灰綠曲霉對(duì)絞股藍(lán)皂苷的微生物轉(zhuǎn)化及其生物活性

陳良華,翁夢(mèng)婷,秦　江,沈瑞池,陳清西,明艷林,3*

(1.福建省亞熱帶植物研究所，福建省亞熱帶植物生理生化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建廈門(mén)361006;2.廈門(mén)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,福建廈門(mén)361102;3.廈門(mén)華僑亞熱帶植物引種園,福建廈門(mén)361002)

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灰綠曲霉對(duì)絞股藍(lán)皂苷的微生物轉(zhuǎn)化及其生物活性

陳良華1,翁夢(mèng)婷2,秦江2,沈瑞池1,陳清西2,明艷林1,3*

(1.福建省亞熱帶植物研究所，福建省亞熱帶植物生理生化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建廈門(mén)361006;2.廈門(mén)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,福建廈門(mén)361102;3.廈門(mén)華僑亞熱帶植物引種園,福建廈門(mén)361002)

以福建絞股藍(lán)[Gynostemmapentaphyllum(Thunb) Makino]為材料,經(jīng)乙醇提取和正丁醇萃取獲得絞股藍(lán)皂苷,利用灰綠曲霉(Aspergullusglaucus)微生物轉(zhuǎn)化絞股藍(lán)皂苷,通過(guò)測(cè)定絞股藍(lán)皂苷和灰綠曲霉轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的抗癌、抗酪氨酸酶和抗氧化活性,比較絞股藍(lán)皂苷經(jīng)微生物轉(zhuǎn)化修飾前后生物活性的差異.結(jié)果表明:灰綠曲霉轉(zhuǎn)化產(chǎn)物對(duì)肝癌細(xì)胞SMMC7721有體外抑制作用,半抑制質(zhì)量濃度(IC50)為91.66 μg/mL,而絞股藍(lán)皂苷抗癌效果不強(qiáng);絞股藍(lán)皂苷對(duì)蘑菇酪氨酸酶活力具有較強(qiáng)的抑制作用,IC50為0.14 mg/mL,其抑制作用屬于可逆抑制,抑制類(lèi)型為混合型抑制作用,而灰綠曲霉轉(zhuǎn)化產(chǎn)物抗蘑菇酪氨酸酶活性較弱;絞股藍(lán)皂苷和灰綠曲霉轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分別在0.2和2 mg/mL質(zhì)量濃度下對(duì)DNA氧化損傷有保護(hù)作用.研究結(jié)果說(shuō)明絞股藍(lán)皂苷經(jīng)微生物修飾后,抗癌效果增強(qiáng),對(duì)蘑菇酪氨酸酶抑制作用和DNA氧化損傷保護(hù)作用減弱.該研究結(jié)果可為利用微生物轉(zhuǎn)化法篩選抗癌絞股藍(lán)皂苷奠定基礎(chǔ).

福建絞股藍(lán);微生物轉(zhuǎn)化;酪氨酸酶抑制;抗肝癌;抗氧化

絞股藍(lán)[Gynostemmapentaphyllum(Thunb) Makino]為葫蘆科絞股藍(lán)屬植物.絞股藍(lán)全世界共有14個(gè)種2個(gè)變種,我國(guó)是絞股藍(lán)分布和分化中心[1].絞股藍(lán)的化學(xué)成分研究始于20世紀(jì)70年代,目前已分離到的主要絞股藍(lán)皂苷(gypenoside)已達(dá)到169種[2].絞股藍(lán)皂苷與人參皂苷具有達(dá)瑪烷型結(jié)構(gòu)的類(lèi)似的主骨架,屬于四環(huán)三萜皂苷,所以絞股藍(lán)皂苷的抗腫瘤[3]、降血脂血糖[4]、保肝護(hù)肝[5]和防止衰老[6]等藥理作用與人參皂苷相似.

微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)是天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)修飾和篩選新先導(dǎo)化合物的有效途徑.Ko等[7]利用來(lái)源于米曲霉(Aspergillusoryzae)的半乳糖苷酶和青霉菌(Penicilliumsp.)的乳糖酶粗酶液水解大量三醇型皂苷混合物產(chǎn)生皂苷Rg2和Rh1.利用微生物轉(zhuǎn)化修飾皂苷的側(cè)鏈基團(tuán),生成低毒高活性的新型三萜皂苷或苷元成為皂苷相關(guān)研究的熱點(diǎn),目前對(duì)人參皂苷[8]、三七皂苷[9]和甘草皂苷[10]等經(jīng)微生物轉(zhuǎn)化進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造取得較大進(jìn)展,但絞股藍(lán)皂苷微生物轉(zhuǎn)化研究報(bào)道甚少.樸香蘭等[11]研究表明保加利亞乳桿菌(Lactobacillusbulgaricus)對(duì)絞股藍(lán)提取物的微生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物比原絞股藍(lán)提取物具有更強(qiáng)的抑制非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞增殖的作用,說(shuō)明保加利亞乳桿菌能夠使絞股藍(lán)提取物成分發(fā)生轉(zhuǎn)化.本課題組前期研究報(bào)道[12]利用黑曲霉(A.niger)和構(gòu)巢曲霉(A.nidulans)兩種真菌對(duì)福建絞股藍(lán)皂苷進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)化產(chǎn)物對(duì)肝癌細(xì)胞SMMC7721和Bel7402增殖具有抑制作用.本研究采用灰綠曲霉(Aspergullusglaucus)對(duì)絞股藍(lán)皂苷進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化,測(cè)定灰綠曲霉轉(zhuǎn)化產(chǎn)物和原絞股藍(lán)皂苷的抗癌、抗酪氨酸酶和抗氧化等生物活性,比較絞股藍(lán)皂苷經(jīng)微生物轉(zhuǎn)化修飾后的活性變化情況,為絞股藍(lán)皂苷結(jié)構(gòu)修飾和應(yīng)用奠定基礎(chǔ).

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1材料和儀器

福建絞股藍(lán)于秋季采集自福建南靖產(chǎn)區(qū),灰綠曲霉為廈門(mén)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院龍敏南教授課題組惠贈(zèng).肝癌細(xì)胞SMMC7721購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所;新生牛血清購(gòu)自HyClone公司,蘑菇酪氨酸酶(mushroom tyrosinase)、L-多巴(L-DOPA)、胰蛋白酶和四甲基偶氮唑鹽(MTT)購(gòu)自Sigma公司,pBKS載體購(gòu)自上海生工生物工程有限公司;HP20大孔吸附樹(shù)脂購(gòu)自日本三菱化學(xué)株式會(huì)社;其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純,使用的蒸餾水為去離子重蒸水.

轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基:葡萄糖20 g/L,蛋白胨3 g/L,酵母膏3 g/L,磷酸氫二鉀8 g/L,氯化鈣5 g/L,吐溫80 2 mL,七水合硫酸鎂4 g/L,四水合硫酸錳3 g/L.

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀購(gòu)自Eyela公司,酶標(biāo)儀(MULTISKAN,MK3)和CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo公司,高效液相色譜(HPLC)購(gòu)自美國(guó)Agilent公司.

1.2方法

1.2.1絞股藍(lán)皂苷提取

絞股藍(lán)皂苷的提取參考文獻(xiàn)[13]方法：用高速粉碎機(jī)粉碎絞股藍(lán)樣品,稱(chēng)取50 g絞股藍(lán)研磨粉,以45%(體積分?jǐn)?shù),下同)乙醇為提取溶劑,溶劑用量為20倍量,在70 ℃水浴中加熱提取12 h;提取液過(guò)濾并減壓濃縮成浸膏狀,獲得絞股藍(lán)乙醇提取物;將浸膏用適量蒸餾水溶解成懸浮液,移置梨形分液漏斗中并用正丁醇萃取3次,萃取液減壓濃縮獲得絞股藍(lán)皂苷,制備的絞股藍(lán)皂苷作為灰綠曲霉微生物轉(zhuǎn)化底物.

1.2.2皂苷微生物轉(zhuǎn)化

經(jīng)馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)固體培養(yǎng)基培養(yǎng)活化的灰綠曲霉菌種,用接種環(huán)接入含有50 mL馬鈴薯液體培養(yǎng)基中,置于30 ℃、160 r/min搖床里培養(yǎng),培養(yǎng)至長(zhǎng)出真菌孢子,用于微生物轉(zhuǎn)化.

滅菌后的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基,接入2%(體積分?jǐn)?shù))活化培養(yǎng)的真菌孢子,在37 ℃、230 r/min控溫?fù)u床上培養(yǎng)48 h后,加入5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))絞股藍(lán)皂苷底物進(jìn)行轉(zhuǎn)化;繼續(xù)在37 ℃、230 r/min控溫?fù)u床上培養(yǎng)3 d后,菌液用8層紗布過(guò)濾取上清液,菌體再用100 mL水清洗3次,收集轉(zhuǎn)化菌液;過(guò)濾的菌液上樣于已預(yù)處理的HP20大孔吸附樹(shù)脂柱,蒸餾水沖洗后用95%乙醇溶液洗脫,洗脫液濃縮干燥獲得灰綠曲霉轉(zhuǎn)化產(chǎn)物.

1.2.3HPLC分析

色譜條件:色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C18(150 mm×4.6 mm)，柱溫25 ℃,檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm,流速1.0 mL/min;樣品用0.45 μm的濾膜過(guò)濾,進(jìn)樣量為20 μL;流動(dòng)相為水/乙腈,梯度洗脫條件為：0～8 min,20%(體積分?jǐn)?shù),下同)乙腈;8～20 min,20%～35%乙腈;20～35 min,35%～70%乙腈;35～40 min,70%乙腈;40～50 min,70%～100%乙腈;50～60 min,100%乙腈;60～70 min,100%～20%乙腈.

1.2.4對(duì)蘑菇酪氨酸酶二酚酶的活力測(cè)定及其動(dòng)力學(xué)研究

酶的活力測(cè)定及效應(yīng)物對(duì)酶活力抑制作用的研究參考文獻(xiàn)[14].在3 mL pH 6.8的測(cè)活體系中(含50 mmol/L磷酸鹽緩沖液(PBS),0.5 mmol/LL-DOPA底物),加入100 μL含不同濃度效應(yīng)物的二甲亞砜(DMSO)溶液,加入終質(zhì)量濃度為3.33 μg/mL的蘑菇酪氨酸酶.以DMSO為空白對(duì)照,測(cè)定波長(zhǎng)為475 nm處的吸光度(OD)隨時(shí)間的變化,從直線(xiàn)的斜率求得酶活力,按產(chǎn)物消光系數(shù)ε為3 700 L/(mol·cm)進(jìn)行計(jì)算.以酶的相對(duì)剩余活力對(duì)效應(yīng)物濃度作圖,求得效應(yīng)物的半抑制質(zhì)量濃度(IC50),改變加入的酶量和效應(yīng)物濃度,得到一組相對(duì)剩余活力隨酶量變化的相關(guān)曲線(xiàn),判斷效應(yīng)物對(duì)蘑菇酪氨酸酶二酚酶的抑制作用機(jī)理,改變底物和效應(yīng)物濃度,以L(fǎng)ineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖,判斷效應(yīng)物對(duì)蘑菇酪氨酸酶的抑制類(lèi)型,求出抑制常數(shù)KI和KIS.

1.2.5MTT法測(cè)定抗肝癌活性

將不同質(zhì)量濃度(0,6.25,12.5,25,50,75,100 μg/mL)的效應(yīng)物作用于肝癌細(xì)胞72 h后,MTT法測(cè)定效應(yīng)物對(duì)肝癌細(xì)胞增殖抑制作用.取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,0.25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))胰酶消化,按5×104mL-1的細(xì)胞濃度接種于96孔板中,每孔100 μL,置于CO2培養(yǎng)箱,37 ℃培養(yǎng)24 h后,吸去細(xì)胞培養(yǎng)液;分別加入100 μL的DMSO(對(duì)照組)和含效應(yīng)物的樣品液(給藥組),每組3個(gè)重復(fù),共培養(yǎng)72 h后吸去培養(yǎng)液;每孔加入200 μL 0.5 mg/mL MTT,再孵育4 h,吸去上清液,加入200 μL DMSO振蕩10 min,在酶標(biāo)儀上測(cè)量570 nm處OD.細(xì)胞抑制率=(OD對(duì)照組-OD給藥組)/(OD對(duì)照組-OD空白組)×100%.

1.2.6對(duì)DNA氧化性損傷的保護(hù)作用測(cè)定

在離心管中加入不同濃度的效應(yīng)物2 μL,再依次加入0.5 μL pBKS載體、3 μL PBS(pH 7.4,50 mmol/L)、3 μL 2 mmol/L FeSO4,最后再加入4 μL 30%(體積分?jǐn)?shù))H2O2.然后在37 ℃下孵育30 min,孵育后立即點(diǎn)樣電泳.0.8%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠以TAE電泳緩沖液(40 mmol/L Tris,20 mmol/L 乙酸鈉,2 mmol/L 乙二胺四乙酸(EDTA))配制,電泳1.5 h,1 μg/mL溴化吡啶染色30 min,于凝膠成像系統(tǒng)中觀(guān)察拍照.

2　結(jié)果與分析

2.1HPLC分析結(jié)果

圖1　絞股藍(lán)皂苷(a)和灰綠曲霉轉(zhuǎn)化產(chǎn)物(b)的HPLC譜圖Fig.1HPLC chromatography of gypenoside (a) and biotransformation products by A. glaucus (b)

利用HPLC對(duì)比分析絞股藍(lán)皂苷底物和灰綠曲霉轉(zhuǎn)化產(chǎn)物成分差異.對(duì)比圖1(a)和(b)可知：灰綠曲霉轉(zhuǎn)化產(chǎn)物比轉(zhuǎn)化前的絞股藍(lán)皂苷色譜峰數(shù)量增多,產(chǎn)生的色譜峰保留時(shí)間也較長(zhǎng),說(shuō)明經(jīng)灰綠曲霉轉(zhuǎn)化后產(chǎn)物中產(chǎn)生新的極性低的皂苷衍生物,轉(zhuǎn)化前后成分發(fā)生明顯變化.該結(jié)果表明灰綠曲霉對(duì)絞股藍(lán)皂苷具有很強(qiáng)的生物轉(zhuǎn)化能力,微生物利用自身分泌的豐富酶系修飾絞股藍(lán)皂苷側(cè)鏈結(jié)構(gòu)基團(tuán),將皂苷底物轉(zhuǎn)化生成豐富的次生代謝產(chǎn)物.

2.2對(duì)肝癌細(xì)胞SMMC7721體外抑制作用

利用MTT法測(cè)定不同質(zhì)量濃度的絞股藍(lán)皂苷和灰綠曲霉轉(zhuǎn)化產(chǎn)物作用72 h后,對(duì)肝癌細(xì)胞SMMC7721的體外抑制作用.從圖2可以看出：絞股藍(lán)皂苷對(duì)肝癌細(xì)胞SMMC7721的抑制作用很弱,在質(zhì)量濃度為100 μg/mL時(shí)對(duì)細(xì)胞的抑制率僅達(dá)14.89%；灰綠曲霉轉(zhuǎn)化產(chǎn)物對(duì)肝癌細(xì)胞SMMC7721有較強(qiáng)的體外抑制作用,且抑制作用具有濃度依賴(lài)性,隨質(zhì)量濃度增大抑制率增強(qiáng),IC50為91.66 μg/mL.這表明絞股藍(lán)皂苷經(jīng)灰綠曲霉轉(zhuǎn)化后,轉(zhuǎn)化產(chǎn)物對(duì)肝癌細(xì)胞SMMC7721具有更強(qiáng)的抑制作用,轉(zhuǎn)化后產(chǎn)生具有抗癌活性的皂苷衍生物.

圖2　效應(yīng)物對(duì)肝癌細(xì)胞SMMC7721的抑制作用Fig.2Inhibition effect of effector on the growth of hepatocellular carcinoma cells SMMC7721

2.3對(duì)蘑菇酪氨酸酶的抑制作用和作用機(jī)理

利用L-DOPA速率氧化法測(cè)定絞股藍(lán)皂苷和灰綠曲霉轉(zhuǎn)化產(chǎn)物對(duì)蘑菇酪氨酸酶的抑制作用.結(jié)果如圖3(a)和(b)所示：絞股藍(lán)皂苷在0～0.667 mg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對(duì)蘑菇酪氨酸酶二酚酶活性具有較強(qiáng)的抑制作用,其IC50為0.14 mg/mL,而在該質(zhì)量濃度范圍內(nèi)灰綠曲霉轉(zhuǎn)化產(chǎn)物對(duì)蘑菇酪氨酸酶二酚酶活性抑制較弱,最大質(zhì)量濃度下其抑制率不超過(guò)50%,絞股藍(lán)皂苷對(duì)蘑菇酪氨酸酶抑制活性強(qiáng)于灰綠曲霉轉(zhuǎn)化產(chǎn)物.該結(jié)果表明微生物修飾絞股藍(lán)皂苷側(cè)鏈糖基,修飾后皂苷糖基數(shù)量減少,影響皂苷與蘑菇酪氨酸酶結(jié)合,從而導(dǎo)致對(duì)蘑菇酪氨酸酶的抑制作用減弱.

(a)絞股藍(lán)皂苷;(b)灰綠曲霉轉(zhuǎn)化產(chǎn)物;(c)絞股藍(lán)皂苷對(duì)蘑菇酪氨酸酶二酚酶的抑制機(jī)理;(d)絞股藍(lán)皂苷對(duì)蘑菇酪氨酸酶二酚酶抑制類(lèi)型和抑制常數(shù)的測(cè)定；圖中直線(xiàn)1～4對(duì)應(yīng)的絞股藍(lán)皂苷質(zhì)量濃度分別為0,0.033,0.083,0.167 mg/mL.圖3　絞股藍(lán)皂苷對(duì)蘑菇酪氨酸酶的抑制作用和動(dòng)力學(xué)機(jī)理Fig.3The inhibitory effect and kinetic mechanism of gypenoside on mushroom tyrosinase

為探討絞股藍(lán)皂苷對(duì)蘑菇酪氨酸酶的抑制作用機(jī)理,固定酶底物L(fēng)-DOPA濃度,改變加入的蘑菇酪氨酸酶的酶量，測(cè)定在不同濃度的絞股藍(lán)皂苷下,對(duì)蘑菇酪氨酸酶催化L-DOPA氧化的活力.以酶活力對(duì)酶量作圖得到一組通過(guò)原點(diǎn)的直線(xiàn)如圖3(c)所示.隨著絞股藍(lán)皂苷濃度的增大,直線(xiàn)斜率降低,說(shuō)明絞股藍(lán)皂苷對(duì)蘑菇酪氨酸酶的抑制作用屬于可逆抑制.在測(cè)活體系中,固定加入的蘑菇酪氨酸酶的濃度,通過(guò)改變底物L(fēng)-DOPA的濃度,測(cè)定不同濃度的效應(yīng)物對(duì)蘑菇酪氨酸酶的催化活力的影響.以L(fǎng)ineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖,取1/v對(duì)1/ρS作圖,得到一組相交于第二象限的直線(xiàn)如圖3(d)所示,米氏常數(shù)(Km)隨效應(yīng)物濃度的增大而變大,酶促反應(yīng)的最大速度(Vm)則隨效應(yīng)物濃度的增大而下降,因此判定絞股藍(lán)皂苷對(duì)蘑菇酪氨酸酶的抑制類(lèi)型屬于混合型抑制.二次作圖以雙倒數(shù)的斜率(插圖(Ⅰ))和縱軸截距(插圖(Ⅱ))對(duì)效應(yīng)物濃度作圖,分別計(jì)算得出絞股藍(lán)皂苷對(duì)游離酶的抑制常數(shù)(KI)為0.192 mg/mL和對(duì)酶-底物絡(luò)合物的抑制常數(shù)(KIS)為0.364 mg/mL.KIS大于KI說(shuō)明其對(duì)酶-底物絡(luò)合物的緊密程度要高于對(duì)游離酶的結(jié)合程度.

2.4對(duì)DNA氧化性損傷的保護(hù)作用

以pBKS DNA作為DNA模板,利用H2O2在反應(yīng)體系中產(chǎn)生羥自由基等方式作用DNA鏈,檢測(cè)絞股藍(lán)皂苷和灰綠曲霉轉(zhuǎn)化產(chǎn)物對(duì)DNA氧化斷裂的保護(hù)作用.結(jié)果如圖4所示：未處理的pBKS DNA主要以超螺旋狀(如泳道5的下部條帶)和開(kāi)環(huán)狀(如泳道5的上部條帶)存在,經(jīng)氧化損傷后轉(zhuǎn)化為線(xiàn)狀(如泳道4的中部條帶)和開(kāi)環(huán)狀(如泳道4的上部條帶).加入抗氧化劑可以阻止或減少超螺旋的氧化斷裂,隨抗氧化劑濃度增大,超螺旋狀DNA逐漸增多,保護(hù)作用不斷增強(qiáng),抗氧化劑活性足夠強(qiáng)時(shí),可完全保護(hù)DNA損傷.絞股藍(lán)皂苷為0.2 mg/mL時(shí)對(duì)DNA氧化損傷表現(xiàn)出保護(hù)作用;為2 mg/mL時(shí)即可對(duì)DNA有明顯保護(hù)作用,超螺旋條帶明顯增加;為20 mg/mL時(shí)基本完全保護(hù)DNA氧化損傷.灰綠曲霉轉(zhuǎn)化產(chǎn)物為2 mg/mL時(shí)對(duì)DNA氧化損傷有保護(hù)作用，為20 mg/mL時(shí)基本完全保護(hù)DNA氧化損傷作用.這表明絞股藍(lán)皂苷和灰綠曲霉轉(zhuǎn)化產(chǎn)物對(duì)DNA氧化損傷有保護(hù)作用,但轉(zhuǎn)化底物絞股藍(lán)皂苷比灰綠曲霉轉(zhuǎn)化產(chǎn)物保護(hù)作用更強(qiáng).

圖4　絞股藍(lán)皂苷和灰綠曲霉轉(zhuǎn)化產(chǎn)物對(duì)H2O2誘導(dǎo)的pBKS DNA氧化損傷的保護(hù)作用Fig.4Protective effect of gypenoside and biotransformation products by A. glaucus against H2O2 induced pBKS DNA damage

3　討　論

藥代動(dòng)力學(xué)研究證明,苷類(lèi)成分在腸道內(nèi)難以吸收，生物利用度低，腸內(nèi)滯留時(shí)間較長(zhǎng),在人體內(nèi)難以直接發(fā)揮藥效,它們需通過(guò)腸內(nèi)微生物轉(zhuǎn)化或代謝為苷元發(fā)揮藥效.1992年Kobashi等[15]研究提出植物苷一般只起前體藥物的作用,只有當(dāng)植物皂苷經(jīng)過(guò)腸道細(xì)菌的去糖基化作用后,才最終代謝成為有活性的物質(zhì).

微生物轉(zhuǎn)化法能有效地改變?cè)碥盏奶擎溄Y(jié)構(gòu)，提高其生理活性.早期所用的微生物主要是腸道厭氧菌,但腸道厭氧菌培養(yǎng)條件苛刻、培養(yǎng)基成本高，目前多數(shù)采用藥食兼用真菌或從植物根系土壤獲取的共生菌.對(duì)含皂苷材料的微生物轉(zhuǎn)化研究主要以原材料的總皂苷或單體皂苷為轉(zhuǎn)化底物,轉(zhuǎn)化后原材料中低糖鏈皂苷含量提高,或者產(chǎn)生植物本身不含有的新皂苷,該領(lǐng)域研究最多的是人參皂苷.Chen等[16]用傘枝犁頭霉(Absidiacorymbifera)AS 3.3387轉(zhuǎn)化原人參二醇,得到5個(gè)代謝產(chǎn)物,其中7β-羥基-20(S)-人參三醇和7-氧-20(S)-人參三醇為新化合物,并顯示出對(duì)前列腺癌細(xì)胞DU-145和PC-3更強(qiáng)的抑制作用.Gao等[17]從土壤中分離到一株真菌P.oxalicumsp.68,能將原人參二醇皂苷轉(zhuǎn)化成系列活性代謝產(chǎn)物.從其發(fā)酵液中分離到β-葡萄糖苷酶,將人參皂苷Rbl、Rb2、Rc和Rd轉(zhuǎn)化為活性更高的人參皂苷化合物-K,Rbl轉(zhuǎn)化成化合物-K最高產(chǎn)量可達(dá)87.7%.本研究在前期稀有人參皂苷IH901酶法轉(zhuǎn)化[18]和絞股藍(lán)真菌轉(zhuǎn)化[12]研究基礎(chǔ)上,利用灰綠曲霉對(duì)絞股藍(lán)皂苷微生物轉(zhuǎn)化,探討轉(zhuǎn)化產(chǎn)物與原絞股藍(lán)皂苷生物活性變化情況,為絞股藍(lán)皂苷結(jié)構(gòu)改造從中篩選有效成分提供途徑.

灰綠曲霉與絞股藍(lán)皂苷共培養(yǎng)后,通過(guò)對(duì)比轉(zhuǎn)化前后HPLC譜圖，表明轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中產(chǎn)生與原絞股藍(lán)皂苷完全不同的次生代謝產(chǎn)物.利用微生物發(fā)酵法轉(zhuǎn)化含苷類(lèi)物質(zhì)的中藥是模仿人體腸道菌微生物轉(zhuǎn)化苷的過(guò)程.微生物降解苷類(lèi)物質(zhì)生成的糖可作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行自我繁殖,微生物以苷類(lèi)物質(zhì)的降解糖為碳源,誘導(dǎo)產(chǎn)生出用于分解該種苷類(lèi)的酶.微生物在發(fā)酵過(guò)程中可以分泌幾十種胞外酶,這些豐富而強(qiáng)大的酶系是使共培養(yǎng)的中藥發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ),分泌的酶系可將中藥成分分解轉(zhuǎn)化形成新成分.生物活性測(cè)定表明灰綠曲霉轉(zhuǎn)化產(chǎn)物比原絞股藍(lán)皂苷對(duì)肝癌細(xì)胞SMMC7721具有更強(qiáng)的抑制作用,但對(duì)蘑菇酪氨酸酶抑制作用和DNA氧化損傷保護(hù)作用比原絞股藍(lán)皂苷弱.皂苷的藥效作用與其側(cè)鏈糖基有直接關(guān)系,結(jié)構(gòu)中不同的側(cè)鏈糖基和糖基數(shù)量都有不同的藥理活性.一般來(lái)說(shuō)皂苷側(cè)鏈糖基少的低糖鏈皂苷及苷元比側(cè)鏈糖基多的細(xì)胞毒性活性強(qiáng)[19].綜上所述,灰綠曲霉對(duì)絞股藍(lán)皂苷微生物轉(zhuǎn)化,產(chǎn)生具有抗癌作用的有效成分.對(duì)絞股藍(lán)皂苷的微生物轉(zhuǎn)化條件如樣品加入量、發(fā)酵時(shí)間、pH值和溫度等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,從而提高轉(zhuǎn)化效率和產(chǎn)物產(chǎn)量;對(duì)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物活性物質(zhì)跟蹤分離純化,明確轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu),以及對(duì)絞股藍(lán)皂苷轉(zhuǎn)化途徑研究是今后的研究方向.

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Microbial Transformation of Gypenoside from Gynostemma pentaphyllum by Aspergullus glaucus and Its Biological Activities

CHEN Lianghua1,WENG Mengting2,QIN Jiang2,SHEN Ruichi1,CHEN Qingxi2,MING Yanlin1,3*

(1.Key Laboratory of Fujian Province for Physiology and Biochemistry of Subtropical Plant,Fujian Institute of Subtropical Botany,Xiamen 361006,China;2.School of Life Sciences,Xiamen University,Xiamen 361102,China;3.Xiamen Overseas Chinese Subtropical Plant Introduction Garden,Xiamen 361002,China)

Gynostemmapentaphyllumin Fujian Province was used as the material in this research.Gypenoside was extracted with ethanol andn-butyl alcohol.Gypenoside was microbially transformed byAspergullusglaucus.The abilities of anticancer,anti-tyrosinase and anti-oxidation in gypenoside and transformation products were measured in our study.The difference of bioactivity between gypenoside and microbially transformed gypenoside was compared.The result showed that the products of transformation byA.glaucusaffected the growth of hepatocellular carcinoma cells SMMC7721 with half maximal inhibitory concentration (IC50) values of 91.66 μg/mL,but the anticancer activity of gypenoside was very weak.Gypenoside had strong inhibition to the mushroom tyrosinase.The value ofIC50was 0.14 mg/mL.Moreover,the products of transformation byA.glaucusshowed little anti-tyrosinase acti-vity.The kinesis study showed that the inhibition of gypenoside to mushroom tyrosinase was reversible and inhibition types were mixed.Gypenoside exhibited the active protective effect on H2O2-induced oxidative-stress damage at the concentration of 0.2 mg/mL,and the products of transformation byA.glaucuswere at 2 mg/mL.This research indicated that the anticancer effect of gypenoside modified by microorganisms was enhanced,but the activity of anti-tyrosinase and H2O2-induced oxidative-stress damage became weakened.This study laid the foundation of screening anticancer gypenoside by means of microbial transformation.

FujianGynostemmapentaphyllum;microbial transformation;tyrosinase inhibition;anticancer;antioxidant

10.6043/j.issn.0438-0479.201603017農(nóng)業(yè)生產(chǎn)專(zhuān)題

2016-03-08錄用日期：2016-06-02

國(guó)家自然科學(xué)基金(81274149);廈門(mén)市科技創(chuàng)新項(xiàng)目(3502Z20132009,3502Z20154083);廈門(mén)市對(duì)臺(tái)科技合作項(xiàng)目(3502Z20141041)

xmyanlin@gmail.com

陳良華,翁夢(mèng)婷,秦江，等.灰綠曲霉對(duì)絞股藍(lán)皂苷的微生物轉(zhuǎn)化及其生物活性[J].廈門(mén)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2016,55(5)：775-780.

CHEN L H,WENG M T,QIN J,et al．Microbial transformation of gypenoside fromGynostemmapentaphyllumbyAspergullusglaucusand its biological activities[J].Journal of Xiamen University(Natural Science)，2016,55(5)：775-780．(in Chinese)

Q 356.1

A

0438-0479(2016)05-0775-06