張維誼,王曉旭,寧 昆,徐 鋒,沈莉萍
(上海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,上海 201103)
豬源豬鏈球菌耐藥情況分析
張維誼,王曉旭,寧 昆,徐 鋒,沈莉萍
(上海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,上海 201103)
近年來,為掌握上海地區(qū)豬源豬鏈球菌的耐藥情況及耐藥規(guī)律,文章對(duì)2013~2015年畜禽門診、養(yǎng)殖場、屠宰場分離到的59株豬鏈球菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。結(jié)合CLSI及獸醫(yī)臨床標(biāo)準(zhǔn),選用8種抗生素,采用微量肉湯稀釋法(MIC)進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)。結(jié)果表明,豬鏈球菌對(duì)8種抗生素均產(chǎn)生不同程度的耐藥性,且耐藥程度很高在44%~95%之間,四環(huán)素耐藥率最高為95%,敏感率40%以上的有4種抗生素。部分藥物在臨床上,已經(jīng)成為嚴(yán)重的耐藥,豬鏈球菌耐藥情況,呈逐年加重的趨勢(shì)。
豬鏈球菌 藥敏試驗(yàn) 耐藥性 MIC
抗生素是一類對(duì)細(xì)菌、寄生蟲等具有抑制和殺滅作用的藥物,在畜牧飼料行業(yè)中已得到廣泛應(yīng)用,在動(dòng)物疫病防治、提高飼料轉(zhuǎn)化效率、促進(jìn)畜禽生長方面發(fā)揮了重要作用。我國由于養(yǎng)殖密度大,畜禽疫病復(fù)雜多樣,且監(jiān)管不力等多種原因,抗生素濫用現(xiàn)象較為嚴(yán)重,伴隨而來的耐藥問題越來越嚴(yán)重,給養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展埋下了隱患。
豬鏈球菌病是養(yǎng)殖業(yè)中最為常見的一種細(xì)菌性疾病。在實(shí)際養(yǎng)殖過程中,由于畜主對(duì)藥物的濫用,使得許多常用抗菌藥物出現(xiàn)了效果下降,甚至無效,給畜禽養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]。與此同時(shí),動(dòng)物養(yǎng)殖過程中,濫用抗生素所帶來的影響,最終還是會(huì)通過各種途徑“轉(zhuǎn)嫁”到人身上,加劇抗生素耐藥性問題,影響著人類的健康。因此,對(duì)豬源豬鏈球菌進(jìn)行耐藥性監(jiān)測,掌握豬鏈球菌耐藥規(guī)律及變化情況,對(duì)指導(dǎo)臨床合理用藥,減少養(yǎng)殖戶經(jīng)濟(jì)損失具有重要意義。
該研究對(duì)近年來上海地區(qū)的豬源豬鏈球菌進(jìn)行了細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定,并對(duì)分離株進(jìn)行了微量肉湯稀釋法藥物敏感試驗(yàn),研究了豬鏈球菌在上海地區(qū)的耐藥情況,為指導(dǎo)養(yǎng)殖戶臨床合理用藥提供參考。
1.1 樣本及標(biāo)準(zhǔn)株
2013~2015年,來自上海地區(qū)養(yǎng)殖場鼻棉拭子、屠宰場扁桃體樣本和上海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心畜禽門診接收的發(fā)病畜禽病料(心、肝、脾、肺和腎臟)。豬鏈球菌藥敏實(shí)驗(yàn)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)株ATCC43300購買自中國獸藥監(jiān)察所。
1.2 主要試劑與儀器
革蘭氏染色液購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司;Columbia血瓊脂基礎(chǔ)購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司;無菌羊血購自上海閔行區(qū)諸翟無菌動(dòng)物血試劑供應(yīng)站;革蘭氏陽性細(xì)菌鑒定卡(GP)購自法國梅里埃公司;豬鏈球菌藥敏板(含8種抗菌藥物)由天津金章科技發(fā)展有限公司訂制;引物由上海桑尼生物科技有限公司合成;Premix購自TaKaRa公司,還有全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)(VITEK2-Compact)和普通PCR儀(BioRad PTC-200)。
2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)
按要求將樣本涂抹接種于Columbia血平板(加入1μL/mL過濾除菌的NAD和5%~10%脫纖維綿羊血),在5%CO2培養(yǎng)箱中經(jīng)36℃培養(yǎng)24~48 h,對(duì)可疑菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。挑取單個(gè)菌落,接種于Columbia血平板進(jìn)行純培養(yǎng),觀察菌落特征及染色特點(diǎn)。
2.2 細(xì)菌鑒定
參照文獻(xiàn)[2]合成豬鏈球菌的引物,PCR反應(yīng)體系為25μl:premix 12.5μl、引物各0.5μl、ddH2O 8.5μl、模板2μl。反應(yīng)條件為:94℃預(yù)熱5 min、94℃30 s、56℃30 s、72℃1 min,擴(kuò)增30個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。
2.3 藥敏試驗(yàn)
2.3.1 菌液制備
用滅菌棉簽取適量待測菌,懸浮于3 ml 0.45%NaC溶液中,用比濁儀調(diào)整細(xì)菌的濃度,使其麥?zhǔn)蠁挝贿_(dá)到0.48~0.52。同時(shí),用ATCC43300作為試驗(yàn)質(zhì)控菌株。
2.3.2 菌液接種
首先從12 ml肉湯管中,吸取100μl加到空白對(duì)照孔,然后吸取待測菌液100μl到剩余的12 mL肉湯管中,混勻,加100μl到其余各孔。質(zhì)控菌株操作同待測菌。
2.3.3 孵育
將藥敏板置于墊有濕紗布的瓷方盤內(nèi),36℃溫箱孵育16~18 h。
2.3.4 結(jié)果判定
在襯有黑底板的光線下觀察,無細(xì)菌生長的孔內(nèi)所含最低抗菌藥物濃度,即為最低抑菌濃度(MIC)。結(jié)果判定及質(zhì)量控制參照CLSI標(biāo)準(zhǔn)。
3.1 耐藥率
豬鏈球菌的耐藥性 59株豬鏈球菌,對(duì)8種抗生素的藥敏試驗(yàn)結(jié)果見表1。
3.2 多重耐藥性和耐藥譜
根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果,對(duì)豬鏈球菌試驗(yàn)菌株多重耐藥性進(jìn)行分析,獲得其耐藥譜(表2)和耐藥譜型(表3),共有耐藥譜型25種。
表1 59株豬鏈球菌MIC藥敏試驗(yàn)結(jié)果
表2 59株豬鏈球菌耐藥譜
表3 豬鏈球菌耐藥譜型
3.3 豬鏈球菌耐藥趨勢(shì)
選擇8種抗生素,對(duì)豬鏈球菌的耐藥趨勢(shì)進(jìn)行分析(圖1)。
由59株細(xì)菌的耐藥率分析,豬鏈球菌對(duì)8種抗生素均產(chǎn)生不同程度的耐藥性,耐藥率在44%~95%之間,耐藥率80%以上的藥物有2種,四環(huán)素耐藥率將近95%,其余6種均在50%左右,耐藥率達(dá)54.24%。敏感率40%以上的有4種抗生素,最高的僅為44.07%,頭孢噻呋作為第3代動(dòng)物專用頭孢菌素,耐藥率已達(dá)到54%以上,說明豬源豬鏈球菌的耐藥情況嚴(yán)重。
耐藥譜分析顯示,1耐到8耐的菌株都有,最少的為3耐和4耐,其次為1耐和7耐,8耐的菌株數(shù)最多,達(dá)20%以上,僅1株菌株沒有產(chǎn)生耐藥性。該研究共出現(xiàn)耐藥譜型25種,譜型較多,說明豬鏈球菌的耐藥情況較為復(fù)雜,濫用抗生素較為嚴(yán)重,提示在臨床應(yīng)加強(qiáng)藥物的合理使用和指導(dǎo)。
四環(huán)素和紅霉素的耐藥率一直居高不下,其余6種抗生素的耐藥率從2013年至2015年均有增加,環(huán)丙沙星、氧氟沙星呈逐步升高趨勢(shì)。頭孢噻呋的耐藥率從2013年的25%到2014年以來的60%,增加幅度最大。2013年,耐藥率在25%有5種抗生素,到2015年,均在44%以上。
抗生素在防治畜禽疾病方面發(fā)揮了較大作用,但伴隨而來的耐藥問題及公共衛(wèi)生問題也日益嚴(yán)重。加強(qiáng)對(duì)細(xì)菌耐藥性的監(jiān)測、管理和技術(shù)支持,對(duì)細(xì)菌耐藥性的控制,具有重要意義。
首先是監(jiān)測方面。應(yīng)建立健全監(jiān)測網(wǎng)絡(luò),提高監(jiān)測水平和監(jiān)測質(zhì)量,保證及時(shí)、完整、準(zhǔn)確地獲得我國細(xì)菌耐藥性數(shù)據(jù),用監(jiān)測結(jié)果指導(dǎo)養(yǎng)殖戶,更加科學(xué)合理的使用抗生素[3]。
圖1 59株2013~2015年豬鏈球菌不同藥物耐藥率
其次是管理方面。要控制和管理制藥企業(yè)在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中的不合理銷售及競爭行為,并對(duì)基層獸醫(yī)從業(yè)人員進(jìn)行有效監(jiān)管,加強(qiáng)教育培訓(xùn)工作,提高理論知識(shí),防止抗生素濫用、亂用現(xiàn)象的發(fā)生。
最后是技術(shù)層面。臨床上可以使用一些中草藥,用來減少抗生素的使用。例如,金銀花對(duì)耐青霉素的金黃色葡萄球菌有增敏作用,在低于抗菌濃度時(shí),還能增強(qiáng)白細(xì)胞的吞噬能力,對(duì)青霉素抗菌有增效作用;葛根芪連湯與氨芐青霉素、頭孢哌酮、諾氟沙星配用均有協(xié)同作用。同時(shí),也可以探索新的抗菌治療方法,如抗生素的輪流替用和聯(lián)合用藥,以應(yīng)對(duì)細(xì)菌耐藥性問題。
[1] 江飆,董嘉文,張獻(xiàn)杰,等.廣東地區(qū)動(dòng)物源性大腸桿菌的分離及藥敏分析.中國獸藥雜志,2009,43(1):14~16
[2] 李小軍.上海地區(qū)豬鏈球菌致病性血清型及其毒力因子的流行病學(xué)調(diào)查.南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2007
[3] 劉海林,武新國.大腸桿菌的藥敏試驗(yàn)報(bào)告.當(dāng)代畜牧,2014,(11):70~71