入侵植物乙醇提取物對(duì)福壽螺膽堿酯酶活性的影響

鄒湘輝　謝東　吳麗娜　查廣才　孫延杰

摘要：探討了入侵植物乙醇提取物對(duì)福壽螺（Pomacea canaliculata）乙酰膽堿酯酶（Acetylcholinesterase，AChE）和丁酰膽堿酯酶（Butyrylcholinesterase，BChE）活性的影響。采用乙醇提取法獲得薇甘菊（Mikania micrantha）、南美蟛蜞菊（Wedelia trilobata）和五爪金龍（Ipomoea cairica）3種入侵植物莖和葉組織活性物質(zhì)，改良Ellam法測(cè)定其對(duì)福壽螺膽堿酯酶活性的影響。結(jié)果表明，3種入侵植物的乙醇提取物對(duì)福壽螺AChE和BChE的活性均具有較強(qiáng)的抑制作用，薇甘菊和南美蟛蜞菊葉比莖的乙醇提取物抑制作用強(qiáng)，五爪金龍的莖則比葉的乙醇提取物抑制作用強(qiáng)。各提取物對(duì)膽堿酯酶的抑制作用存在濃度梯度依賴性特點(diǎn)，在質(zhì)量濃度為0.100 0 mg/mL時(shí)的抑制率接近陽(yáng)性對(duì)照組。五爪金龍的莖和薇甘菊的葉乙醇提取物對(duì)福壽螺兩種膽堿酯酶的活性具有較強(qiáng)的抑制作用，抑制率可達(dá)70%以上，說(shuō)明這兩種入侵植物具有開(kāi)發(fā)為福壽螺植物源殺螺劑的潛力。

關(guān)鍵詞：入侵植物； 福壽螺（Pomacea canaliculata）； 膽堿酯酶

中圖分類號(hào)：S966.2；X176 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）06-1451-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.06.022

入侵物種已成為影響自然生態(tài)系統(tǒng)最嚴(yán)重的全球性問(wèn)題，威脅到當(dāng)?shù)啬酥寥虻纳鷳B(tài)環(huán)境和經(jīng)濟(jì)發(fā)展[1]。菊科假澤蘭屬植物薇甘菊（Mikania micrantha）、菊科蟛蜞菊屬植物南美蟛蜞菊（Wedelia trilobata）和旋花科番薯屬植物五爪金龍（Ipomoea cairica）作為入侵植物已經(jīng)對(duì)中國(guó)南方廣大地區(qū)生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生了嚴(yán)重的影響，它們生長(zhǎng)迅速，環(huán)境適應(yīng)性和抗逆性強(qiáng)，無(wú)性繁殖能力極強(qiáng)，不斷入侵新的領(lǐng)地，同時(shí)產(chǎn)生化學(xué)物質(zhì)，殺死其他植物，形成單種群落，破壞植被和原有的生態(tài)系統(tǒng)[2-4]。爭(zhēng)奪本地植物的水分和養(yǎng)分而使其無(wú)法正常生長(zhǎng)與繁殖，導(dǎo)致死亡。

福壽螺（Pomacea canaliculata）是近些年來(lái)備受國(guó)際關(guān)注的危害性外來(lái)入侵動(dòng)物，軟體動(dòng)物門腹足綱前鰓亞綱腹足目瓶螺科瓶螺屬，原產(chǎn)南美洲亞馬遜河流域。福壽螺對(duì)環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)、食性雜、個(gè)體大、生長(zhǎng)迅速、繁殖力強(qiáng)，是危害生物多樣性、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和人類健康的世界性惡性入侵水生動(dòng)物[5-8]，2000年世界自然保護(hù)聯(lián)盟外來(lái)入侵物種專家委員會(huì)將其列為世界100種惡性外來(lái)入侵物種之一。2003年3月國(guó)家環(huán)保總局將福壽螺列入首批入侵中國(guó)的16種“危害最大的外來(lái)物種”之一[9，10]。目前，中國(guó)對(duì)螺害的控制以化學(xué)殺螺劑防治為主，在一定程度為農(nóng)業(yè)的發(fā)展發(fā)揮了較大作用，但是隨著農(nóng)業(yè)的發(fā)展，殺螺劑的使用越來(lái)越廣泛，再加上不合理利用殺螺劑，造成了環(huán)境污染，給生物的生存帶來(lái)了威脅[11]。因此尋找可持續(xù)開(kāi)發(fā)的、環(huán)境友好型植物源殺螺劑，越來(lái)越受到研究者們的重視。

膽堿酯酶已成為殺蟲劑開(kāi)發(fā)研究的重要靶酶，主要存在于動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)中的一種水解酶，它的作用是水解膽堿能神經(jīng)末梢釋放的神經(jīng)介質(zhì)乙酰膽堿。如果膽堿酯酶的作用被抑制，就會(huì)發(fā)生乙酰膽堿過(guò)剩而集聚的現(xiàn)象，引起膽堿能神經(jīng)過(guò)度興奮、類似有機(jī)磷中毒的癥狀[12，13]。膽堿酯酶抑制劑的使用能夠抑制福壽螺膽堿酯酶的活性，突觸后神經(jīng)纖維長(zhǎng)期處于興奮狀態(tài)，同時(shí)突觸部位的正常神經(jīng)沖動(dòng)傳導(dǎo)受阻塞，導(dǎo)致福壽螺中毒死亡，已成為螺害防治的重要途徑。本試驗(yàn)通過(guò)研究入侵植物五爪金龍、南美蟛蜞菊和薇甘菊乙醇提取物對(duì)福壽螺乙酰膽堿酯酶（Acetylcholinesterase，AChE）和丁酰膽堿酯酶（Butyrylcholinesterase，BChE）活性的影響，以期獲得以害治害的非化學(xué)防治福壽螺的有效途徑，為入侵生物的防治工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物材料

福壽螺成螺（9.56±2.30） g，采自廣東省潮州市湘橋區(qū)社光村田間水溝，采集后洗凈敲去殼，取斧足組織。

1.2 植物材料

薇甘菊、南美蟛蜞菊和五爪金龍均采集于韓山師范學(xué)院校內(nèi)，經(jīng)清洗后自然晾干，分離出莖和葉，剪成段，分別放入干燥箱，60 ℃干燥至恒重后磨碎，置于干燥處保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 入侵植物乙醇提取物的制備

取每種磨碎的植物樣品20 g，用95%乙醇100 mL浸泡，超聲波提取30 min，過(guò)濾得到提取液后，放進(jìn)60 ℃干燥箱蒸發(fā)濃縮成浸膏。稱取適量浸膏，用去離子水配制成0.100 0、0.050 0、0.025 0、0.012 5 mg/mL的提取物溶液，4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 酶液的制備

用手術(shù)刀將福壽螺的斧足組織切碎，磷酸緩沖鹽溶液（Phosphate buffer saline，PBS）清洗后放入離心管中，按質(zhì)量體積比1/10（g/mL）加入裂解緩沖液[10 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸、pH 7.5、1 mmol/L乙二胺四乙酸、1 mmol/L乙二醇雙（2-氨基乙基醚）四乙酸、500 mmol/L氯化鈉、0.5%曲拉通X-100、 10 μg/mL亮抑蛋白酶肽、20 μmol/L胃蛋白酶抑制劑、2.5 mmol/L鹽酸苯甲脒]后，4 ℃勻漿，12 000 r/min 30 s，間隔30 s，重復(fù)2次，4 ℃ 1 600 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液至新的離心管中，12 000 r/min 4 ℃離心20 min，取上清液，-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 膽堿酯酶活性的測(cè)定及抑制率的計(jì)算

采用改進(jìn)的Ellman等[14]方法在96孔酶標(biāo)板上測(cè)定樣品的AChE和BChE抑制活性。具體操作如下。

樣品孔：在96孔酶標(biāo)板中依次加入155 μL PBS（0.2 mol/L，pH 7.5），20 μL待測(cè)樣品溶液，5 μL 酶液。4 ℃ 孵育20 min后，加10 μL 5，5'-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）[5，5'-Dithiobis-（2-nitrobenzoic acid），DTNB]（12.5 mmol/L），室溫靜置30 min，加入10 μL底物溶液12.5 mmol/L碘化硫代乙酰膽堿（Acetylthiocholine iodide，ATCH）或碘化硫代丁酰膽堿（Butyrylthiocholine iodide，BTCH）。37 ℃孵育30 min后，用酶標(biāo)儀在405 nm下測(cè)定其吸光度值。

樣品本底對(duì)照孔：用5 μL PBS代替5 μL酶液，其他條件不變。

陰性對(duì)照孔：用20 μL PBS代替20 μL待測(cè)樣品溶液，其他條件不變。

陽(yáng)性對(duì)照孔：用20 μL 1-甲基-1，2，3，4-四氫異喹啉[1，5-Bis（4-Allyldimethylammoniumphenyl） pentan-3-one，Dibromide，BW284c51]或2 mmol/L四乙丙基焦磷酸亞胺（Tetraisopropyl pyrophosphoramide，iso-OMPA）代替20 μL待測(cè)樣品溶液，其他條件不變。

抑制率計(jì)算公式為：抑制率=A陰性對(duì)照-（A樣品-A樣品本底）/A陰性對(duì)照×100%，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 入侵植物乙醇提取物對(duì)福壽螺AChE活性的抑制效果

由表1可知，3種入侵植物乙醇提取物對(duì)福壽螺AChE活性均具有較強(qiáng)的抑制作用，但五爪金龍和薇甘菊比南美蟛蜞菊的抑制作用強(qiáng)。同種植物不同部位的乙醇提取物對(duì)福壽螺AChE的抑制強(qiáng)度也不同，薇甘菊和南美蟛蜞菊的葉乙醇提取物均比莖乙醇提取物的抑制作用強(qiáng)，五爪金龍莖乙醇提取物的抑制作用則比葉乙醇提取物強(qiáng)；在供試質(zhì)量濃度為0.100 0 mg/mL時(shí)，五爪金龍的莖和薇甘菊的葉乙醇提取物對(duì)福壽螺AChE的抑制作用最強(qiáng)，抑制率分別為（78.96±3.32）%和（77.83±4.27）%，接近于陽(yáng)性對(duì)照組的抑制率（90.21±5.89）%，其后依次為南美蟛蜞菊的葉和薇甘菊的莖乙醇提取物，抑制率分別為（65.38±8.95）%和（58.65±9.21）%，抑制率低于50%的為南美蟛蜞菊的莖和五爪金龍的葉乙醇提取物。同種植物同個(gè)部位的乙醇提取物對(duì)福壽螺AChE的抑制作用具有濃度依賴性特點(diǎn)，濃度越大抑制作用越強(qiáng)，隨著濃度的降低，其抑制作用也減弱。

2.2 入侵植物乙醇提取物對(duì)福壽螺BChE活性的抑制效果

由表2可以看出，3種入侵植物乙醇提取物對(duì)福壽螺BChE活性均具有較強(qiáng)的抑制作用，五爪金龍和薇甘菊比南美蟛蜞菊的抑制作用強(qiáng)。同種植物不同部位的乙醇提取物對(duì)福壽螺BChE的抑制強(qiáng)度也不同，薇甘菊和南美蟛蜞菊的葉乙醇提取物均比莖乙醇提取物的抑制作用強(qiáng)，五爪金龍莖乙醇提取物的抑制作用比葉乙醇提取物強(qiáng)；在質(zhì)量濃度為0.100 0 mg/mL時(shí)，五爪金龍的莖和薇甘菊的葉乙醇提取物對(duì)福壽螺BChE的抑制作用最強(qiáng)，抑制率分別為（86.69±8.96）%和（82.86±7.19）%，接近陽(yáng)性對(duì)照組的抑制率（92.67±7.66）%，其后依次為薇甘菊的莖、五爪金龍的葉和南美蟛蜞菊的葉乙醇提取物，抑制率分別為（65.38±8.95）%、（59.47±8.33）%和（58.65±9.21）%，南美蟛蜞菊的莖乙醇提取物的抑制作用最小。同種植物同個(gè)部位的乙醇提取物對(duì)福壽螺BChE的抑制作用具有濃度依賴性特點(diǎn)，即濃度越大抑制作用越強(qiáng)，隨著濃度的降低，其抑制作用也減弱。

3 小結(jié)與討論

福壽螺的泛濫成災(zāi)給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和人類健康造成了極大的危害。目前對(duì)福壽螺的防治方法主要包括人工防治、化學(xué)防治、生態(tài)防治和生物防治。化學(xué)防治雖然是福壽螺防治的有效方法之一，但使用化學(xué)農(nóng)藥存在殺傷非靶標(biāo)生物的問(wèn)題，而且也不排除福壽螺抗藥性的產(chǎn)生，最終出現(xiàn)殺螺效果差而環(huán)境破壞大的嚴(yán)重惡果[15]。因此，尋找與環(huán)境友好的高效低毒的新型殺螺劑勢(shì)在必行。目前，植物源殺螺劑的研究成為生物防治的研究熱點(diǎn)之一，也是生物殺螺技術(shù)研究的重要內(nèi)容。迄今為止，大約有1 500種植物被用于殺螺活性試驗(yàn)，并已發(fā)現(xiàn)不少植物具有殺螺活性[16-18]。而利用入侵植物資源對(duì)福壽螺進(jìn)行治理，在有效控制目標(biāo)生物的同時(shí)，泛濫入侵的植物也將得到有效治理，這樣就能達(dá)到一舉兩得的效果。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，薇甘菊和五爪金龍兩種入侵植物乙醇提取液對(duì)福壽螺兩種膽堿酯酶都具有較強(qiáng)的抑制作用。在質(zhì)量濃度為0.100 0 mg/mL和0.050 0 mg/mL時(shí)，五爪金龍的莖乙醇提取液對(duì)福壽螺AChE具有較高的抑制作用，抑制率達(dá)（78.96±3.32）%和（63.99±4.22）%，對(duì)BChE的抑制率達(dá)（86.69±8.96）%和（80.32±6.66）%，接近陽(yáng)性對(duì)照組的抑制率。五爪金龍乙醇提取物具有直接殺螺作用，并且五爪金龍乙醇提取液對(duì)水稻苗的生長(zhǎng)沒(méi)有不利的影響[19，20]，因此，利用五爪金龍來(lái)防治福壽螺是一項(xiàng)環(huán)境友好型的非化學(xué)防治措施，具有良好的應(yīng)用前景。薇甘菊的葉乙醇提取物對(duì)福壽螺AChE和BChE也具有較高的抑制效果，在質(zhì)量濃度為0.100 0 mg/mL時(shí)，抑制率分別為（77.83±4.27）%和（82.86±7.19）%，也非常接近陽(yáng)性對(duì)照組的抑制率。薇甘菊是一種檢疫性雜草，嚴(yán)重影響生物多樣性及國(guó)土生態(tài)安全[21-23]。利用薇甘菊來(lái)防治福壽螺，基本上能達(dá)到以害治害的目的，具有較好的開(kāi)發(fā)福壽螺植物源殺螺劑的潛力。南美蟛蜞菊莖和葉乙醇提取物對(duì)福壽螺AChE和BChE的抑制效果相對(duì)較弱，在0.100 0 mg/mL的高濃度時(shí)，對(duì)福壽螺AChE和BChE的抑制率分別為（65.38±8.95）%和（56.54±5.38）%。

綜上所述，通過(guò)利用入侵植物乙醇提取物對(duì)福壽螺膽堿酯酶活性的抑制作用研究，表明五爪金龍和薇甘菊這兩種入侵植物在福壽螺防治方面具有開(kāi)發(fā)潛力。本試驗(yàn)對(duì)入侵植物進(jìn)行部位處理，但具體是植物中的哪些成分起抑制作用還需要進(jìn)一步研究。對(duì)這些入侵植物進(jìn)行進(jìn)一步系統(tǒng)深入的生物活性成分研究，包括對(duì)其進(jìn)行活性追蹤、活性成分分離與鑒定，從而研制出高效的植物抑螺劑，對(duì)福壽螺的防治具有重要的意義。

參考文獻(xiàn)：

[1] 向言詞，彭少麟，周厚誠(chéng)，等.生物入侵及其影響[J].生態(tài)科學(xué)，2001，20（4）：68-72.

[2] 廖周瑜，趙則海，侯玉平，等.五爪金龍對(duì)薇甘菊的化感效應(yīng)研究[J].生態(tài)環(huán)境，2007，16（3）：939-943.

[3] 宋莉英，彭長(zhǎng)連，彭少麟.華南地區(qū)3種入侵植物與本地植物葉片建成成本的比較[J].生物多樣性，2009，17（4）：378-384.

[4] 吳彥瓊，胡玉佳.外來(lái)植物南美蟛蜞菊、裂葉牽牛和五爪金龍的光合特性[J].生態(tài)學(xué)報(bào)，2004，24（10）：2334-2339.

[5] JOSHI R. Managing invasive alien molluse species in rice[J].International Rice Research Notes，2005，30（2）：5-12.

[6] COWIE R H. Apple Snails（Ampullariidae） as Agricultural pests： Their biology， Impacts and Management. In：Baker GM （ed） Molluscs as Crop Pests[M].Wallingford：CABI Publishing，2002.

[7] 郭 靖，章家恩.福壽螺入侵機(jī)制的研究進(jìn)展[J].生態(tài)學(xué)雜志，2014，33（3）：806-815.

[8] CASTRO-VAZQUEZ A，ALBRECHT E A，VEGA I A，et al. Pigmented corpuscles in the midgut gland of Pomacea canaliculata and other Neotropical apple-snails （Prosobranchia， Ampullariidae）：A possible symbiotic association[J]. Biocell，2002， 26（1）：101-109.

[9] 章家恩，方 麗.關(guān)于我國(guó)農(nóng)田福壽螺生物入侵需要加以研究的生態(tài)學(xué)問(wèn)題[J].中國(guó)生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2008，16（6）：1585-1589.

[10] ZOU X H，XIE H Q H，ZHA G C，et al. Characterizations of cholinesterases in golden apple snail （Pomacea canaliculata）[J].Journal of Molecular Neuroscience，2014，53（3）：424-428.

[11] 王志高，譚濟(jì)才，劉 軍，等.福壽螺綜合防治研究進(jìn)展[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2009，25（12）：201-205.

[12] DOMINGUES I，AGRA A R，MONAGHAN K A，et al. Cholinesterase and glutathione-S-transferase activities in freshwater invertebrates as biomarkers to assess pesticide contamination[J].Environ Toxicol Chem，2010，29（1）：5-18.

[13] MIAO Y Q，HE N Y，ZHU J J. History and new developments of assays for cholinesterase activity and inhibition[J].Chem Rev，2010，110（9）：5216-5234.

[14] ELLMAN G L，COURTNEY K D，ANDRES V， et al. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity[J].Biochemical Pharmacology，1961，7（2）：88-95.

[15] 陳曉娟，何忠全，高 平.10種植物提取物對(duì)稻田福壽螺的毒殺活性[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012，25（4）：1294-1297.

[16] 閆小紅，周 兵，蔣 平，等.16種植物提取物對(duì)福壽螺殺螺效果的研究[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，38（4）：81-84.

[17] BAPTISTA D F，VASCONCELLOS M C，LOPES F E，et al. Perspectives of using Euphorbia splendens as a molluscicide in schistosomiasis control programs[J].Southeast Asian Journal of Tropical Public Health，1994，25（3）：419-424.

[18] ALARD F，GEERTS S，TRIEST L，et al. Toxicity of the molluscicidal plant， Ambrosia maritima L.， to aquatic non-target organisms[J].Toxicon，1991，29（6）：745-750.

[19] 胡 飛，曾坤玉，張俊彥，等.五爪金龍乙醇提取物對(duì)福壽螺毒殺和水稻苗生長(zhǎng)的影響[J].生態(tài)學(xué)報(bào)，2009，29（10）：5471-5477.

[20] 曾坤玉，胡 飛，陳玉芬，等.四種與福壽螺（Ampullaria gigas）同源地入侵植物的殺螺效果[J].生態(tài)學(xué)報(bào)，2008，28（1）：260-266.

[21] 王瑞龍，陳 穎，張 暉，等.薇甘菊萎蔫病毒寄主范圍、傳播媒介和危害特點(diǎn)[J].生態(tài)學(xué)雜志，2013，32（1）：72-77.

[22] 全國(guó)明，章家恩，謝俊芳，等.薇甘菊入侵對(duì)中小型土壤動(dòng)物群落結(jié)構(gòu)特征的影響[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2011，22（7）：1863-1870.

[23] 李鳴光，魯爾貝，郭 強(qiáng)，等.入侵種薇甘菊防治措施及策略評(píng)估[J].生態(tài)學(xué)報(bào)，2012，32（10）：3240-3251.