毛細(xì)管電泳-電化學(xué)檢測(cè)法測(cè)定淮山中薯蕷皂苷和腺苷含量

胡月芳，黃志強(qiáng)，李金芳

(賀州學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院,廣西賀州 542899)

淮山別名山藥、懷山藥等，它含有活性多糖、薯蕷皂苷、腺苷、尿囊素、膽堿、黃酮、氨基酸等成分，是一種常用中藥材和較佳的保健食品[1]。薯蕷皂苷具有抗腫瘤作用[2]，是合成治療心血管疾病藥物、甾體激素類等藥物的重要原料[3]。腺苷是滋補(bǔ)品及藥品的重要成分，具有調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)、抗凝血、鎮(zhèn)靜、安神等生理活性[4]。常見用來分析藥物中薯蕷皂苷、腺苷分析方法有高效液相色譜(HPLC)法[5 - 7]、紫外分光光度法[8]。HPLC法具有分析速度快、分離效率高、試劑與樣品消耗量少等優(yōu)點(diǎn)，但色譜柱價(jià)格昂貴，容易被污染，分析成本高；紫外分光光度法靈敏度不高。

毛細(xì)管電泳(CE)已廣泛應(yīng)用于復(fù)雜物質(zhì)分離檢測(cè)中[9,10]，CE和電致化學(xué)發(fā)光聯(lián)用技術(shù)已成功應(yīng)用于一些活性物質(zhì)的檢測(cè)[11]，雖然靈敏度和選擇性高，但重現(xiàn)性不夠佳。毛細(xì)管電泳-電化學(xué)檢測(cè)法(CE-ED)較適用于藥用植物活性成分(黃酮、多糖、酚酸)[1，12]、氨基酸及復(fù)雜體系分離檢測(cè)的研究[13 - 15]。如彭友元用該方法分離檢測(cè)了蜂膠中的黃酮和酚酸(包括喬松素、槲皮素、高良姜素、對(duì)香豆酸、阿魏酸和咖啡酸6種物質(zhì))，檢測(cè)限在1.0×10-8～1.0×10-7g/mL之間。并成功的應(yīng)用于蜂膠樣品中黃酮和酚酸的測(cè)定[12]。本文也用此方法成功檢測(cè)了甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖的濃度，其檢出限均低于0.78 μmol/L，峰電流的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)低于2.03%，并用于淮山樣品中甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖的測(cè)定[1]。迄今為止，未見采用CE-ED法同時(shí)測(cè)定薯蕷皂苷、腺苷的報(bào)道。本文采用CE-ED法對(duì)淮山中薯蕷皂苷、腺苷含量進(jìn)行測(cè)定，促進(jìn)淮山資源的開發(fā)與利用，為淮山的質(zhì)量研究和品質(zhì)控制提供了依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

毛細(xì)管電泳-電化學(xué)檢測(cè)(CE-ED)系統(tǒng)為自組裝[15]，包括可調(diào)高壓電源(±30 kV)，CHI660D電化學(xué)工作站(北京華科普天科技有限公司)；石英毛細(xì)管(55 cm×25 μm i.d.，河北永年光導(dǎo)纖維廠)；自行改裝的三維定位調(diào)節(jié)器；三電極體系：工作電極為直徑125 μm銅圓盤電極，對(duì)電極為鉑絲電極，參比電極為Ag/AgCl電極；0.22 μm的乙酸纖維素濾膜(上海新亞凈化器件廠)。

薯蕷皂苷、腺苷(上?；瘜W(xué)試劑有限公司)；其他試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

淮山樣品購于陽光市場(chǎng)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣品溶液的配制

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液薯蕷皂苷、腺苷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的質(zhì)量濃度均為1.00 g/L，用二次蒸餾水配制，使用時(shí)用運(yùn)行緩沖液稀釋至所需濃度。

1.2.2樣品溶液挑選新鮮淮山，于溫度60 ℃烘干4 h后，用研缽研成細(xì)粉，準(zhǔn)確稱取5.0 g粉末，加入70%乙醇100 mL，在室溫下浸泡24 h。離心過濾，濾渣用70%乙醇10 mL洗滌 2 次，最后用0.10 mol/L的Na2B4O7-H3BO3緩沖溶液定容至 250 mL。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

毛細(xì)管用0.1 mol/L的NaOH溶液、二次蒸餾水、緩沖溶液分別沖洗10、5、15 min后使用；銅圓盤電極用細(xì)砂紙打磨，用粒徑0.3 μm的Al2O3粉末拋光平整，并于0～0.95 V(vs.Ag/AgCl)之間在NaOH溶液中掃描，進(jìn)行電化學(xué)處理。采用自組裝的CE-ED檢測(cè)系統(tǒng)，調(diào)節(jié)工作電極與毛細(xì)管出口在同一直線上，最大程度靠近毛細(xì)管的末端，以優(yōu)化后的條件電動(dòng)進(jìn)樣，檢測(cè)池為陰極電泳槽。所有溶液使用前均用0.22 μm乙酸纖維素濾膜過濾。

2 結(jié)果與討論

2.1 電極及檢測(cè)電位的選擇

薯蕷皂苷和腺苷具有多個(gè)羥基，在堿性條件下，它們較易在銅圓盤電極上發(fā)生氧化反應(yīng)，顯示出較高的氧化電流、較高靈敏度和較高穩(wěn)定性[16],且銅圓盤電極制作方便，材料價(jià)廉易得，故本實(shí)驗(yàn)選擇其作為工作電極。實(shí)驗(yàn)考察了不同檢測(cè)電位對(duì)0.1 mg/L的薯蕷皂苷、腺苷峰電流的影響，從圖1可以看出:在不同檢測(cè)電位都能獲得氧化電流，且在0.55～0.95 V 之間隨氧化電位的增加，薯蕷皂苷、腺苷的峰電流不斷增高，且在0.8 V前增高較快，之后緩慢增高。實(shí)驗(yàn)也表明，隨著檢測(cè)電位的增大，本底電流和噪音均增加，當(dāng)檢測(cè)電位高于0.8 V 時(shí)基線很不穩(wěn)定，基底電流明顯提高，噪音也較大。綜合考慮靈敏度及穩(wěn)定性等因素，選擇0.8 V為檢測(cè)電位。

2.2 運(yùn)行緩沖溶液濃度與pH的選擇

分別考察了Na2HPO4-NaH2PO4及Na2B4O7-H3BO3體系對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響。結(jié)果表明,Na2HPO4-NaH2PO4體系穩(wěn)定性和靈敏度較低。且在堿性溶液中，Na2B4O7-H3BO3會(huì)與薯蕷皂苷和腺苷螯合形成配合陰離子而增加溶解度,減少了因吸附造成的峰拖尾等影響[17]。因此,本實(shí)驗(yàn)采用Na2B4O7-H3BO3體系作為運(yùn)行緩沖液。

考察了不同濃度的Na2B4O7-H3BO3溶液對(duì)分離效果的影響。如圖2所示，濃度較低時(shí)，薯蕷皂苷、腺苷因遷移時(shí)間較短未能得到好的基線分離；濃度太高時(shí)，分離時(shí)間隨遷移時(shí)間變長而變長，且電泳電流增大導(dǎo)致基線噪音增大，峰電流降低。綜合考慮，選擇0.10 mol/L的Na2B4O7-H3BO3溶液為最優(yōu)濃度。

固定Na2B4O7-H3BO3緩沖液濃度為0.10 mol/L，考察了pH在7.5～10.0范圍內(nèi)對(duì)分離檢測(cè)效果的影響。結(jié)果表明，當(dāng)pH值小于8.5時(shí)，薯蕷皂苷、腺苷不能基線分離，隨著pH 的增加，遷移時(shí)間增長，分離效果提高，但電流峰形變寬。因此，考慮到要使薯蕷皂苷、腺苷全部分離，選擇緩沖液較小pH較合適。綜合考慮，選擇pH=8.5的Na2B4O7-H3BO3溶液作為運(yùn)行緩沖液。

2.3 分離電壓和進(jìn)樣時(shí)間的選擇

考察了分離電壓在12～22 kV范圍內(nèi)對(duì)分離檢測(cè)的影響。圖3表明，當(dāng)分離電壓升高，遷移時(shí)間逐漸縮短，太高的分離電壓使分離效果降低，但分離電壓太低也會(huì)使遷移時(shí)間變長，電泳峰形變寬。綜合考慮各物質(zhì)的分離度、靈敏度、遷移時(shí)間及焦耳熱等對(duì)分離檢測(cè)的影響，選擇16 kV為最優(yōu)分離電壓。

在選定最優(yōu)運(yùn)行緩沖溶液濃度、pH和分離電壓條件下，考察了不同進(jìn)樣時(shí)間對(duì)薯蕷皂苷、腺苷峰電流的影響。如圖4所示，開始時(shí)，峰電流隨進(jìn)樣時(shí)間的增長而增高，但進(jìn)樣時(shí)間超過8.0 s后峰電流增加不明顯，基線電流增高，電泳峰展寬，峰拖尾等現(xiàn)象，各分析物的分離效果降低，重現(xiàn)性差。綜合考慮，選擇8.0 s為最佳進(jìn)樣時(shí)間。

2.4 重現(xiàn)性、線性范圍與檢出限

配制一系列不同濃度的薯蕷皂苷、腺苷的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以0.1 g/L 的薯蕷皂苷、腺苷混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在最優(yōu)條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，在9 min 內(nèi)實(shí)現(xiàn)基線分離，電泳圖如圖5(a)，薯蕷皂苷、腺苷的濃度分別在一定范圍內(nèi)與峰電流呈線性關(guān)系，線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限如表1。薯蕷皂苷、腺苷峰電流的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.7%、1.5%，遷移時(shí)間的RSD為0.7%、0.6%，重現(xiàn)性良好。

表1 薯蕷皂苷、腺苷混合溶液的回歸方程、線性范圍和檢出限(n=6)

2.5 樣品測(cè)定與回收率實(shí)驗(yàn)

取100 μL淮山樣品提取液，加運(yùn)行緩沖液稀釋到1.00 mL，混勻后立即進(jìn)樣，檢測(cè)淮山中薯蕷皂苷、腺苷的含量，在9 min 內(nèi)實(shí)現(xiàn)基線分離，電泳圖如圖5(b)。與標(biāo)準(zhǔn)溶液的電泳圖相比，1、2峰分別是薯蕷皂苷、腺苷的電流峰，分離效果良好。除此之外，還發(fā)現(xiàn)了一些未知峰，但對(duì)薯蕷皂苷、腺苷的分離測(cè)定不產(chǎn)生干擾，并不影響測(cè)定結(jié)果。

為了再次驗(yàn)證CE-ED方法的可靠性，在淮山提取液中添加適量薯蕷皂苷、腺苷標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2 淮山中薯蕷皂苷、腺苷的含量及加標(biāo)回收率(n=6)

3 結(jié)論

本文采用CE-ED 法檢測(cè)淮山中薯蕷皂苷、腺苷的含量。實(shí)驗(yàn)表明，在優(yōu)化條件下，薯蕷皂苷、腺苷在9 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)基線分離，被測(cè)物濃度與峰電流呈良好的線性關(guān)系。該方法簡單可靠、準(zhǔn)確、靈敏度高，重現(xiàn)性好，為淮山中薯蕷皂苷、腺苷的測(cè)定提供了一種有效的方法?；瓷街惺硎氃碥铡⑾佘蘸康臏y(cè)定顯示，淮山具有較高的營養(yǎng)價(jià)值，有良好的開發(fā)前景。