核殼式氯霉素分子印跡聚合物碳納米管復(fù)合材料的制備及應(yīng)用

王小玉,孫復(fù)錢,曾國屏,劉昕昕,喻繼文

(江西省科學(xué)院應(yīng)用化學(xué)研究所，江西南昌 360102)

氯霉素類抗生素(Chloramphenicols，CAPs)是一種在委內(nèi)瑞拉鏈霉菌(Streptomyces Venezuela)中分離提取的廣譜抗生素。CAP已經(jīng)廣泛應(yīng)用于治療和預(yù)防家禽、家畜及水產(chǎn)品的疾病。然而長期使用可引起再生性障礙性貧血和其他惡性血液病。許多國家嚴(yán)格禁止將CAP用于食品動物(特別是蛋雞和奶牛)中，規(guī)定CAP的最大殘留限量為0～10 ng/g。歐盟、美國等均在法規(guī)中規(guī)定CAP殘留限量標(biāo)準(zhǔn)為“零容許量”[1,2]，即不得檢出。我國也已經(jīng)禁止將CAP及其鹽、酯用于食品動物。任何水產(chǎn)品、畜禽產(chǎn)品中CAP都是必檢項目。因此建立靈敏度高、選擇性好、簡便易行的動物源性食品CAP殘留的檢測方法是非常有必要的。目前動物源性食品中CAP的殘留分析方法主要有酶免疫分析法[3]、微生物法[4]、高效液相色譜(HPLC)和氣相色譜(GC)法[5 - 7]。由于實際樣品基質(zhì)成分復(fù)雜，且污染物濃度在ng·g-1或 μg·g-1數(shù)量級，樣品前處理方法常用液-液萃取和固相萃取(Solid Phase Extraction,SPE)[8]。分子印跡聚合物(Molecularly Imprinted Polymers,MIPs)是一類對特定物質(zhì)具有特異性吸附的分離材料[8 - 11]。MIPs具有制備簡單，選擇性好，抗惡劣環(huán)境能力強(qiáng)，穩(wěn)定性高和可重復(fù)使用等優(yōu)點，作為特異性固相吸附劑在復(fù)雜基質(zhì)樣品前處理領(lǐng)域得到廣泛關(guān)注。

雖然已有CAP分子印跡聚合物應(yīng)用的報道[12 - 14]，但大多數(shù)MIPs采用傳統(tǒng)本體分子印跡方法，存在識別位點不均一，傳質(zhì)阻力大，選擇性差，動力學(xué)平衡慢等缺點。本工作以多壁碳納米管(MWCNTs)為載體，采用溶膠-凝膠的方法先在MWCNTs表面包覆硅層，得到MWCNTs@SiO2，再以氯霉素CAP為模板，采用表面分子印跡技術(shù)制備具有核殼結(jié)構(gòu)的CAP分子印跡聚合物包覆的碳納米管復(fù)合材料(MWCNTs@CAP-MIPs)。將MWCNTs@CAP-MIPs作為選擇性吸附劑，實現(xiàn)了對雞蛋樣品中痕量CAP的富集和檢測。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

熱重(TG)分析儀(德國，Netzsch TG 209)；TecnaiG2 T2透射電子顯微鏡(TEM)(荷蘭，飛利浦公司)；AVATAR 360傅立葉變換紅外(FT-IR)光譜儀(美國，Nicolet公司)；UV-2450型紫外/可見分光光度計(日本，島津公司)；LC-20AT高效液相色譜(日本，島津公司)。CAP的色譜測定條件:使用Shimadzu VP-ODS C18色譜柱(150×4.6 mm，5 μm)；流動相條件為色譜純甲醇-水(50∶50，V/V)；流速為1.0 mL/min；紫外檢測器檢測波長為278 nm；進(jìn)樣體積為100 μL。

氯霉素(CAP，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)；碳納米管購于深圳納米技術(shù)有限公司(直徑：60～100 nm，長度：5～15 μm)；四乙氧基硅烷(TEOS)，苯基三甲氧基硅烷(PTMOS)，氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)均購于Alfa Aesar；十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)；HNO3(天津市化學(xué)試劑五廠)；甲醇，無水乙醇，冰乙酸，乙腈，色譜純甲醇均購于天津市康科德科技有限公司；氨水(25%)(天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠)；其它試劑均為分析純。所有的實驗用水均為高純水。

1.2 碳納米管-氯霉素分子印跡聚合物的合成

采用HNO3氧化法對多壁碳納米管(MWCNTs)進(jìn)行純化預(yù)處理。參照Gao等[15]的方法，在表面活性劑CTAB存在下，硅烷試劑APTES水解制備SiO2包覆的碳納米管(MWCNTs@SiO2)。再以CAP為模板，無水乙醇為溶劑，APTES和PTMOS為功能單體，TEOS為交聯(lián)劑，用溶膠-凝膠法制備碳納米管-氯霉素分子印跡聚合物MWCNTs@CAP-MIPs。具體制備過程如下：稱取一定量的CAP(1.25 mmol) 溶于10 mL乙醇，然后加入功能單體APTES(2.5 mmol)和PTMOS(2.5 mmol)，攪拌0.5 h后加入2 mL TEOS，繼續(xù)攪拌10 min使溶液混合均勻后，向上述溶液加入200 mg MWCNTs@SiO2和1 mL 1 mol/L HAc，常溫下攪拌12 h。反應(yīng)后的產(chǎn)物先用無水乙醇洗滌三次，干燥。然后用洗脫液甲醇-乙酸(9∶1,V/V)洗脫聚合物中的模板分子，直至洗滌液在275 nm處無紫外吸收。用甲醇洗滌印跡聚合物三次以除去殘留的乙酸，最后60 ℃下真空干燥至恒重，即得到印跡聚合物MWCNTs@CAP-MIPs。非印跡聚合物MWCNTs@SiO2-NIPs的合成除不加入模板分子CAP外，其它步驟相同。

1.3 MWCNTs@CAP-MIPs的吸附性能

動力學(xué)吸附性能實驗：分別稱取MWCNTs@CAP2-NIPs 50 mg，置于不同離心管中，然后向每個離心管中加入10 mL 20 mg/L的CAP的乙腈溶液，室溫下振蕩。每隔一段時間(5、10、15、……60 min)后，取100 μL吸附后的上清液，利用高效液相色譜法測定溶液中CAP的濃度，直到吸附后的溶液濃度值基本無變化為止。

等溫吸附實驗：分別稱取若干份50 mg CAP分子印跡聚合物及非印跡聚合物，置于10 mL的離心管中，然后分別加入3 mL不同濃度的氯霉素的乙腈溶液。室溫下振蕩2 h，離心，取其上清液，利用高效液相色譜法測定吸附后溶液中氯霉素的濃度。

1.4 MWCNTs@CAP-MIPs應(yīng)用于雞蛋樣品中CAP的富集

對市場上購買的雞蛋樣品參照Sun等[16]的方法進(jìn)行前處理。首先將雞蛋樣品制成勻漿，稱取3份雞蛋樣品，每份5.0 g，置于50 mL離心管中。將CAP分別以5.0、10.0、30.0 μg/kg的添加水平加入到雞蛋樣品中，然后加入20 mL乙醇-水(6∶4,V/V)溶液，在振蕩器上振蕩1 h，離心，將上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中。再重復(fù)提取兩次。合并三次提取的上清液，吹干濃縮后，用乙腈定容至50 mL。將30 mg MWCNTs-@CAP-MIPs加入到上述乙腈定容液中，室溫下振蕩1 h后，離心，棄去上層清液，用甲醇-乙酸((9∶1,V/V)洗脫吸附在MWCNTs@CAP-MIPs上的CAP，用氮吹儀吹干后，流動相定容，再用高效液相色譜法測定吸附后溶液中CAP的濃度。每個添加水平平行測3次。

2 結(jié)果與討論

2.1 MWCNTs@CAP-MIPs的表征

2.1.1透射電鏡表征圖1為MWCNTs、MWCNTs@SiO2和MWCNTs@CAP-MIPs的透射電鏡(TEM)圖。由圖1可見，MWCNTs的直徑約為70～80 nm，硅烷試劑APTES水解后,在MWCNTs表面均勻地包覆了一層SiO2，MWCNTs@SiO2的TEM表明MWCNTs表面包覆層SiO2的厚度約為10 nm，相應(yīng)粒徑增加到約80～90 nm，再經(jīng)過溶膠-凝膠反應(yīng),聚合物層厚度明顯增加，說明在MWCNTs@SiO2表面包覆了CAP分子印跡層，TEM圖像表明已成功制備了MWCNTs@CAP-MIPs，分子印跡層厚度大約為15 nm。

2.1.2紅外光譜表征分別取一定量MWCNTs、MWCNTs@SiO2和MWCNTs@CAP-MIPs，采用KBr壓片法，利用FI-IR光譜對其進(jìn)行表征。從圖2中可以看出，經(jīng)過純化的MWCNTs表面含有羧基，在3 420 cm-1出現(xiàn)羥基特征吸收峰，且在1 630 cm-1處有-C=O的振動峰；MWCNTs@SiO2在1 070 cm-1處出現(xiàn)Si-O的伸縮振動特征吸收峰，說明在納米管表面已經(jīng)包上一層SiO2；而MWCNTs@CAP-MIPs 在1 431 cm-1和1 560 cm-1出現(xiàn)NH2的特征吸收峰，在699 cm-1出現(xiàn)一處苯環(huán)的特征吸收峰，且Si-O的伸縮振動峰進(jìn)一步增強(qiáng)，充分證明了在MWCNTs@SiO2表面接枝上了功能單體，紅外數(shù)據(jù)證實了對MWCNTs的每一步修飾過程都是成功的。

2.1.3熱重分析熱重分析可以對每步反應(yīng)的修飾含量加以表征與量化。圖3為MWCNTs(a)、MWCNTs@SiO2(b)、MWCNTs@CAP-MIPs(c)的TG圖，從圖3曲線a可以看出，從0～200 ℃，隨著溫度的上升，碳納米管吸附的水分子失去，繼續(xù)加熱到400 ℃，碳納米管中的雜質(zhì)組分會不斷地分解，失去約4%重量，而在400～580 ℃組分則相對穩(wěn)定，其含量基本保持不變，隨著溫度升高到580 ℃以上，碳納米管開始分解，至700 ℃幾乎分解完全。圖3曲線b是MWCNTs@SiO2的熱分解曲線，碳納米管包覆一層SiO2后，在200～580 ℃失重約10%，則其損失來自于修飾的硅層部分。圖3曲線c是MWCNTs@CAP-MIPs的熱分解曲線，前面曲線的下降與曲線b類似，但由于MWCNTs@CAP-MIPs 表面接枝了兩種不同的硅烷試劑，在200～580 ℃區(qū)間硅層的失重更多，約占總重量的12.5%，碳納米管升高到580 ℃以上分解完全。TG分析的結(jié)果與TEM的分析結(jié)果相一致，MWCNTs@CAP-MIPs表面包覆上了硅層和分子印跡聚合物層。

2.2 MWCNTs@CAP-MIPs對氯霉素吸附性能的研究

對MWCNTs@CAP-MIPs進(jìn)行了動力學(xué)吸附考察。從圖4a中可以看出，碳納米管印跡聚合物對模板分子CAP的吸附容量在前20 min增加較快，30 min時基本上已達(dá)到吸附平衡。相比于傳統(tǒng)的本體聚合制備的CAP-MIPs吸附平衡時間(12～24 h)，本工作所制備的MWCNTs@CAP-MIPs具有優(yōu)秀的傳質(zhì)特性，印跡層厚約15 nm，印跡位點都在印跡薄層中，保證了較高吸附量的同時，又保證了吸附速率。

MWCNTs@CAP-MIPs和MWCNTs@SiO2-NIP的熱力學(xué)吸附結(jié)果如圖4b所示。MWCNTs@-CAP-MIPs吸附容量隨CAP溶液濃度增大而迅速增大，而MWCNTs@SiO2-NIPs對模板分子的吸附容量變化很小。MWCNTs@CAP-MIPs和MWCNTs@SiO2-NIP吸附平衡濃度在20 mg/L左右達(dá)到平衡。從圖4b中可見，對于同一濃度的CAP溶液，印跡材料吸附容量明顯高于非印跡材料，前者飽和吸附容量是后者的4.2倍左右。造成這種吸附差異性的原因，這是因為MWCNTs@CAP-MIPs存在較多記憶型的識別孔穴，表現(xiàn)出更高的吸附容量。

印跡聚合物對模板分子的識別選擇性用印跡因子(IF)來評價，印跡因子定義為印跡聚合物和非印跡聚合物對模板分子氯霉素的飽和吸附量之比值(QMIP/QNIP)，氯霉素印跡聚合物的印跡因子IF為4.2，說明印跡聚合物對模板分子具有較好的選擇性。我們進(jìn)一步用Langmuir方程來表征MWCNTs@CAP-MIPs對模板分子CAP的吸附性能，Langmuir等溫吸附方程如下：

ce/Q=ce/Qmax+ 1/(KDQmax)

(1)

其中,ce(mg/L) 為分子印跡聚合物達(dá)到吸附平衡時溶液中模板分子CAP的濃度;Q(mg/g)為達(dá)到吸附平衡時分子印跡聚合物對CAP吸附容量，Qmax(mg/g)代表MWCNTs@CAP-MIPs的最大表觀吸附容量，KD為解離常數(shù)。根據(jù)上述方程，通過ce/Q對ce做圖，擬合得到一條直線(圖4c)，擬合得到的線性方程為：ce/Q=1.037ce+9.956(r2=0.9818)，由直線斜率和截距可計算出Qmax=0.9643 mg/g，KD=0.1042 L/mg。

2.3 MWCNTs@CAP-MIPs的重復(fù)使用性能

為了考察MWCNTs@CAP-MIPs的重復(fù)利用性能，對其進(jìn)行了吸附-解吸實驗。結(jié)果表明，MWCNTs@CAP-MIPs的吸附容量在前三次吸附-解吸循環(huán)中，都會比前一次有一定下降，但在第三次吸附-解吸循環(huán)后，MWCNTs@CAP-MIPs的吸附容量比第一次降低約15%。這可能是由于在前一次的吸附過程中部分模板分子被吸附在了印跡聚合物的內(nèi)部，占據(jù)了一部分印跡位點，洗脫過程中無法將其洗脫下來，從而使得這部分識別位點不能再吸附新的模板分子，或者是在洗脫過程中印跡聚合物的部分結(jié)合位點的空間結(jié)構(gòu)遭到破環(huán)，這樣造成了聚合物吸附量的逐次降低。對同一印跡聚合物進(jìn)行了5次吸附-解吸的實驗，第5次吸附容量與第一次吸附容量的比值約為82.0%，結(jié)果表明MWCNTs@CAP-MIPs可以多次重復(fù)使用。

2.4 MWCNTs@CAP-MIPs對雞蛋樣品中氯霉素的富集研究

將MWCNTs@CAP-MIPs材料作為選擇性吸附劑應(yīng)用于雞蛋樣品中CAP的富集，對富集后的MWCNTs@CAP-MIPs用甲醇-乙酸(9∶1,V/V)的溶液洗脫，收集洗脫液定容后用高效液相色譜法測定。對購于超市的雞蛋樣品未檢測出CAP殘留。為了驗證MWCNTs@CAP-MIPs結(jié)合HPLC法測定CAP的可靠性，在雞蛋樣品中分別添加5.0、10、30 μg/kg CAP標(biāo)準(zhǔn)溶液，用MWCNTs@CAP-MIPs富集樣品中CAP，其平均回收率分別為72.3%、81.6%和84.1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于8.5%，回收率和準(zhǔn)確性均較好，結(jié)果表明MWCNTs@CAP-MIPs適用于復(fù)雜樣品中痕量CAP的富集和檢測。

3 結(jié)論

本文發(fā)展了一種以多壁碳納米管(MWCNTs)為載體，以氯霉素為模板，氨丙基三乙氧基硅烷和苯基三甲氧基硅烷為雙功能單體，四乙氧基硅烷為交聯(lián)劑，溶膠-凝膠法制備了核殼結(jié)構(gòu)的氯霉素分子印跡聚合物包覆的碳納米管復(fù)合材料MWCNTs@CAP-MIPs，并進(jìn)行了吸附性能研究，結(jié)果表明MWCNTs@-CAP-MIPs對模板分子具有高的吸附容量，響應(yīng)動力學(xué)快，選擇識別性能良好，對雞蛋樣品中的氯霉素的回收率可達(dá)72.3%～84.1%，有望應(yīng)用于實際樣品中氯霉素殘留量的檢測分析。