基于量子點標記的適配體技術(shù)在分析檢測中的研究進展

李夢華， 褚先鋒， 豆小文， 楊美華*， 孔維軍， 歐陽臻

(1.江蘇大學藥學院，江蘇鎮(zhèn)江 212013；2.中國醫(yī)學科學院，中國協(xié)和醫(yī)科大學，藥用植物研究所 北京 100193)

1 前言

量子點(Quantum Dots,QDs)，又稱半導體納米粒子(Semi-conductor Nanoparticles)，是由Ⅱ-Ⅵ族元素或Ⅲ-Ⅴ族元素組成，且三個維度尺寸都小于100 nm的納米微晶體。由于其直徑小于或接近激子波爾半徑而表現(xiàn)出獨特的物理性質(zhì)，如量子尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)、宏觀量子隧道效應(yīng)等。自Alivisatos小組[1]和Nie小組[2]解決了量子點生物相容性的難題以來，量子點以顏色豐富、光化學性質(zhì)穩(wěn)定、抗漂白能力強等優(yōu)勢備受關(guān)注，并逐步應(yīng)用于重金屬[3,4]、真菌毒素[5]、農(nóng)藥[6 - 8]及其他小分子污染物的痕量分析。

適配體(Aptamer)是經(jīng)指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化技術(shù)(SELEX)體外篩選而獲得[9]，且能與靶物質(zhì)特異并緊密結(jié)合的一小段RNA或DNA單鏈寡核苷酸序列[10]。適配體與靶物質(zhì)之間的識別、結(jié)合原理與抗體相似，有著“化學抗體”的美譽，但適配體在很多性能方面都超越了抗體，如穩(wěn)定性強、易于功能化修飾與標記、設(shè)計簡單及成本低等。因此，適配體被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)研究[11]、藥物分析[12,13]、病毒檢測[14,15]等領(lǐng)域。

適配體特異性識別靶物質(zhì)后，本身并不具有將識別信息轉(zhuǎn)換為可檢測信號的能力，而熒光物質(zhì)可作為標記物與適配體相結(jié)合，將信息轉(zhuǎn)換為可檢測信號。傳統(tǒng)的熒光染料在檢測過程中表現(xiàn)出易淬滅、瞬時即逝等缺點，量子點以獨特的優(yōu)勢[16 - 19](表1)彌補了傳統(tǒng)熒光染料帶來的不足，提高了分析檢測的靈敏度，并實現(xiàn)了多組分的同時檢測。因此，將量子點的光學特異性與適配體特異性識別技術(shù)相結(jié)合，提供了高效、簡便、快速、靈敏、高通量的分析檢測平臺。本文介紹了量子點的合成方法及其與適配體的偶聯(lián)，綜述了近幾年基于量子點標記的適配體技術(shù)在生物分子、病原微生物、細胞、生物毒素方面的應(yīng)用，總結(jié)了該技術(shù)在應(yīng)用方面存在的問題，并提出該技術(shù)面臨的挑戰(zhàn)，以期新技術(shù)在復雜基質(zhì)樣品檢測中發(fā)揮巨大的潛力。

表1 量子點與有機熒光染料特性比較[16 - 19]

2 量子點的合成

目前，研究較多的量子點有Ⅱ-Ⅵ族(CdS、CdSe、CdTe、ZnSe等)和Ⅲ-Ⅴ族(CaAs、InAs等)，其中Cd系量子點是最具有特色的量子點體系之一。量子點的合成方法有很多，根據(jù)合成所用溶劑的不同，一般可將量子點的合成分為有機相合成法和水相合成法。

2.1 有機相合成法

有機相合成法是基于有機物與金屬化合物之間的反應(yīng)而進行的。傳統(tǒng)方法使用的前驅(qū)體，如二甲基鎘(Cd(CH3)2))大多具有毒性高，危險性高，且價格昂貴等缺點。Peng 等[20]對傳統(tǒng)有機合成方法進行了優(yōu)化，以CdO作為前驅(qū)體代替Cd(CH3)2，一步合成了高熒光產(chǎn)率的CdS、CdTe、CdTe量子點，使量子點的合成安全化，并大大縮短了反應(yīng)時間。

隨著量子點合成方法的改進，價格低廉、綠色環(huán)保的試劑逐漸代替配位化合物三辛基氧化膦(Trioctylphosphine Oxide,TOPO)、三辛基膦(Trioctylphosphine,TOP)等有毒試劑。Deng等[21]采用液體石蠟和油酸分別作為溶劑和配體，合成出了高質(zhì)量單分散的CdSe半導體量子點，熒光量子產(chǎn)率達60%。與TOPO及TOP相比，液體石蠟和橄欖油價格更低，降低了實驗成本，使大規(guī)模合成CdSe量子點成為可能。

含鎘量子點毒性大且造成了嚴重的環(huán)境污染，歐盟已禁止工業(yè)產(chǎn)品中Cd類重金屬元素的存在，因此非鎘量子點成為近年人們研究的熱點。過渡金屬摻雜型量子點是常見非鎘量子點類型之一，與經(jīng)典的Cd系量子點相比具有抗環(huán)境干擾能力強、光化學性穩(wěn)定、可抑制熒光自淬滅等優(yōu)點。Zhang等[22]在有機溶劑中合成Cu摻雜Zn-In-S量子點，并包裹ZnSe外殼形成Cu∶Zn-In-S/ZnS量子點。該量子點發(fā)射波長覆蓋了藍色波段到近紅外波段(450～810 nm)，熒光量子產(chǎn)率可高達85%，并且可通過配體交換轉(zhuǎn)為水溶性量子點，而拓寬了應(yīng)用范圍。這種近紅外摻雜量子點將會是以后研究的重點，有望取代某些含鎘量子點。

隨著熒光標記和檢測技術(shù)的發(fā)展，低毒或無毒性的近紅外量子點發(fā)揮巨大潛力。近年來，近紅外Ⅱ區(qū)量子點成為活體成像的理想熒光探針，Zhu等[23]在有機相中合成Ag2Se量子點，其發(fā)射熒光在1 080～1 330 nm范圍，熒光產(chǎn)率為9.58%，且量子點通過配體交換由油相轉(zhuǎn)為水相仍保持3.33%的量子產(chǎn)率，可應(yīng)用于生物成像的實際應(yīng)用。Li等[24]在有機相中合成Ag2S量子點，平均粒徑為5.6 nm，以聚乙二醇(PEG)包裹形成聚乙二醇化Ag2S量子點，該量子點(0.1 mg·mL-1)組織穿透深度大于1.1 cm，更利于深層組織活體成像。

有機相制備的量子點具有優(yōu)良的光譜性能、尺寸均一、單分散性好、粒度可調(diào)的特點且技術(shù)比較成熟，但該類量子點不溶于水，必須對其表面進行親水轉(zhuǎn)相處理才能用于實際樣品的分析檢測中。

2.2 水相合成法

水相合成法具有操作簡單易行，成本較低等特點，常用巰基乙酸、巰基丙酸等作為穩(wěn)定劑來制備，所得量子點可直接應(yīng)用于樣品的分析檢測[25,26]。

近年來，水溶液合成量子點的方法得到逐步改進，Hodlur等[27]研究了用性質(zhì)穩(wěn)定、可溶于水的二氧化硒代替了硒粉和其它有害前驅(qū)體，合成了三種CdSe量子點，量子產(chǎn)率最高為24%。這種合成方法符合“綠色”合成路線，但是制備的量子點表面存在大量缺陷，嚴重影響量子點的發(fā)光性質(zhì)、熒光量子產(chǎn)率，因此一般在水相量子點表面包被一層無機材料殼結(jié)構(gòu)形成核殼型量子點而使其表面鈍化，減少激發(fā)缺陷。Wang等[28]通過微波法在水相中合成了CdTe/CdS/ZnS核-殼-殼量子點，具有良好的分散性和生物相容性，并且發(fā)射光譜可覆蓋近紅外區(qū)間(700～800 nm)。另外，多元近紅外量子點如CuInS2[29,30]、AgInS2[31]、ZnIn2S4[32]等也逐漸應(yīng)用于生物分析檢測中。

水相合成法所得的量子點相對有一些不足，量子產(chǎn)率較低、熒光強度較弱、穩(wěn)定性較差等，通常需要用水熱法、微波輔助法來改善。目前，工作者已進行了大量研究使水相合成法得到快速發(fā)展，具有更大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

3 量子點的表面修飾及其與適配體的偶聯(lián)

3.1 量子點的表面修飾

有機相中合成的量子點表面多包覆著TOPO、TOP等疏水有機配體，無法直接在水溶液環(huán)境中實現(xiàn)樣品的檢測。表面修飾是改善該類量子點生物相容性、擴大其應(yīng)用范圍的有效手段。常用修飾方法主要有三種：第一，表面配體交換法，利用巰基乙酸[33]、巰基丙酸[34]、半胱氨酸[35]、谷胱甘肽[36]等含水溶性基團的有機配體取代量子點表面原有配體。這些有機配體屬于雙功能分子，一端帶有的巰基與量子點表面的金屬離子發(fā)生配位作用，另一端的羧基、羥基等基團可提高量子點的水溶性且能夠起到與適配體相偶聯(lián)的作用。此方法相對簡單，但容易導致量子點的量子產(chǎn)率下降及熒光減弱。第二，二氧化硅/硅氧烷包覆法[37]，首先在量子點的表面包覆一層親水性的無機物，然后修飾官能團，使量子點具有水溶性而與生物分子連接。Ma等[38]在水相中合成CdTe/CdS核殼量子點，然后利用“St?ber”法在量子點表面形成二氧化硅殼層(圖1)，修飾后的量子點的平均粒徑小于5 nm，相比于最初的CdTe/CdS量子點展現(xiàn)出現(xiàn)更高的發(fā)光效率，同時降低了量子點毒性且改善了生物相容性。第三，兩親性聚合物法，利用聚合物的疏水側(cè)鏈與量子點表面烷基鏈相互作用形成一層穩(wěn)定的聚合膜，不僅可以進行生物分子共價連接，而且可以防止量子點受到外界環(huán)境的破壞。Speranskaya等[39]以馬來酸酐兩親性聚合物修飾量子點，修飾后的量子點可保持90%的熒光且可更易于與蛋白的結(jié)合。Schmidtke等[40]合成聚酰亞胺-b-聚乙二醇(PI-b-PEG)嵌段共聚物修飾量子點，降低了細胞毒性。

3.2 量子點與適配體的偶聯(lián)

圖1 二氧化硅包覆量子點的合成示意圖[38]Fig.1 Schematic illustration for the synthesis of silica-coated QDs[38]

納米材料與核酸分子的偶聯(lián)方法分為共價偶聯(lián)與非共價偶聯(lián)。共價偶聯(lián)是通過化學鍵合的作用將適配體連接在量子點的表面。例如，Savla等[41]在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的催化下將標有羧基的量子點與標有氨基的適配體偶聯(lián)，成功將適配體連接在量子點表面。非共價偶聯(lián)是一種基于生物分子間特異性作用的生物偶聯(lián)法，Zhang等[42]利用生物素與親和素之間的特異性作用將量子點與適配體偶聯(lián)形成用于小鼠肝癌細胞成像的探針，證明該方法具有很高的結(jié)合效率。

4 基于量子點標記的適配體技術(shù)在分析檢測中的應(yīng)用

4.1 生物分子檢測

4.1.1蛋白質(zhì)生物大分子蛋白質(zhì)是生命活動的主要載體，也是生物功能的主要執(zhí)行者。蛋白質(zhì)的檢測及其技術(shù)的發(fā)展對人類生命科學研究、人體健康評價等具有重大意義。蛋白質(zhì)檢測的最主要方法之一是標記分析法。Levy等[43]基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)原理，首次將量子點標記的適配體傳感器用于凝血酶的檢測。無靶物質(zhì)時，量子點與猝滅基團距離靠近，熒光被淬滅。靶物質(zhì)存在時，凝血酶與適配體形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，使帶有淬滅物質(zhì)的核苷酸序列脫離，量子點熒光增強，從而達到檢測凝血酶的目的。

圖2 基于量子點標記的適配體檢測凝血酶示意圖[44]Fig.2 Schematic representation of thrombin detection based on quantum dots labeled aptamer[44]

目前，蛋白質(zhì)檢測中研究比較多的是將量子點標記技術(shù)與熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)技術(shù)結(jié)合。FRET是一種基于供體和受體之間的非輻射能量轉(zhuǎn)移的能量轉(zhuǎn)移方式。基于量子點標記的FRET體系中，供體-受體對需要滿足的條件包括：(1)供體基團的發(fā)射光譜與受體基團的吸收光譜必須有有效重疊；(2)供體基團與受體基團之間的距離必須小于10 nm；(3)供體基團的發(fā)射光譜與受體基團的發(fā)射光譜不重疊或重疊很小。Chi等[44]建立了一種新型量子點-適配體探針檢測凝血酶。將染料BOBO-3嵌入發(fā)夾結(jié)構(gòu)的適配體并將其偶聯(lián)到量子點上。量子點作為供體，BOBO-3為受體而組成FRET體系。當加入凝血酶時，適配體發(fā)生構(gòu)象改變，由發(fā)夾構(gòu)象轉(zhuǎn)變?yōu)樗木垠w構(gòu)象，使BOBO-3脫離適配體探針，從而根據(jù)BOBO-3熒光強度下降程度而對凝血酶定量分析(圖2)。

另外，電致化學發(fā)光(ECL)傳感器也被廣泛應(yīng)用于生物分子的檢測。Li等[45]建立CdSe量子點標記的電化學適配體傳感器(ECL-Aptamer-Sensor)檢測凝血酶，熒光強度與凝血酶濃度在0～64 μg·mL-1范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.9986。實驗證明該法檢測凝血酶具有良好的特異性、穩(wěn)定性和重復性。

4.1.2三磷酸腺苷(ATP) 最常見的ATP分析方法是熒光分析法和生物發(fā)光法，但由于抗體和生物發(fā)光試劑穩(wěn)定性差、成本高、制備困難等缺點限制了應(yīng)用范圍[46]，量子點標記適配體技術(shù)的發(fā)展，為ATP的檢測提供了有效方法。Liu等[47]基于化學發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移(CRET)設(shè)計了量子點-適配體傳感器，通過氯化血紅素/G-四鏈體脫氧核酶催化引起化學發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移，從而根據(jù)QDs產(chǎn)生的CRET熒光信號實現(xiàn)對ATP的檢測，檢測限為10 μmol·L-1。該方法檢測ATP降低了背景信號并且使多通道檢測成為可能。相比于FRET，CRET不需要外來的激發(fā)光源并且以量子點作為受體，從而最大限度的降低了光漂白效應(yīng)以及樣品的自熒光干擾，降低了檢測限，提高了靈敏度。

4.2 病原微生物檢測

病原微生物是一類可引起人類和動植物各種疾病的微生物，包括細菌、病毒等[48]。這些微生物具有種類繁多、遺傳變異快等特點，傳統(tǒng)的檢測方法操作復雜、檢測周期長并且需要專業(yè)的操作人員。近年來，量子點標記的適配體技術(shù)以其操作簡單、靈敏度高等優(yōu)勢在病原微生物快速檢測領(lǐng)域脫穎而出。

圖3 基于量子點標記的適配體檢測細菌示意圖[51]Fig.3 Schematic representation of bacteria detection based on quantum dots labeled aptamer[51]

4.2.1細菌傳統(tǒng)檢測細菌的方法步驟比較繁瑣，分為以下幾步：首先將標本進行培養(yǎng)、分純，配制成一定濁度的細菌濃度，然后進行生化反應(yīng)，最后進行細菌鑒定[49]。該方法操作復雜、漏檢率較高、費時耗力且不能同時檢測多種細菌。Jiang等[50]基于FRET構(gòu)建了檢測雙歧桿菌特異性16S rDNA的新方法，以羧基修飾的量子點為供體，有機染料6-羧基羅丹明(ROX)為受體，根據(jù)量子點與ROX的熒光強度的變化來實現(xiàn)對雙歧桿菌的檢測。Duan等[51]以量子點為熒光標記物，適配體為識別元件選擇性捕獲目標細菌，并利用流式細胞術(shù)構(gòu)建了一種特異性的、靈敏的同時檢測兩種食源性致病菌的方法(圖3)，結(jié)果顯示副溶血性弧菌和沙門氏菌的檢測限都為5×103cfu·mL-1，此方法為量子點標記的適配體技術(shù)在流式細胞儀上的應(yīng)用開辟了道路。

4.2.2病毒目前，文獻報道的病毒快速檢測方法并不多。Roh等[52]用羧基修飾的量子點標記5′端為氨基的RNA核苷酸適配體作為熒光探針，在芯片上實現(xiàn)對目標物肝炎C病毒的 NS3的檢測，檢出限可達5 ng·mL-1。隨后，Roh等[53]又研究了SARS病毒的檢測，同樣運用量子點標記適配體技術(shù)對SARS-CoV殼蛋白質(zhì)進行檢測。在芯片表面，量子點標記的RNA適配體可以特異性結(jié)合SARS-CoV殼蛋白，檢測限最低達到0.1 pg·mL-1。此外，Tian等[54]基于量子點與碳納米管之間形成FRET，建立量子點-單鏈DNA探針捕獲H5N1病毒的DNA，檢測限為9.39 nmol·L-1。

4.3 細胞檢測與成像

量子點標記適配體的功能化探針在腫瘤細胞分析檢測領(lǐng)域已深受研究者的青睞。在對細胞進行長期的追蹤與觀察中，量子點作為標記物具備較高的熒光性能，并且可以提高適配體的穩(wěn)定性[55]。

圖4 基于量子點標記的適配體檢測癌細胞示意圖[56]Fig.4 Schematic representation of cancer cells detection based on quantum dots labeled aptamer[56]

基于量子點修飾的適配體探針在腫瘤細胞檢測與分析中取得了很好的效果。Lin等[56]將嵌入柔紅霉素(DNR)的MUC1適配體與近紅外量子點CuInS2偶聯(lián)，形成DNR-MUC1-QDs偶聯(lián)物作為前列腺癌細胞的識別與成像系統(tǒng)(圖4)，MUC1-QDs納米-生物體系不但可以將DNR藥物傳輸?shù)桨屑毎?，還可以通過量子點CuInS2的熒光強度變化來檢測DNR，同時起到細胞成像的作用。其中對DNR的檢測線性范圍為33～88 nmol·L-1，檢測限為19 nmol·L-1，研究證明了DNR-MUC1-QDs探針的高特異性和靈敏度。目前，電化學細胞傳感器也成為細胞檢測中的一個熱點，Li等[57]基于適配體-量子點(Aptamer-QDs)構(gòu)建了競爭性電化學細胞傳感器，將DNA(cDNA)序列與量子點標記的適配體互補并修飾在金電極表面，靶細胞可以通過特異性識別與Aptamer-QDs結(jié)合，使Aptamer-QDs脫離電極，通過檢測電極上量子點中Cd2+的濃度進而確定靶細胞的濃度。結(jié)果顯示檢測線性范圍為1.0×102～1.0×106cells·mL-1，檢測限為100 cells·mL-1。除此之外量子點-適配體探針在乳腺癌細胞(MCF-7)也被廣泛應(yīng)用[58]，并且還有研究將其與磁性粒子結(jié)合用于肝癌細胞(HCC)的捕獲與檢測[59]，證明了量子點-適配體可作為檢測HCC的理想分子探針。

4.4 真菌毒素檢測

真菌毒素包括黃曲霉毒素(AFs)、赭曲霉毒素(OTs)、伏馬菌素(FBs)玉米赤霉烯酮(ZON)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)、展青霉素(PT)等[60]，目前常用檢測方法主要有液相色譜、高效液相色譜、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用等方法[61]。這些方法大多需要大型儀器進行分析檢測，儀器設(shè)備昂貴，對操作者要求較高，費時又耗力，不適用于實際生產(chǎn)中大量樣品的分析檢測，從而迫切需要發(fā)展簡便、靈敏的快速檢測方法。

圖5 基于量子點標記適配體檢測AFB1[66]Fig.5 Schematic representation of AFB1 detection based on quantum dots labeled aptamer[66]

雖然，量子點以優(yōu)于熒光染料的獨特性質(zhì)已被廣泛應(yīng)用于ZON[62]、黃曲霉毒素(AFB1)[63]、T-2毒素[64]等毒素的檢測。但是，目前量子點-適配體技術(shù)檢測真菌毒素的應(yīng)用仍然很少。研究者曾報道有機染料標記適配體檢測真菌毒素[65]，以熒光素FAM作為標記物，單壁碳納米管作為淬滅劑，設(shè)計了適配體傳感器檢測赭曲霉毒素A(OTA)，檢測限為24.1 nmol·L-1，線性范圍為25～200 nmol·L-1。在此基礎(chǔ)上Lu等[66]將量子點代替了熒光素作為標記物質(zhì)，與適配體進行偶聯(lián)，然后吸附在石墨烯表面，形成石墨烯-適配體-量子點熒光淬滅系統(tǒng)(圖5)。根據(jù)FRET原理，在水溶液體系中AFB1的檢測限低達1.0 nmol·L-1，線性范圍為3.2 nmol·L-1～320 μmol·L-1。與上述熒光素標記適配體檢測真菌毒素相比檢測限更低，靈敏度更高。另外，Yang等[67]基于量子點的電致化學發(fā)光和核酸外切酶雙重信號放大技術(shù)設(shè)計了高靈敏度適配體傳感器檢測OTA，其檢測限低達0.64 pg·mL-1，此方法為檢測毒素提供了新型化學傳感技術(shù)。

5 總結(jié)與展望

近年來，基于量子點標記的適配體技術(shù)在生物毒素檢測、藥物傳遞、細胞成像及臨床治療等領(lǐng)域成為廣大學者研究的熱點，展現(xiàn)出特異性高、靈敏性好、操作簡單、快速等優(yōu)勢，然而在應(yīng)用中還存在一些問題：(1)生物毒性。量子點中含有的重金屬等元素使其具有潛在的危害，特別是Cd系量子點。研究證明量子點的生物毒性與本身的化學組成、合成方法、應(yīng)用方式及環(huán)境等因素有關(guān)[68]，量子點的安全性已成為臨床應(yīng)用的重要問題之一。因此，使用綠色環(huán)保的方法合成毒性較低的量子點是下一步研究的方向。(2)穩(wěn)定性。適配體與量子點偶聯(lián)時容易發(fā)生顆粒的團聚等不穩(wěn)定現(xiàn)象，并且偶聯(lián)后，可能會產(chǎn)生空間位阻效應(yīng)從而降低適配體的特異性和靈敏度[69]。適配體在血液或者細胞內(nèi)容易被核酸酶降解，尤其是RNA更容易被水解，從而不能有效的識別檢測靶物質(zhì)。因此量子點-適配體探針需要更進一步研究提高穩(wěn)定性。(3)適應(yīng)性。目前，量子點-適配體技術(shù)集中于生物分析檢測中，而在中藥材等復雜基質(zhì)中的應(yīng)用較少?；|(zhì)效應(yīng)是新技術(shù)在復雜基質(zhì)中應(yīng)用面臨的主要問題，本課題組Yang[70]等將適配體親和柱應(yīng)用于中藥材中真菌毒素的富集、純化，為新技術(shù)在中藥材等復雜基質(zhì)中的檢測提供了前提。實現(xiàn)新技術(shù)在復雜基質(zhì)中的分析檢測也將成為今后發(fā)展的一個重要方向。

總之，基于量子點標記的適配體技術(shù)為現(xiàn)代分析檢測提供了快速、高效、簡便、靈敏的檢測方法，但仍需要不斷完善，不斷發(fā)展，進而適用于各個領(lǐng)域的分析檢測，同時給中藥等復雜基質(zhì)中有害殘留物的分析檢測帶來新的發(fā)展契機。