基于EST序列的甘蔗SNP發(fā)掘及分析

檀小輝　張繼　梁芳

摘要：從NCBI中的EST數(shù)據(jù)庫(kù)下載已公布的甘蔗EST序列28 512條，利用DNAStar軟件中的Seqman程序進(jìn)行疊連群構(gòu)建，EST序列共構(gòu)建3 449個(gè)疊連群，從中篩選出93個(gè)疊連群，長(zhǎng)度共計(jì)105 385 bp，發(fā)現(xiàn)候選SNP位點(diǎn) 1 449個(gè)，SNP平均出現(xiàn)頻率為1.37%，共有74個(gè)contigs含有SNP位點(diǎn)，平均每個(gè)contig含有19.58個(gè)SNP位點(diǎn)，含有SNP位點(diǎn)數(shù)最多的1個(gè)疊連群有229個(gè)SNP候選位點(diǎn)，不同的疊連群含有的SNP位點(diǎn)數(shù)量差異較大，但轉(zhuǎn)換類型與顛換類型所占比例很接近。本研究所用的疊連群的總長(zhǎng)度是105 385 bp，平均72.93 bp含有1個(gè)SNP位點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：甘蔗；NCBI；EST序列；DNAStar；SNP位點(diǎn)

中圖分類號(hào)： S566.101 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2016）07-0064-03

單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）指基因組內(nèi)DNA序列在某一特定的核苷酸位置發(fā)生缺失、插入、顛換、轉(zhuǎn)換等變化。作為第3代遺傳標(biāo)記，已在動(dòng)植物遺傳連鎖圖譜構(gòu)建[1]、重要性狀的基因定位[2]、多樣性分析[3]以及品種鑒定[4]等相關(guān)研究中得到廣泛的應(yīng)用，跟以簡(jiǎn)單序列重復(fù)（SSR）為代表的第2代分子標(biāo)記相比，SNP具有易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化分析、遺傳穩(wěn)定性強(qiáng)、密度高等優(yōu)點(diǎn)。但SNP標(biāo)記開發(fā)在前期測(cè)序階段成本較高而限制了SNP相關(guān)標(biāo)記的大規(guī)模開發(fā)。因此，利用已有數(shù)據(jù)，通過生物信息學(xué)進(jìn)行相關(guān)分析來開發(fā)SNP標(biāo)記，然后通過相關(guān)試驗(yàn)對(duì)候選SNP標(biāo)記加以驗(yàn)證，已成為一種降低成本且快捷高效的SNP開發(fā)途徑[5]。

表達(dá)序列標(biāo)簽 （expressed sequence tags，EST）是來源于功能基因表達(dá)的cDNA片段，是轉(zhuǎn)錄區(qū)域多態(tài)性識(shí)別的重要資源，隨著相關(guān)研究的深入，公共數(shù)據(jù)庫(kù)中的核苷酸序列中EST序列的增速最快，以EST序列為基礎(chǔ)開發(fā)分子標(biāo)記，變得越來越方便。目前，常用的EST標(biāo)記有EST-AFLP、EST-RFLP、EST-SSR、EST-SNP等[6]。除了具有一般分子標(biāo)記的特點(diǎn)，EST標(biāo)記還具有通用性好、信息量大、開發(fā)方法簡(jiǎn)單快捷以及成本低等優(yōu)點(diǎn)。因?yàn)镋ST序列是基因表達(dá)區(qū)的cDNA序列，所以EST序列為基礎(chǔ)開發(fā)出的SNP位點(diǎn)很可能與表達(dá)基因的功能密切相關(guān)，或者直接在基因的編碼區(qū)之內(nèi)，可直接用于動(dòng)植物分子育種等相關(guān)領(lǐng)域的研究[7]。而且在EST序列中，SNP頻率很豐富[8]。因此，在尚未獲得基因組全序列的動(dòng)植物中，開發(fā)EST-SNP標(biāo)記具有重要意義[9]。但NCBI中甘蔗dbEST數(shù)據(jù)庫(kù)中的EST-SNP研究在國(guó)內(nèi)外尚未發(fā)現(xiàn)相關(guān)報(bào)道，本研究利用NCBI上公布的甘蔗EST數(shù)據(jù)中篩選SNP候選位點(diǎn)，為甘蔗EST-SNP標(biāo)記的開發(fā)以及后續(xù)的分子生物學(xué)研究奠定一定的基礎(chǔ)。截至2014年10月，NCBI的dbEST數(shù)據(jù)庫(kù)中已收錄了甘蔗EST序列28萬多條，如此龐大的數(shù)據(jù)為從甘蔗EST序列中開發(fā)SNP標(biāo)記提供了良好的數(shù)據(jù)支持，甘蔗EST-SNP標(biāo)記的開發(fā)可為甘蔗分子育種和基因組學(xué)等方面的研究提供重要的技術(shù)支持，本研究從NCBI中的dbEST數(shù)據(jù)庫(kù)中下載了28 512條EST序列，利用DNAStar軟件中的Seqman程序拼接得到3 449個(gè)重疊群（contigs），并將拼接結(jié)果進(jìn)行人工篩選，為提高候選SNP位點(diǎn)的可靠度，本研究選用的EST序列拼接而成的contigs都至少含有20條EST序列，每個(gè)候選位點(diǎn)都至少有5條EST序列的相關(guān)位點(diǎn)作為支持，旨在發(fā)掘甘蔗的EST-SNP位點(diǎn)和尋求能得到大量可靠的候選SNP位點(diǎn)的篩選方法。

1 材料與方法

2014年10月13日從美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站dbEST數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nucest/？term=sugarcane）下載28 512條甘蔗EST序列，所有序列均以FASTA格式保存，未得到可靠性較高的SNP候選位點(diǎn)，本研究用DNAStar軟件中的Seqman程序檢測(cè)并去除所有EST序列的載體序列，然后組裝拼接成contigs。因?yàn)楸狙芯窟x取DNAStar軟件進(jìn)行EST-SNP候選位點(diǎn)的開發(fā)，因此篩選步驟主要分為以下幾類：（1）在Seqman的拼接結(jié)果中提取包含20條以上EST序列的contigs，并在其中篩選候選SNP位點(diǎn)；（2）候選SNP位點(diǎn)兩側(cè)至少有5 bp堿基要完全保守為原則對(duì)候選SNP位點(diǎn)進(jìn)行人工篩選；（3）對(duì)篩選結(jié)果進(jìn)行整理、歸納、分析。

SNP發(fā)掘：應(yīng)用Seqman程序的SNP工具查找SNP候選位點(diǎn)。

SNP頻率計(jì)算：SNP頻率=（候選SNP數(shù)目/contigs長(zhǎng)度）×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 候選位點(diǎn)的人工篩選

對(duì)候選軟件篩選出的SNP位點(diǎn)根據(jù)2個(gè)篩選原則進(jìn)一步人工將可靠度較高的SNP位點(diǎn)篩選出來：（1）候選SNP位點(diǎn)中的次要等位基因頻率至少為30%[10]；（2）候選SNP位點(diǎn)兩側(cè)至少有5 bp完全保守的序列。Wang等研究發(fā)現(xiàn)，在包含不小于4條EST序列的contigs中篩選SNP時(shí)，候選SNP位點(diǎn)的主要、次要等位基因出現(xiàn)的頻率之比約為1 ∶ 1時(shí)的可靠度最高[11]。為了進(jìn)一步提高候選SNP位點(diǎn)的可靠度，本研究在篩選SNP候選位點(diǎn)時(shí)，把包含4條EST序列的contigs提高到至少包含20條EST序列的contigs，同時(shí)，在1個(gè)候選SNP位點(diǎn)的兩側(cè)經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)間斷或連續(xù)的非SNP位點(diǎn)的不保守區(qū)域，這些區(qū)域可能是在比對(duì)時(shí)序列錯(cuò)誤引起的，從而降低了候選SNP位點(diǎn)的可靠度，因此本研究規(guī)定候選SNP位點(diǎn)兩側(cè)至少5序列必須完全保守（圖1為合格SNP候選位點(diǎn)，圖2及圖3為不合格SNP候選位點(diǎn)）。

2.2 甘蔗EST序列SNP頻率分析

在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載28 512條甘蔗EST序列，通過序列組裝構(gòu)建3 449個(gè)contigs，為了提高SNP候選位點(diǎn)的可靠性，本研究所用的contigs均為EST序列條數(shù)大于20的contigs，經(jīng)過篩選，共有92個(gè)contigs符合要求，92個(gè)contigs的堿基總數(shù)為105 385個(gè)bp，發(fā)現(xiàn)1 449個(gè)SNP位點(diǎn)，SNP出現(xiàn)的頻率為1.37%，平均72.93個(gè)bp含有1個(gè)SNP位點(diǎn)?？偣灿?4個(gè)contigs含有SNP位點(diǎn)，平均1個(gè)contig含有1958個(gè)SNP位點(diǎn)（表1），含有SNP位點(diǎn)數(shù)目最多的contig中含有281個(gè)SNP候選位點(diǎn)，含有5、8個(gè)SNP候選位點(diǎn)的contigs最多（8個(gè)）（表2）。

本研究使用的EST序列包含SNP位點(diǎn)以堿基的顛換（49.00%）和轉(zhuǎn)換（49.07）為主，其中堿基的插入、缺失的數(shù)量最少，占全部SNP的1.93%，不同疊連群所含不同突變類型SNP位點(diǎn)的數(shù)量差異較大，所以分布密度的變化也很大（表3）。

由甘蔗EST序列構(gòu)建的contigs中，組成contigs的EST序列條數(shù)和組成contigs的堿基數(shù)不同，得到SNP位點(diǎn)的頻率也就不同，組成contigs的堿基數(shù)越多，其SNP位點(diǎn)的頻率就越大。表4為甘蔗EST序列組成的序列數(shù)最多的10個(gè)contigs及SNP出現(xiàn)頻率，這10個(gè)contigs共組裝了5 053條序列，SNP平均出現(xiàn)頻率為3.48%，明顯高于所有用于篩選候選位點(diǎn)的contigs的SNP出現(xiàn)頻率1.37%，所以大規(guī)格contigs（多序列、多堿基數(shù)）更易得到候選SNP位點(diǎn)。另外，檢測(cè) EST-SNP位點(diǎn)時(shí)，需大量冗余EST序列作為其檢測(cè)的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，如果EST條數(shù)少，得到的結(jié)果可能就不太理想，這也是本研究用至少包含20條EST序列的contigs進(jìn)行SNP位點(diǎn)篩

3 結(jié)論與討論

SNP廣泛分布于動(dòng)植物的基因組中，是動(dòng)植物基因組中可遺傳變異中最常見的一種，據(jù)估計(jì)，SNP在人類基因組中廣泛分布，平均每500～1 000 bp對(duì)中就有1個(gè)SNP，其總數(shù)可能在300萬個(gè)以上[12]。作為第3代遺傳標(biāo)記，由于SNP具有許多獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，自從1994年問世以來，已越來越被分子標(biāo)記領(lǐng)域的相關(guān)研究人員所重視，特別是cDNA的SNP，因其本身就是功能基因表達(dá)的組成部分，所以SNP被公認(rèn)為新一代分子標(biāo)記中最有應(yīng)用前景的一類。然而，由于SNP的開發(fā)難度大、檢測(cè)成本高，需要高額的資金投入以及大量的時(shí)間投入，導(dǎo)致該標(biāo)記在甘蔗基因組研究領(lǐng)域的應(yīng)用很少。但是如果以生物信息學(xué)為技術(shù)基礎(chǔ)，以大量冗余EST序列為數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，EST-SNP的開發(fā)就成為一種既高效又廉價(jià)的方法[7，13-14]。但是，目前有很多因素都限制了EST-SNP的發(fā)掘，比如為了節(jié)約成本，EST序列在測(cè)序時(shí)只進(jìn)行單向測(cè)序，測(cè)序結(jié)果的低質(zhì)量進(jìn)而導(dǎo)致篩選SNP位點(diǎn)會(huì)有預(yù)測(cè)已經(jīng)查找方面的錯(cuò)誤；EST序列來源對(duì)SNP位點(diǎn)的篩選也有很大的影響。但是，通過改進(jìn)方法，可以對(duì)EST-SNP位點(diǎn)進(jìn)行更準(zhǔn)確、高效的發(fā)掘。通過有28萬多條EST可以看出，人們對(duì)甘蔗的關(guān)注度很高，但是到目前為止還沒有在NCBI中的SNP數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)甘蔗SNP的相關(guān)數(shù)據(jù)，這可能與甘蔗是由多倍體原種熱帶種（2n=80，x=10）與多倍體野生種割手密（2n=40～128，x=8）經(jīng)過一系列雜交之后形成的異源多倍體有關(guān)，其遺傳背景非常復(fù)雜，染色體數(shù)在100～150條之間，因此甘蔗在分子遺傳連鎖圖譜、質(zhì)量性狀基因定位、數(shù)量性狀基因定位以及分子標(biāo)記輔助輔助育種方面遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于其他作物[15]。因此，本研究對(duì)甘蔗SNP標(biāo)記的開發(fā)研究就更具有重要意義，為了保證SNP位點(diǎn)的準(zhǔn)確性，對(duì)滿足SNP位點(diǎn)contigs包含的EST序列的要求就更高，必須是包含20條以上的EST序列序列組成的contigs，這樣一來可能會(huì)有大量的真正的SNP位點(diǎn)被遺漏。但是當(dāng)contigs所含EST序列較少時(shí)，又可能會(huì)有大量的EST序列無法被利用，EST序列不能被用于SNP位點(diǎn)的篩選，因此，筆者認(rèn)為只有當(dāng)contigs所含EST數(shù)目超過一定程度，篩選出的候選EST-SNP位點(diǎn)的可靠性才會(huì)有保證；只有當(dāng)dbEST數(shù)據(jù)庫(kù)中EST序列達(dá)到一定程度之后，其利用率才會(huì)得到保證，篩選出的SNP位點(diǎn)的可靠性才會(huì)更高。例如，利用全基因組測(cè)序，在水稻中（品種為日本晴和9311）獲得了5 019 016個(gè)SNP位點(diǎn)[16]，另外，分布于基因表達(dá)調(diào)控區(qū)，以及外顯子和內(nèi)含子區(qū)域的SNP可能和基因的功能直接相關(guān)[17]。同時(shí)，對(duì)contigs中所含的SNP數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，組成contigs的EST序列條數(shù)越多，堿基數(shù)越多，發(fā)現(xiàn)的候選SNP位點(diǎn)的數(shù)量也就越多，這同Duran等在研究大麥EST序列時(shí)發(fā)現(xiàn)的結(jié)果基本一致但是具體每個(gè)類型的contigs所含的SNP位點(diǎn)數(shù)沒有發(fā)現(xiàn)明顯的規(guī)律[18]，這可能跟不同物種其多態(tài)性位點(diǎn)分布不同有關(guān)。

大多數(shù)動(dòng)植物沒有全基因組序列的數(shù)據(jù)，但是有大量的EST數(shù)據(jù)可供大家分析利用，EST本身就是表達(dá)基因的片段，因此基于EST序列的的SNP可能與基因的功能以及目標(biāo)的性狀有更多的關(guān)聯(lián)，本研究從NCBI中的dbEST序列中下載了28 512條甘蔗EST序列，分析了92個(gè)由EST序列組成的contigs，這些contigs長(zhǎng)度共計(jì)105 385 bp，發(fā)現(xiàn)候選SNP位點(diǎn) 1 449 個(gè)，SNP平均出現(xiàn)頻率為3.48%，總共有74個(gè)contigs含有SNP位點(diǎn)，平均1個(gè)contig含有19.58個(gè)SNP位點(diǎn)，平均每72.93 bp發(fā)現(xiàn)1個(gè)候選SNP位點(diǎn)，低于水稻基因組中SNP發(fā)生頻率接近（水稻平均每89 bp有1個(gè)SNP）[19]，高于玉米基因組SNP發(fā)生頻率（玉米基因組平均每61 bp有1個(gè)SNP）[9]。由此可見，SNP在禾本科植物中的發(fā)生頻率相差不大。接下來準(zhǔn)備根據(jù)發(fā)掘到的SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)相應(yīng)的SNP引物，并進(jìn)行測(cè)序和酶切相結(jié)合的方法來驗(yàn)證發(fā)掘的SNP位點(diǎn)的可靠性，以期為甘蔗的分子遺傳研究提供一定的參考。

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