硝?；鶡晒馓结樑c牛血清白蛋白相互作用的研究

曾曉丹， 姜 城， 朱寶存

(1.吉林化工學院分析測試中心，吉林吉林 132022；2.中國石油吉林石化公司電石廠，吉林吉林 132022；3.濟南大學資源與環(huán)境學院，山東濟南 250022)

血清白蛋白(Serum Albumin，SA)是動物血液循環(huán)體系中最豐富的蛋白之一，它具有多個配位基團，起著運輸和沉積內源或外源小分子的作用[1]。由于其生物功能與其特定的結構密切相關，因此廣泛應用于生化、生理、醫(yī)學以及生物工程等學科。各種物質與血清白蛋結合方面的研究仍處于熱點[2,3]。物質進入血液循環(huán)后，通過血漿的儲存和運輸?shù)竭_目標位置。研究各種物質與血清白蛋白之間的相互用，有助于了解物質在體內的運輸和分布情況，對于闡明目標物質的作用機制具有重要意義。硝?；?HNO)是NO去單電子形式，NO或硝酸鹽所產生的HNO在體內對心血管活動作用非常明顯，同時可以作為心衰的一種新型治療手段[4]。

本文應用近年報道合成的檢測HNO的熒光探針(4-[2-(diphenylphosphino)benzoate]-N-butyl-1,8-naphtalimide，NIM)[5]，研究該探針與牛血清白蛋白的相互作用。在模擬生理條件下，運用紫外吸收光譜、熒光光譜、傅里葉紅外光譜和CD光譜研究了探針與牛血清白蛋白的相互作用，探討了探針對牛血清白蛋白構象的變化，獲得了熒光猝滅常數(shù)、結合常數(shù)以及相互作用的熱力學常數(shù)，并確定了結合距離以及結合力。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

Cary Eclipse熒光分光光度計(美國，Varian公司)；UV-2550紫外分光光度計(日本，Shimadzu公司)；Tensor 27 傅立葉變換紅外光譜儀(德國，Bruker公司)，CaF2窗口附件；Jasco-810 圓二色譜(日本，Jasco公司)。

BSA(美國Sigma公司)，用二次蒸餾水配成1.0×10-4mol·L-1儲備液，存于4 ℃冰箱中;探針NIM用乙醇配成1.0×10-3mol·L-1儲備液。其他所有試劑均為分析純。實驗用水為二次蒸餾水。

1.2 實驗方法

移取適量的BSA、NIM儲備液，以pH=7.40 Tris-HCl緩沖溶液定容至5 mL。BSA的最終濃度為2 μmol·L-1，而探針的濃度范圍為0～10 μmol·L-1。測定溶液的溶劑體系為乙醇∶水=0.5∶9.5(V/V)。將測定溶液搖勻靜置。

1.2.1熒光光譜在激發(fā)波長為280 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫均為5 nm的條件下，掃描熒光光光譜。

1.2.2同步熒光光譜分別設定△λ=15 nm和60 nm，記錄220～320 nm范圍內的同步熒光光譜。

1.2.3三維熒光光譜在激發(fā)波長為270 nm，步長10 nm的條件下，掃描三維熒光光譜。

1.2.4紫外吸收光譜以Tris-HCl緩沖溶液為參比，掃描200～500 nm范圍內的紫外吸收光譜。

1.2.5紅外光譜在4 cm-1分辯率下掃描64次，在1 800～1 400 cm-1范圍內掃描紅外光譜。

1.2.6CD光譜使用0.1 cm石英池，在200～350 nm范圍內掃描BSA與探針混合前后的CD光譜，同時以Tris-HCl緩沖溶液為參比。

2 結果與討論

2.1 熒光光譜

圖1為探針對BSA的熒光猝滅圖。隨著探針濃度的增加，BSA熒光強度逐漸降低。表明探針與BSA分子發(fā)生了相互作用并形成了復合物，使BSA分子中的氨基酸殘基的微環(huán)境發(fā)生了變化[6]。

熒光猝滅可分為靜態(tài)猝滅和動態(tài)猝滅兩種，這兩種猝滅的主要區(qū)別在于猝滅常數(shù)與溫度關系不同。靜態(tài)猝滅常數(shù)將隨溫度的升高而減小，而動態(tài)猝滅常數(shù)將隨溫度的升高而增大。

根據(jù)Stern-Volmer方程[7]：

F0/F=1+KSV[Q]=1+Kqτ0[Q]

(1)

式中，F(xiàn)0為未加入化合物時的熒光強度，F(xiàn)為加入化合物后BSA的熒光強度，Kq為熒光猝滅常數(shù)，τ0為熒光分子平均壽命(生物)，分子平均熒光壽命一般為10-8s,KSV為猝滅常數(shù)，[Q]為化合物濃度。

將熒光強度按式(1)處理，結果列于表1。由表1 可見，猝滅速率常數(shù)Kq遠遠大于動態(tài)猝滅KSV值2.0×1010L·mol-1·s-1，而且隨著溫度的升高而減小，因此探針對BSA的熒光猝滅屬于靜態(tài)猝滅。探針與BSA形成基態(tài)復合物，引起蛋白質分子內源性熒光的猝滅。

表1 NIM-BSA在不同溫度下的猝滅常數(shù)、結合常數(shù)和結合位點數(shù)

2.2 探針與BSA的結合常數(shù)與結合位點數(shù)

對于靜態(tài)猝滅，探針與BSA的結合常數(shù)與結合位點數(shù)可由以下式[8]得到

lg[(F0-F)/F]=lgK+nlg[Q]

(2)

以lg[(F0-F0/F)對lg[Q]作圖，由斜率以及截距可求得結合常數(shù)和結合位點數(shù)(表1)。由表1的結果可以看出，探針與BSA之間有較強的結合作用，并且n近似等于1，說明探針與BSA有一個結合位點。BSA中含有兩個色氨酸，分別位于134和212位。由于134位色酸處于親水環(huán)境中發(fā)生了熒光猝滅，因此NIM很可能對與位于sub-domain ⅡA 中的212位的色氨酸相結合。

2.3 探針與BSA之間結合距離的計算

根據(jù)F?ster的偶極-偶極無輻射能量轉移理論[9]，將BSA的熒光光譜與探針的吸收光譜重疊，采用矩形分割法求出光譜重疊區(qū)域的積分值J(3.42×10-14cm3·L·mol-1)，求出R值(3.31 nm)，可求得E(0.259) 和r(3.73 nm)值。計算得到的探針與BSA中氨基酸殘基的距離r為3.73 nm，小于最大距離7 nm，表明探針與BSA之間存在非輻射能量轉移。

2.4 探針與BSA的作用力類型

化合物和生物體內蛋白質分子間的結合力主要有范德華力、靜電引力、疏水作用力和氫鍵等[10]。作用力類型可根據(jù)結合過程的熱力學參數(shù)確定。當△H>0、△S>0，結合過程中疏水力占主導；當△H<0、△S>0時，靜電作用占主導；而當△H<0、△S<0時，主要是范德華力和氫鍵占主導作用。將計算求得的熱力學參數(shù)列于表1，由表中的數(shù)據(jù)可得△G<0，說明結合反應可自發(fā)進行。由△H<0、△S>0說明它們之間的主要作用力是靜電作用[11]。

2.5 探針在BSA上結合位置的確定

由于酮洛芬(Ketoprofen)和布洛芬(Ibuprofen)對BSA 的SiteⅠ和SiteⅡ能分別發(fā)生特異性結合并且結合作用較強，所以可以根據(jù)BSA結合位點上酮洛芬或布洛芬的置換作用確定探針與BSA的結合位置。根據(jù)式(3)計算熒光比率[12]：

Binding=F/F0

(3)

將熒光比率對探針與BSA濃度比作圖，見圖2。由圖中可知，隨著酮洛芬的濃度的增加，體系中的F/F0有明顯的降低，而加入布洛芬的體系的熒光變化很小，說明探針被酮洛芬從BSA的結合位點置換下來，即結合在BSA的ⅡA子域上(SiteⅠ)。

2.6 探針對BSA構象影響

2.6.1同步熒光光譜由圖3可以看，色氨酸與酪氨酸殘基的最大發(fā)射峰峰形沒有發(fā)生變化，但熒光強度均有所降低，并且色氨酸熒光降低的程度(60%)要大于酪氨酸殘基(37.5%)。表明該探針的加入導致BSA的構象發(fā)生變化，并且主要與色氨酸的殘基發(fā)生了作用。

2.6.2三維熒光光譜掃描BSA加入探針前后的三維熒光譜圖，得到譜圖見圖4。由圖可看出，加入探針后，最大熒光發(fā)射波長發(fā)生發(fā)變化(紅移了2 nm)，而且熒光強度值發(fā)生明顯降低，因此探針與BSA作用前后三維熒光光譜發(fā)生明顯變化。說明了加入探針后，BSA的熒光被猝滅，并且氨基酸殘基周圍的微環(huán)境也發(fā)生了變化，使BSA的多肽鏈結構發(fā)生了變化[13]。

2.6.3紅外光譜蛋白質紅外光譜的酰胺Ⅰ帶主要是其氨基酸殘基C=O伸縮振動吸收，各二級結構與羰基和氨基間形成的氫鍵有關[14]。從圖5中可以看出，探針與BSA作用后，使BSA的酰胺Ⅰ帶的最大吸收峰從1645 cm-1移動到了 1643 cm-1，說明探針與BSA發(fā)生了結合作用，而且這種結合對BSA的二級結構有一定的改變。

2.6.4CD光譜運用CD法研究了探針與BSA相互作用的情況(圖6)。由圖中可以看出加入探針后，BSA 的CD光譜形狀沒有變化，但是隨著探針濃度的增加，特征峰處的光譜強度卻發(fā)生了明顯的變化。計算結果表明，探針的加入使得BSA的α-螺旋結構的含量由56.11% 轉化為43.36%，進一步表明探針與BSA發(fā)生了作用并使BSA的構型發(fā)生了一定的變化[15]。

3 結論

研究結果表明，探針與BSA具有較強的結合作用，并引起B(yǎng)SA內源熒光的猝滅。靜電引力是二者結合的主要作用力。探針在BSA中只有一個結合位點，位于BSA的亞結構域ⅡA處(SiteⅠ)，該結合位點與色氨酸殘基間的距離3.73 nm。探針NIM的加入使BSA的構象發(fā)生了變化。該研究結果為今后研究探針在生物體內儲存、運輸和檢測機理提供了重要信息。