻主產(chǎn)省和高產(chǎn)省之一，素有“魚米之鄉(xiāng)”之稱，從事農作物品種選育的科研單位40余家，目前為止通過江蘇省審定的水稻品種有213個，通過國家審定的有78個，品種眾多[8]。正是因為品種多、品種雜以及從事水稻生產(chǎn)銷售的主體多，使得種子市場上制售假劣種子、套牌侵權、未審先推等問題屢屢出現(xiàn)，在社會上引起了廣泛關注，嚴重損害了農民和品種權人權益，阻礙了現(xiàn)代種業(yè)可持續(xù)發(fā)展。這就要求從事相關種子檢測工作的檢驗中心具備有據(jù)可依、快速、準確的品種真實性鑒定手段。2014年實施的農業(yè)行業(yè)新標準在試驗方法、數(shù)據(jù)記錄與統(tǒng)計、結果判定等方面都進行了優(yōu)化和改進，并且將原來的24對引物保留了19對，新增了29對引物，最終確定了48對引物；此外還增加了變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和毛細管電泳熒光檢測等新的檢測平臺。新標準的實施為水稻品種真實性鑒定室內分子檢測方法提供了判定依據(jù)，新標準檢測體系也能為農業(yè)行政執(zhí)法部門開展執(zhí)法工作以及種子市場監(jiān)管工作提供相應的技術支撐，減少假劣種子進入市場的概率，促進江蘇省種業(yè)健康、有序、可持續(xù)發(fā)展。

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