陸地棉GhCDPK1基因響應干旱脅迫的功能初探

田曉涵，張夢丹，龐學兵，祝建波，朱新霞

(石河子大學 生命科學學院 農業(yè)生物技術重點實驗室, 新疆石河子 832000)

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陸地棉GhCDPK1基因響應干旱脅迫的功能初探

田曉涵，張夢丹，龐學兵，祝建波，朱新霞*

(石河子大學 生命科學學院 農業(yè)生物技術重點實驗室, 新疆石河子 832000)

鈣依賴性蛋白激酶(CDPKs)是一類重要的鈣信號感受蛋白和響應蛋白，在植物干旱、低溫、鹽堿等非生物脅迫應答中起著重要的調控作用。為探討陸地棉GhCDPK1基因在干旱脅迫下所起的作用，該研究利用實時熒光定量PCR技術分析了PEG模擬干旱脅迫下該基因的表達量，發(fā)現GhCDPK1基因受干旱脅迫誘導。通過構建植物表達載體pCAMBIA2300-GhCDPK1，采用農桿菌介導的葉盤法轉化模式植物煙草，發(fā)現干旱脅迫下轉基因植株保水能力明顯高于野生型植株，葉綠素、脯氨酸、可溶性蛋白含量及POD、SOD活性也高于野生型植株，而丙二醛含量低于野生型植株。研究結果表明，GhCDPK1基因作為正向調控因子響應干旱脅迫誘導，過表達GhCDPK1基因可以使植株積累更多的滲透調節(jié)物質、增強抗氧化系統(tǒng)酶的活性和維持細胞膜的穩(wěn)定性來提高植物抵御外界干旱脅迫的能力。

陸地棉；GhCDPK1；干旱脅迫；表達分析；轉基因

干旱、極端溫度和土地鹽漬化等非生物逆境嚴重地影響植物生長發(fā)育和農作物產量，造成全世界作物產量損失30% ～ 50%，其中干旱對作物產量的影響最大[1]，干旱可以導致植物細胞脫水、膜系統(tǒng)和酶系統(tǒng)遭到破壞、嚴重時引起細胞代謝紊亂、功能喪失，甚至造成植株死亡。棉花是新疆主要的經濟作物，由于新疆典型的干旱、半干旱氣候特征，加之土壤鹽堿化、倒春寒、秋季霜凍等不利環(huán)境因素很大程度上影響棉花的產量和品質，給棉花生產造成巨大損失。因此，研究棉花的抗逆基因及其耐逆分子機制，對提高棉花抗逆性十分必要。

鈣依賴性蛋白激酶(calcium-dependent protein kinases, CDPKs)是植物細胞鈣信號轉導的主要感受器和效應器[2-3]，能夠通過與形式多樣的底物相互作用，參與植物對干旱、鹽和低溫脅迫的響應。前人研究發(fā)現過表達AtCDPK1可以提高植株對低溫、高鹽、ABA脅迫的耐受能力，但對高溫脅迫敏感[4]；AtCPK10、AtCPK8、AtCPK4和AtCPK11的T-DNA插入突變體比野生型對干旱脅迫敏感，過表達AtCPK10、AtCPK8、AtCPK4和AtCPK11可以顯著提高植株的抗旱能力[5-7]；AtCPK23的T-DNA插入突變體比野生型對干旱和鹽脅迫具有更強的耐受能力，過表達AtCPK23的植株對干旱和鹽脅迫很敏感[8]；干旱和鹽脅迫能夠誘導AtCPK6的表達，過表達AtCPK6能夠提高植物的抗旱和耐鹽能力，但AtCPK6的T-DNA插入突變體在干旱和鹽脅迫處理下和野生型沒有顯著差異[9]，這說明擬南芥CDPKs在植物耐受非生物脅迫過程中，既可能是正向調節(jié)因子，也可能是負向調節(jié)因子，CDPK成員間還存在功能冗余現象。研究還發(fā)現在水稻中過表達OsCPK9可以提高植株的抗旱能力[10]，過表達OsCPK4可以增強水稻抵抗鹽脅迫和干旱脅迫的能力[11]，在擬南芥中異源過表達葡萄ACPK1基因能提高轉基因植株抗旱保水能力[12]。

到目前為止，陸地棉中僅有少量有關CDPK/CPK基因功能的報道，其中GhCPK1基因參與調控棉花纖維的發(fā)育[13-14]；GhCDPK5能夠應答鹽脅迫的誘導，在鹽脅迫信號傳導路徑中發(fā)揮作用[15]；用探針在相關基因芯片上檢測發(fā)現干旱和堿脅迫下，GhCDPK2、GhCDPK3、GhCDPK11、GhCDPK14、GhCDPK16及GhCDPK28基因表達量增加[16], 但陸地棉其它CDPKs基因在非生物脅迫中的功能還未見報道。在前期通過RT-PCR技術成功克隆得到陸地棉GhCDPK1基因的基礎上，本研究利用實時熒光定量PCR技術分析GhCDPK1基因在干旱脅迫下的表達水平，通過構建植物過表達載體，在模式植物煙草中異位表達來探討該基因在干旱脅迫下所起的作用，分析轉基因植株在干旱及復水處理下滲透調節(jié)物質、抗氧化酶活性和細胞膜穩(wěn)定性變化，為進一步研究陸地棉GhCDPK1基因的功能、探索其參與棉花抗旱機制奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

陸地棉‘新陸早33’(GossypiumhirsutumL.cv. Xinluzao 33)種子由新疆石河子農業(yè)科學研究院棉花研究所提供；野生型(wild type, WT)煙草(NicotianatabacumL.)‘NC89’由新疆石河子大學農業(yè)生物技術重點實驗室保存。

1.2 方 法

1.2.1 棉花GhCDPK1基因干旱脅迫下的表達 采用盆栽法培養(yǎng)棉花幼苗，待幼苗長至3片真葉時，取長勢一致的植株，用含20% PEG6000(W/V)的MS液體培養(yǎng)基浸根，分別取處理0、1、3、6、12和24 h棉花葉片，液氮速凍，-70 ℃保存?zhèn)溆?。參照RNA提取試劑盒(艾德萊生物公司)說明書分別提取對照CK和脅迫處理樣品的RNA，采用cDNA合成試劑盒(北京全式金公司)合成cDNA，以GhCDPK1 -q為引物(北京六合華大基因合成，表1)，根據SYBR Green Ⅰ Master Mix (Roche公司)進行基因擴增，以UBQ7為內參基因，分析GhCDPK1基因在不同時間干旱脅迫下的表達情況。反應程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性15 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)。每個樣品重復3次，采用2-ΔΔCt法對數據進行分析。

1.2.2 植物表達載體的構建 根據植物表達載體pCAMBIA2300(本實驗室保存)和GhCDPK1基因的酶切位點設計引物(表1)，用帶酶切位點引物進行PCR擴增，反應程序為94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 30 s，30個循環(huán)，72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，獲得的目的片段回收純化(Tiangen生物公司)后，與pMD19-T載體(大連Takara公司)進行連接，轉化E.coilDH5α感受態(tài)細胞，篩選經過PCR及質粒酶切鑒定的陽性克隆，送上海生工生物工程有限公司進行測序。

表1 本實驗所用引物

利用質粒提取試劑盒(Tiangen生物公司)提取序列無誤的pMD19-GhCDPK1質粒與植物表達載體pCAMBIA2300的質粒，用XbaI和SalI(Promega公司)分別進行雙酶切，回收純化(Tiangen生物公司)酶切產物后，用T4DNA連接酶(Promega公司)16℃過夜連接，轉化E.coilDH5α感受態(tài)細胞，通過菌液PCR對陽性重組子初步篩選，同時提取質粒，進行雙酶切鑒定，獲得的陽性克隆命名為pCAMBIA2300-GhCDPK1。

1.2.3 煙草轉化及分子鑒定 將pCAMBIA2300-GhCDPK1重組質粒通過電擊法轉入農桿菌GV3101(本實驗室保存)感受態(tài)細胞，葉盤法轉化煙草‘NC89’，暗培養(yǎng)2 d后，轉入含有卡那霉素的分化篩選培養(yǎng)基，約15 d繼代1次，待葉片邊緣長出愈傷、葉片開始卷曲并分化出大量叢生芽后，移入生根培養(yǎng)基中最終獲得抗性再生植株。待根系發(fā)達后移栽入營養(yǎng)土中，幼苗長至7～8片葉片時，用改良的CTAB法小量提取煙草基因組DNA，進行PCR檢測，提取PCR檢測結果為陽性的煙草植株以及受體煙草的總RNA，采用RT-PCR檢測目的基因的轉錄水平。

1.2.4 轉GhCDPK1基因煙草的干旱脅迫 選取長勢相近、生長約2個月的野生型和T0代轉基因煙草株系，實驗前均充分澆水，待托盤無水分進出時開始計時，進行自然干旱處理。連續(xù)12 d不澆水，第13 d復水，試驗共進行15 d。觀察并記錄不同時期煙草表型，取第0、6、9、12天及復水1、3 d煙草葉片，根據張志良等[17]方法進行葉綠素、脯氨酸、可溶性蛋白、丙二醛含量及過氧化物酶和超氧化物歧化酶活性的測定。試驗設3個重復，每個指標重復測定3次。

2 結果與分析

2.1 GhCDPK1基因在干旱脅迫下的表達分析

qRT-PCR結果表明，GhCDPK1基因受干旱脅迫誘導表達。20% PEG6000脅迫處理1 h，GhCDPK1基因表達迅速上調，并且達到最大值，為對照的2.10倍；隨著處理時間的延長，表達量降為初始水平；12 h后表達逐漸增強，此時表達量為初始的1.68倍；24 h后表達量下降(圖1)。推測GhCDPK1基因可能主要在逆境脅迫初期和后期起作用。

2.2 植物表達載體的鑒定

用帶酶切位點引物進行PCR擴增，獲得了目的基因片段(圖2)。利用XbalⅠ和SalⅠ酶切pMD19-GhCDPK1質粒和植物表達載體pCAMBIA2300質粒，酶切產物回收純化后，連接轉入DH5α感受態(tài)細胞，重組陽性質粒經雙酶切鑒定，獲得1 764 bp目的基因片段(圖3)，確定目的基因GhCDPK1已整合到pCAMBIA 2300載體上。

不同小寫字母表示處理間在0.05水平顯著性差異圖1 脅迫下GhCDPK1基因的表達分析Different letters indicate significant difference among treatments at 0.05 levelFig. 1 Analysis of GhCDPK1 gene expression under drought stress

2.3 轉基因煙草的獲得及鑒定

將重組質粒pCAMBIA2300-GhCDPK1葉盤法轉化煙草，篩選獲得抗性再生植株。移栽生長2月后提取植株基因組DNA，進行PCR檢測(圖4)，陽性結果植株提取葉片RNA進行RT-PCR鑒定(圖5)，篩選出的轉基因煙草植株用于后續(xù)生理指標的測定。

M. 250 bp DNA Ladder marker; 1. PCR產物圖2 PCR產物電泳圖M. 250 bp DNA Ladder marker; 1. PCR productsFig. 2 The products of PCR amplification

M. Trans 5K DNA marker；1、2. 酶切產物; 3. 質粒對照圖3 重組質粒的雙酶切鑒定M. Trans 5K DNA marker; 1，2. Double enzyme digestion products; 3. Plasmid controlFig. 3 Double enzyme digestion of recombinant plasmid

2.4 轉基因煙草抗旱性分析

2.4.1 干旱脅迫下轉基因煙草表型變化 如圖6所示，正常生長狀態(tài)下，轉基因株系植株葉片較野生型略大(圖6，A)；斷水前期并無明顯差異，但脅迫9 d后，野生型煙草基部葉片出現輕度萎蔫，逐漸變黃，而轉基因株系葉片正常伸展，受影響較?。桓珊得{迫12 d，野生型煙草整株萎蔫，此時轉基因株系基部葉片開始下垂萎蔫并變黃，但萎蔫程度輕(圖6，B)；復水1 d后，野生型煙草頂部嫩芽出現緩解，轉基因株系均能得到一定恢復，頂部幼嫩葉片開始完全伸展(圖6，C)。由此可見，轉GhCDPK1基因煙草在干旱脅迫實驗中表現出更強的抗旱性。

M. 250 bp DNA Ladder marker；1～16. 轉基因植株; 17～19. 野生型植株圖4 轉基因煙草PCR檢測M. 250 bp DNA Ladder marker；1-16. Transgenic plants；17-19. Wild type tobaccoFig. 4 PCR identification of transgenic plants

1～6. 轉基因植株圖5 轉基因煙草RT-PCR檢測1-6. Transgenic plantsFig. 5 RT-PCR identification of transgenic plants

A. 正常生長狀態(tài)煙草；B. 斷水12 d； C. 復水1 d；Line1、Line 2. 2個不同株系轉基因煙草圖6 野生型和轉基因煙草干旱脅迫下的形態(tài)特征A. Normal states of WT and transgenic tobacco； B. Withheld watering for 12 d； C. Recovered for 1 d; Line 1 and Line 2. Two different lines of transgenic tobaccoFig. 6 The phenotypes of WT, line 1 and line 2 under drought stress

2.4.2 干旱脅迫下轉基因煙草生理指標變化 干旱脅迫過程中，植物的葉綠素含量降低，光合作用減弱，最終導致植物的生長發(fā)育遲緩或停滯。從圖7， A可以看出，脅迫前期，野生型和轉基因型煙草的葉綠素含量差異不明顯。在斷水6 d前，盆中土壤未干透，并未對植株造成干旱脅迫，所以植株葉綠素含量持續(xù)上升；隨著脅迫時間的延長，野生型和轉基因型煙草的葉綠素含量均開始下降，但轉基因株系的含量始終顯著高于野生型；脅迫第12 d，兩者葉綠素含量均達到最低值；復水后，野生型和轉基因煙草葉綠素含量均開始上升。

干旱、鹽堿、低溫等逆境脅迫下，脯氨酸大量積累，其含量與植物的抗逆性呈正相關。由圖7，B可以看出，正常生長條件下，轉基因株系脯氨酸含量較野生型煙草高；干旱脅迫過程中，野生型和轉基因株系脯氨酸含量均逐漸增加，且轉基因型脯氨酸含量顯著高于野生型；復水后，二者脯氨酸含量均呈現下降趨勢。

從圖7，C來看，干旱脅迫下，轉基因和野生型煙草的可溶性蛋白含量均增加，且轉基因的含量高于野生型。脅迫前9 d，轉基因和野生型煙草的可溶性蛋白含量差異不大；12 d時，轉基因株系可溶性蛋白含量是0 d的1.87倍，野生型為初始的1.66倍；復水1 d后，轉基因可溶性蛋白含量是野生型的1.27倍，達到極顯著水平。

A.葉綠素含量； B.脯氨酸含量； C.可溶性蛋白含量；D.丙二醛含量； E.POD活性； F.SOD活性*和**分別表示相關性達顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)水平圖7 干旱脅迫對野生型(WT)和轉GhCDPK1基因煙草部分生理指標的影響A.Chlorophyll concentration；B.Proline content；C.Soluble protein content；D.MDA content； E.POD activity；F.SOD activity；* and ** indicate significant correlation at 0.05 and 0.01 level，respectivelyFig. 7 Physiological analyses of WT and GhCDPK1 tobacco measured under drought stress

植物受到干旱脅迫后，體內產生的活性氧將細胞膜過氧化產生丙二醛(MDA)，所以MDA指標直接反映細胞膜的損傷程度。正常生長的野生型和轉基因煙草MDA含量差別不大；隨著干旱時間的增加，野生型和轉基因株系煙草葉片MDA含量逐漸增加，但是野生型含量明顯高于轉基因型；復水后，轉基因株系MDA含量也低于野生型。這說明轉基因煙草株系較轉基因型細胞膜受損程度較小，自我修復能力較強(圖7，D)。

從圖7， E來看，野生型煙草POD活性起初極顯著高于轉基因型，但在脅迫過程中，上升程度較為平緩；轉基因株系POD活性在脅迫過程中持續(xù)上升，脅迫6 d時與野生型含量相當，隨后顯著高于野生型株系。圖7 ，F SOD活性顯示，正常狀態(tài)下，野生型和轉基因型煙草SOD活性并無明顯差異；脅迫6 d時，轉基因和野生型煙草SOD活性相當；脅迫12 d時，轉基因煙草SOD活性為野生型的1.18倍，達到極顯著水平；隨著脅迫時間增加，野生型和轉基因煙草SOD活性呈現不同的變化趨勢，脅迫9 d后，野生型煙草SOD活性開始下降，但轉基因型SOD活性驟升，為野生型的2倍；復水后，二者SOD活性均下降。

3 討 論

植物對逆境脅迫應答反應是一個涉及多基因、多信號傳導途徑及多基因表達產物的復雜過程，這一過程涉及到植物對逆境脅迫信號的感知、逆境脅迫信號的傳遞、相應受體對逆境脅迫信號的識別與轉導以及相關抗逆基因的表達等[17]。逆境脅迫信號會導致細胞質內Ca2+濃度發(fā)生變化，CDPK因具有獨立的激酶結構域和類似于鈣調素的鈣離子結合域，可以直接感知和結合Ca2+，把Ca2+信號轉換成磷酸化信號，并在細胞內放大和傳遞[18]，進一步調控下游抗逆基因的轉錄表達，啟動相應的生理生化代謝、離子和水分跨膜運輸等，以減輕或避免脅迫對植物造成傷害。

CDPKs在植物中數量眾多、功能多樣化。過表達AtCPK6可提高擬南芥的脯氨酸含量以及一些抗逆相關基因的表達，參與鹽及干旱脅迫誘導過程[9]，過表達AtCPK10的擬南芥葉片葉綠素含量以及植株的抗旱能力均得到提高[5]；過表達OsCDPK7基因可以通過調控下游脅迫響應基因salT、rabl6A等來參與干旱、冷害及鹽害脅迫響應，增強轉基因植株對干旱、冷害及鹽害的耐性[19]；過表達水稻OsCPK12和OsCPK21可提高過氧化氫酶、ROS以及NADPH氧化酶的積累，參與調控鹽、ABA及稻瘟病的抗逆響應[20,21]。

實時定量PCR結果顯示，GhCDPK1基因受干旱脅迫誘導表達。推測在干旱脅迫過程中，胞質鈣離子濃度發(fā)生變化，GhCDPK1能迅速感知干旱脅迫和鈣信號，誘導和啟動干旱信號轉導途徑的傳遞。對轉GhCDPK1基因煙草在干旱脅迫下的形態(tài)特征及生理指標進行觀察和測定，發(fā)現轉基因植株長勢均優(yōu)于野生型，葉綠素、脯氨酸、可溶性蛋白含量及POD、SOD活性高于野生型植株，而丙二醛含量低于野生型植株，這些研究結果與前人對AtCPK6、AtCPK6、OsCPK12和OsCPK21研究結果相似，說明過表達GhCDPK1基因可以使轉基因植株積累可溶性蛋白、脯氨酸等滲透調劑物質來降低細胞的滲透勢，同時POD和SOD活性增強，清除干旱脅迫產生的活性氧，維持生物膜的穩(wěn)定性從而降低干旱脅迫對質膜的傷害，使轉基因植株的保水能力顯著增強。由于CDPKs基因家族擁有較多成員，不同CDPK基因成員對干旱脅迫的表達模式可能不同，為了在陸地棉中挖掘耐旱相關關鍵CDPK基因，需要克隆更多的CDPK基因來研究它們的功能，而有關GhCDPK1如何調控干旱脅迫的下游相關基因表達，也有待進一步研究。

本研究在陸地棉中克隆得到一個受干旱脅迫誘導表達的鈣依賴蛋白激酶基因GhCDPK1，過表達GhCDPK1基因可以使植株積累更多的滲透調節(jié)物質、增強抗氧化系統(tǒng)酶的活性和細胞膜的穩(wěn)定性，顯著提高植物對干旱逆境條件的適應性。

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(編輯:宋亞珍)

Preliminary Exploration for Function of CottonGhCDPK1 Gene under Drought Stress

TIAN Xiaohan, ZHANG Mengdan, PANG Xuebing, ZHU Jianbo, ZHU Xinxia*

(College of Life Science, Shihezi University, Shihezi, Xinjiang 832000, China)

CDPKs(calcium-dependent protein kinases) are important calcium signal receptors and response proteins, which play important roles in response to various abiotic stresses in plants, such as drought, low temperature and salinity. To study the effect of cottonGhCDPK1 gene to drought stress, this study used quantitative real-time PCR to analyze the gene expression under PEG stress. The results showed thatGhCDPK1 gene was up-regulated by drought stress. Moreover, plant expression vector was constructed andGhCDPK1 gene was introduced into tobacco byAgrobacturium-mediated leaf disk transformation method to identify the gene function. The results showed that after drought stress, the water retention capacity of transgenic plants was significantly higher than that of wild type plants; the contents of chlorophyll, proline, soluble protein and the activities of POD and SOD in transgenic tobacco plants were higher than that of wild type, whereas the content of MDA was lower than that of wild type plants. These results indicate thatGhCDPK1 gene, as a positive regulator, was induced by drought stress, and over-expression ofGhCDPK1 gene can enhance the ability of plants to resist drought stress by accumulating more osmotic adjustment substances, enhancing the activity of the antioxidant system and maintaining the stability of the cell membrane.

cotton;GhCDPK1; drought stress; expression analysis; transgenosis

1000-4025(2016)08-1515-07

10.7606/j.issn.1000-4025.2016.08.1515

2016-05-17;修改稿收到日期:2016-07-26

國家大學生創(chuàng)新計劃(201510759017)；新疆生產建設兵團新疆特色植物基因資源研究與利用創(chuàng)新團隊(2014CC005)； 石河子大學育種專項(gxjs2014-yz04)

田曉涵(1990- )，女，碩士研究生，主要從事環(huán)境生物技術研究。E-mail: 723745781@qq.com

*通信作者:朱新霞，副研究員，主要從事植物生物技術和棉花分子育種研究。E-mail: zhuxxshz@126.com

Q785; Q789

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