葡萄抗白粉病相關(guān)基因γVPE的克隆與表達(dá)分析

王晏青， 張小瑩，宋珈凝，王躍進(jìn)， 張朝紅

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 園藝學(xué)院，旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部西北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊陵712100)

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葡萄抗白粉病相關(guān)基因γVPE的克隆與表達(dá)分析

王晏青， 張小瑩，宋珈凝，王躍進(jìn)， 張朝紅*

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 園藝學(xué)院，旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部西北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊陵712100)

該研究采用RT-PCR技術(shù)，從抗病的中國(guó)野生華東葡萄‘白河-35-1’和感病的歐洲葡萄‘佳麗釀’中克隆了液泡加工酶基因(γVPE)，分別命名為VpγVPE和VvCγVPE?？寺〉?個(gè)γVPE基因cDNA長(zhǎng)度均為1 624 bp，ORF為1 482 bp，編碼493個(gè)氨基酸。氨基酸多序列對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，‘白河-35-1’、‘佳麗釀’、‘無(wú)核白’和‘黑比諾’葡萄中的γVPE基因底物結(jié)合口袋域的3個(gè)關(guān)鍵氨基酸之一的絲氨酸(Ser395)均變?yōu)楸彼?Ala)，與其他植物的VPE基因底物口袋結(jié)合域有所不同。實(shí)時(shí)熒光定量PCR表明，在白粉菌誘導(dǎo)后的不同時(shí)期內(nèi)，γVPE基因在感病葡萄和抗病葡萄中的表達(dá)模式不同，抗病株系中VpγVPE基因的表達(dá)量在誘導(dǎo)后的前期(4 h和48 h)和后期(168 h)均有所增加，而感病株系中VvCγVPE基因在誘導(dǎo)后4 h表達(dá)量最高，隨后降低。γVPE基因在白粉菌誘導(dǎo)后不同時(shí)期內(nèi)表達(dá)量的變化，表明γVPE基因在一定程度上與葡萄的抗性相關(guān)。研究結(jié)果為進(jìn)一步揭示γVPE基因在抗病過(guò)程中的分子機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

葡萄；γVPE；基因克??；白粉??；表達(dá)分析

植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化歷程中形成了嚴(yán)密而復(fù)雜的防御體系，使植物能夠抵抗病原菌的入侵和其他因子造成的危害，從而更好地適應(yīng)周圍的生活環(huán)境并不斷地繁衍后代[1]。植物的抗病基因作為植物防御體系中最重要的組成部分，在抵抗病原菌入侵的過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。寄主植物可通過(guò)相關(guān)抗性基因的表達(dá)來(lái)抵抗病原菌的入侵，當(dāng)抗性基因正常表達(dá)時(shí)，寄主植物出現(xiàn)細(xì)胞壁加固增厚、受體細(xì)胞內(nèi)吞等現(xiàn)象，以此來(lái)阻止病原菌的生長(zhǎng)[2]。在寄主受病原菌侵染部位常出現(xiàn)局部壞死，阻止菌絲向正常組織擴(kuò)散。壞死斑形態(tài)多種多樣，可以是單個(gè)細(xì)胞死亡，也可以是多個(gè)細(xì)胞死亡造成較大的壞死區(qū)域，這種壞死反應(yīng)即為超敏反應(yīng)(Hypersensitive Response，HR)[3]。超敏反應(yīng)是一種具有高度組織性的細(xì)胞程序性死亡(Programmed Cell Death，PCD)過(guò)程[4]，是一種自發(fā)的有序性死亡[5]，γVPE基因與PCD密切相關(guān)并且在營(yíng)養(yǎng)器官中的表達(dá)量相對(duì)較高[6]。在植物中，液泡加工酶(Vacuolar Processing Enzyme，VPE)的缺失可阻止HR反應(yīng)和胚胎發(fā)育早期因細(xì)胞層不足而引起的細(xì)胞死亡[7]。因此，VPE基因與植物抵抗病原菌入侵的防御體系密切相關(guān)。

1987年，Hara-Nishimura 和Nishimura在成熟南瓜種子的儲(chǔ)存蛋白中第一次發(fā)現(xiàn)了一種半胱氨酸蛋白酶，并將其命名為液泡加工酶[8-9]。動(dòng)物中的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(caspase)是調(diào)控動(dòng)物細(xì)胞程序性死亡的關(guān)鍵開關(guān)，一旦開啟將不可逆的執(zhí)行細(xì)胞死亡程序。1998年，從煙草中檢測(cè)到了一個(gè)具有底物蛋白酶活性的半胱氨酸蛋白酶——類caspase酶，該酶是病毒誘導(dǎo)的PCD過(guò)程所需要的[10-11]，諸多研究已證實(shí)VPE蛋白為植物中具有調(diào)控細(xì)胞程序性死亡的caspase酶[12]。

VPE蛋白能合成不活躍的蛋白前體，且不需要其他的因子來(lái)激活，就能夠通過(guò)自身催化來(lái)切斷暴露在蛋白前體表面的天冬酰胺殘基和天冬氨酸殘基而形成相應(yīng)的成熟蛋白[8-9，13-17]。VPE蛋白具有caspase-1活性，并且VPE蛋白的成熟的過(guò)程與caspase-1的活化過(guò)程相似[16，18-19]。前體蛋白通過(guò)自身催化轉(zhuǎn)為功能性VPE蛋白后會(huì)對(duì)液泡中的蛋白酶進(jìn)行加工，從而發(fā)揮類似于動(dòng)物細(xì)胞中caspase調(diào)控細(xì)胞程序性死亡(PCD)的功能[20]。VPE蛋白在病毒誘導(dǎo)的過(guò)敏性細(xì)胞死亡早期過(guò)程中是必不可少的，而HR涉及兩個(gè)獨(dú)立的過(guò)程，即PCD和防御蛋白的誘導(dǎo)，并且VPE蛋白是在PCD過(guò)程中發(fā)揮作用的[6]。

研究發(fā)現(xiàn)γVPE基因具有類caspase活性，并在防御病原菌入侵的過(guò)程中起作用，如：經(jīng)丁香假單胞菌(Pseudomonassyringae)、灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)和蕪菁花葉病毒(Turnipmosaicvirus)的誘導(dǎo)后，擬南芥中γVPE基因的表達(dá)量顯著增加；同時(shí)，γVPE基因過(guò)量表達(dá)的擬南芥植株感染丁香假單胞菌過(guò)程中，植株出現(xiàn)大量離子滲透現(xiàn)象，表明在植物與病原菌互作的過(guò)程中，γVPE基因可能參與植物PCD的調(diào)控過(guò)程；此外，caspase-1抑制劑能夠阻斷VPE基因的自激活和及其下游酶的活化[21]。試驗(yàn)表明，擬南芥VPE的四突變?nèi)笔w(αVPE/βVPE/γVPE/δVPE)既沒(méi)有VPE蛋白的活性也沒(méi)有類caspase-1蛋白的活性[18]。此外，γVPE重組體能夠識(shí)別一個(gè)Km為30.3 μmol/L 的VPE底物和一個(gè)Km為44.2 μmol/L 的caspase-1底物[18]。有關(guān)擬南芥VPE活性探針的研究發(fā)現(xiàn)，在活體營(yíng)養(yǎng)型卵菌(Hyaloperonosporaarabidopsidis)侵染擬南芥的過(guò)程中，γVPE蛋白的活性有所增加，并且擬南芥四突變體中的卵菌孢子數(shù)有所減少，說(shuō)明γVPE基因與卵菌的致病性密切相關(guān)。此外，這種抗性增強(qiáng)的效應(yīng)僅發(fā)生在γVPE基因單突變體上，而其他的VPE基因能夠促進(jìn)卵菌孢子的形成[22]。

目前，已在葡萄基因組中共發(fā)現(xiàn)了3個(gè)VPE成員：βVPE、γVPE和δVPE，并分別在‘無(wú)核白’和‘黑比諾’葡萄中克隆了γVPE基因，發(fā)現(xiàn)γVPE基因與VPE家族的其他成員相比，底物結(jié)合口袋域的3個(gè)關(guān)鍵氨基酸中的絲氨酸(Ser347)被丙氨酸(Ala)取代[22]。本研究在此基礎(chǔ)上，從中國(guó)野生華東葡萄‘白河-35-1’及歐洲葡萄‘佳麗釀’全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)中克隆獲得了γVPE基因，并通過(guò)生物信息學(xué)分析和白粉菌誘導(dǎo)后不同時(shí)期γVPE基因的表達(dá)情況，來(lái)探究感抗葡萄中γVPE基因在抵抗白粉菌入侵過(guò)程中的作用，為培育新型抗病葡萄品種提供參考價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 植物材料

中國(guó)野生華東葡萄‘白河-35-1’(Vitispseudoreticulataaccession.‘Baihe-35-1’)和歐洲葡萄‘佳麗釀’(Vitisviniferacv. Carinena)種植于西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院種質(zhì)資源圃，葡萄白粉菌{ErysiphenecatorSchw. [syn.Uncinulanecator(Schw.) Burr.]}取自資源圃中歐洲葡萄‘赤霞珠’(Vitisviniferacv. ‘Cabernet Sauvignon’)。

1.2 方 法

1.2.1 白粉菌接種與觀察 采用壓片法[23]，將赤霞珠葉片上的白粉菌接種于生長(zhǎng)狀況良好的‘白河-35-1’與‘佳麗釀’植株的新鮮葉片上，在經(jīng)白粉菌誘導(dǎo)(PM)和未經(jīng)白粉菌誘導(dǎo)(CK)的‘白河-35-1’與‘佳麗釀’植株上分別采集0、4、8、12、24、48、72及168 h 共 8個(gè)時(shí)期的葡萄葉片，將采集的葉片經(jīng)液氮迅速冷凍后置于-80 ℃保存。

1.2.2 葡萄抗白粉病相關(guān)基因γVPE的克隆 使用Omega Plant RNA Kit 試劑盒分別提取經(jīng)白粉菌誘導(dǎo)(PM)和未經(jīng)白粉菌誘導(dǎo)(CK)的‘白河-35-1’共8個(gè)時(shí)期的葉片RNA，使用Prime ScriptTMRT reagent Kit試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，獲得白粉菌誘導(dǎo)后不同時(shí)期內(nèi)中國(guó)野生華東葡萄‘白河-35-1’、歐洲葡萄‘佳麗釀’的cDNA。

以‘無(wú)核白’葡萄(Vitisviniferacv.Thompson Seedless)(登陸號(hào)為KU240054)γVPE基因的序列為參考，使用Primer premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物γVPE-F(5′-GGCTCCGATGACTATCTTTCCG-3′)和γVPE-R(5′-GGAGCAACCAGTAGAAGCAGCA-3′)，以白粉菌誘導(dǎo)的‘白河-35-1’與‘佳麗釀’cDNA為模板，使用LATaq酶(TaRaKa)擴(kuò)增γVPE基因。RT-PCR反應(yīng)體系為：模板50 ng，引物各1 μL(10 μmol/L)，10×LA PCR Buffer(含Mg2+)3 μL，dNTP 2.5 μL，LATaqDNA聚合酶1.5U，加ddH2O補(bǔ)齊至30 μL。RT-PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min 30 s，34個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，將PCR產(chǎn)物回收并連接至克隆載體pMD19-T上，再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌(E.coli)感受態(tài)細(xì)胞Top10中，通過(guò)藍(lán)白斑篩選挑取白斑單菌落進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)，獲得陽(yáng)性菌株后送至奧科公司測(cè)序。

1.2.3γVPE基因的序列分析 將測(cè)序獲得的γVPE基因的cDNA序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行核苷酸和氨基酸序列比對(duì)，在ORF Finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/)中找出目標(biāo)序列的最大開放閱讀框。使用Expasy中的Protparam程序(http://web.expasy.org/protparam/)分析γVPE基因的理化性質(zhì)，通過(guò)ProtScale程序(http://web.expasy.org/protscale/)對(duì)γVPE蛋白的疏水性進(jìn)行分析，用TMHMM 2.0程序 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)分析γVPE蛋白是否具有跨膜區(qū)域。用MEGA 6.0軟件進(jìn)行進(jìn)化樹分析。用DNAMAN軟件，將‘白河-35-1’和‘佳麗釀’γVPE基因的氨基酸序列與擬南芥、‘無(wú)核白’和‘黑比諾’VPE基因家族所有成員的氨基酸序列進(jìn)行對(duì)比分析。用SWISS-MODEL (http://swissmodel.expasy.org/)同源建模法構(gòu)建VpγVPE蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)圖，并在圖中標(biāo)注底物結(jié)合口袋的3個(gè)關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)的位置。

1.2.4 葡萄白粉菌誘導(dǎo)后γVPE基因的表達(dá)分析 根據(jù)γVPE基因的cDNA序列設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量引物，qRT-PCR-γVPE-F(5′-CAACCTGCGGACTGAAACG-3′)和qRT-PCR-γVPE-R(5′-TGTTGAGACTTAGATCACCATATTGC-3′)。以‘白河-35-1’和‘佳麗釀’植株8個(gè)時(shí)期的葉片cDNA為模板，以葡萄18S rRNA為內(nèi)參基因，引物序列qRT-PCR-18S rRNA-F(5′-CAACAAACCCCGACTTCTG-3′)和qRT-PCR-18S rRNA-R(5′-TGTCACTACCTCCCCGTGTC-3′)，根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒SYBR Premix ExTaqTM Ⅱ(TaRaKa)說(shuō)明書進(jìn)行qRT-PCR。qRT-PCR反映體系為：cDNA 1 μL，引物各0.8 μL(10 μmol/L)，2×SYBR 10 μL，ddH2O 7.4 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 5 s，58 ℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)；58 ℃ 15 s，75個(gè)循環(huán)。每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次，用The iQ5 Real-Time PCR Detiction System儀器進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，用Excel處理數(shù)據(jù)并生成圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄抗白粉病相關(guān)基因γVPE的克隆

以γVPE-F和γVPE-R為引物，以經(jīng)白粉菌誘導(dǎo)的‘白河-35-1‘和’佳麗釀‘的葉片cDNA為模板，用LATaq酶擴(kuò)增γVPE基因。獲得長(zhǎng)約1 700 bp目的片段(圖1)。測(cè)序結(jié)果顯示，‘白河-35-1’和‘佳麗釀’葡萄中γVPE基因cDNA序列長(zhǎng)度均為1 624 bp，ORF為1 482 bp，編碼493個(gè)氨基酸，分別命名為VpγVPE和VvCγVPE?？梢钥闯銎咸褜俨煌N間的γVPE基因序列的保守性很高。

2.2 葡萄 γVPE基因序列分析

經(jīng)ProtParam程序預(yù)測(cè)，‘白河-35-1’的VpγVPE基因編碼493個(gè)氨基酸，分子量約為54 041.6 Da，理論等電點(diǎn)為5.28，不穩(wěn)定指數(shù)為43.51，‘佳麗釀’VvCγVPE基因編碼493個(gè)氨基酸，分子量約為54 056.6 Da，理論等電點(diǎn)為5.17，不穩(wěn)定指數(shù)為43.62，‘白河-35-1’與‘佳麗釀’得出的結(jié)果相類似，推測(cè)γVPE為不穩(wěn)定的酸性蛋白。用ProtScale程序?qū)Ζ肰PE蛋白進(jìn)行疏水性分析，結(jié)果表明該蛋白擁有多個(gè)親水和疏水區(qū)域，在10 aa左右存在一個(gè)強(qiáng)的親水區(qū)域。經(jīng)TMHMM 2.0程序分析γVPE蛋白的跨膜區(qū)域，結(jié)果表明該蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)域，γVPE為典型的非跨膜蛋白。

圖1 葡萄γVPE基因的擴(kuò)增M1. DL 2000; 1. VpγVPE; M2. DNA marker Ⅲ; 2. VvCγVPEFig. 1 Amplification of γVPE gene in grape

使用MEGA 6.0進(jìn)行群體多序列對(duì)比，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(圖2)。依據(jù)擬南芥VPE基因與其他物種中已鑒定出的VPE基因的同源性，將其分為3個(gè)亞家族，即營(yíng)養(yǎng)型、種子型和未知型，發(fā)現(xiàn)‘白河-35-1’、‘佳麗釀’葡萄的γVPE基因處于同一分支，屬于營(yíng)養(yǎng)型亞家族；3個(gè)低等植物地衣、苔蘚和綠藻中僅僅SmoVPE1、SmoVPE2基因與高等植物中種子型亞家族親緣關(guān)系較近，其余VPE基因均未與高等植物的VPE基因分到同一亞家族中，說(shuō)明VPE基因在低等植物與高等植物中的進(jìn)化過(guò)程可能差異較大。

采用DNAMAN軟件，將獲得的‘白河-35-1’、‘佳麗釀’γVPE基因的氨基酸序列與擬南芥、‘無(wú)核白’和‘黑比諾’VPE基因家族的所有成員進(jìn)行氨基酸多序列比對(duì)分析(圖3)，發(fā)現(xiàn)與擬南芥中的4個(gè)VPE基因和葡萄中的βVPE、δVPE基因相比，‘白河-35-1’、‘佳麗釀’、‘無(wú)核白’和‘黑比諾’的γVPE基因在395位點(diǎn)的絲氨酸(Ser)均變?yōu)楸彼?Ala)，該氨基酸是VPE結(jié)構(gòu)中底物結(jié)合口袋域的3個(gè)關(guān)鍵氨基酸中的一個(gè)。

▲. ‘白河-35-1’VpγVPE基因；●. ‘佳麗釀’VvCγVPE基因；分支上的數(shù)字表示1000次重復(fù)抽樣中符合聚類的百分?jǐn)?shù)圖2 葡萄VpγVPE和VvCγVPE基因的進(jìn)化樹分析▲. VpγVPE gene in Vitis pseudoreticulata accession.‘Baihe-35-1’；●. VvCγVPE gene in Vitis vinifera cv. ‘Carinena’；The numbers on the branches represent the percentages of times that the species are grouped together in bootstrap analysis for 1 000 replicatesFig. 2 Phylogenetic trees of VpγVPE gene and VvCγVPE gene of grape

At. 擬南芥；VvPN. 黑比諾；VvTS. 無(wú)核白；Vp. 白河-35-1；VvC. 佳麗釀；▲. 2個(gè)催化二聯(lián)體；◆. 3個(gè)關(guān)鍵氨基酸；*.表示突變位點(diǎn)圖3 葡萄VpVPE、VvCVPE基因和其他VPE基因的氨基酸序列比對(duì)分析At. Arabidopsis thaliana; VvPN. Vitis vinifera.Pinot Noir; VvTS. Vitis vinifera.Thompson Seedless; Vp. Vitis pseudoreticulata accession. Baihe-35-1; VvC. Vitis vinifera cv. Carinena; ▲. Catalytic dyad; ◆. Three key amino acids; *. The mutation siteFig. 3 Alignment of the amino acid sequences of VpγVPE, VvCγVPE gene in grape with other VPE genes

在SWISS-MODEL服務(wù)器中，與VpγVPE基因的氨基酸序列相似度最高的是哺乳動(dòng)物中的天冬酰胺內(nèi)肽酶(Asparaginyl Endopeptidase，AEP)，相似度達(dá)44.09%。底物結(jié)合口袋的3個(gè)關(guān)鍵氨基酸中，精氨酸(Arg111)處在無(wú)規(guī)則卷曲區(qū)域，精氨酸(Arg389)和丙氨酸(Ala395)位于α螺旋區(qū)域(圖4)。

2.3 白粉菌誘導(dǎo)后γVPE基因在不同時(shí)期的表達(dá)

通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，分析經(jīng)白粉菌誘導(dǎo)(PM)和未經(jīng)白粉菌誘導(dǎo)(CK)的‘白河-35-1’和‘佳麗釀’植株葉片在不同時(shí)期內(nèi)γVPE基因的表達(dá)量(圖5)，發(fā)現(xiàn)‘白河-35-1’中γVPE基因在白粉菌誘導(dǎo)后的24 h內(nèi)，VpγVPE基因的表達(dá)量變化不大，僅在誘導(dǎo)后的4 h有所增長(zhǎng)，并在隨后的20 h內(nèi)逐漸下降，在誘導(dǎo)后的48 hVpγVPE基因的表達(dá)量顯著增長(zhǎng)并達(dá)到整個(gè)誘導(dǎo)過(guò)程的最高水平，隨后又逐漸下降并在誘導(dǎo)后的168 h達(dá)到另一個(gè)高峰。與未經(jīng)白粉菌誘導(dǎo)的對(duì)照組相比，VpγVPE基因經(jīng)白粉菌誘導(dǎo)后在最高峰48 h的表達(dá)量約為前者的2.5倍?！邀愥劇腣vCγVPE基因在白粉菌誘導(dǎo)后的4 h內(nèi)表達(dá)量顯著增加，隨后降低，在24與72 h 也略有增加，但是在4 h表達(dá)量最顯著約為未經(jīng)處理對(duì)照組的2倍。結(jié)果表明γVPE基因的表達(dá)量的變化與葡萄白粉菌的誘導(dǎo)相關(guān)。

紅色表示α螺旋；黃色表示β折疊；藍(lán)色表示無(wú)規(guī)則卷曲；箭頭所指為底物結(jié)合口袋的3個(gè)關(guān)鍵氨基酸圖4 葡萄VpγVPE蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Red represents alpha helix; yellow represents beta turn; blue represents random coil; The arrow represents three key amino acids for the substrate pocketFig. 4 Prediction of tertiary structure of VpγVPE protein in grape

3 討 論

VPE的結(jié)構(gòu)最初是從蓖麻種子VPE的cDNA序列中推導(dǎo)出來(lái)[16]。VPE蛋白與半胱氨酸蛋白酶caspase-1類似，包含一個(gè)催化二聯(lián)體(由1個(gè)組氨酸His和1個(gè)半胱氨酸Cys構(gòu)成)和一個(gè)由3個(gè)氨基酸(2個(gè)精氨酸和1個(gè)絲氨酸)構(gòu)成的底物結(jié)合口袋域。本研究將獲得的VpγVPE、VvCγVPE基因的氨基酸序列和其他物種的VPE基因的氨基酸序列進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果表明，‘白河-35-1’、‘佳麗釀’、‘無(wú)核白’和‘黑比諾’的γVPE基因處于同一營(yíng)養(yǎng)型分支。且多序列氨基酸分析表明葡萄γVPE基因底物結(jié)合口袋域的3個(gè)關(guān)鍵氨基酸之一的絲氨酸(Ser395)均變?yōu)楸彼?Ala)，這表明葡萄的底物口袋結(jié)合域與caspase-1蛋白的底物口袋結(jié)合域有所不同。研究發(fā)現(xiàn)，羧肽酶Y(carboxypeptidase Y ，CPY)是γVPE蛋白的直接底物[24]，湖北海棠γVPE基因底物結(jié)合口袋域中的絲氨酸(Ser)被蘇氨酸(Thr396)取代后，γVPE基因的底物結(jié)合口袋域形成了一個(gè)活性位點(diǎn)，并與類羧肽酶(carboxypeptidase-like，CPYL)互作后形成完美的受體-配體互作模型“誘導(dǎo)契合-鎖鑰”[25]，該模型指的是酶與其底物在互作前二者的結(jié)構(gòu)具有互補(bǔ)性，有利于酶促反應(yīng)的發(fā)生[26-27]。這些研究表明植物γVPE基因底物結(jié)合口袋域的3個(gè)關(guān)鍵氨基酸之一的絲氨酸(Ser395)有可能因物種不同而發(fā)生變化。本研究中葡萄γVPE基因的底物結(jié)合口袋域發(fā)生的變化是否會(huì)與某些酶促反應(yīng)相關(guān)，這還有待進(jìn)一步研究。因?yàn)槠咸薛肰PE基因的底物仍然未知，不過(guò)其底物應(yīng)該是液泡中一些與衰老、機(jī)械損傷、各種脅迫有關(guān)的蛋白。若能找到這些蛋白，對(duì)進(jìn)一步研究γVPE基因的各種功能將會(huì)提供極大的幫助。

PM.處理組；CK.對(duì)照組；Vp. 白河-35-1，VvC. 佳麗釀圖5 葡萄VpγVPE (A) 和VvCγVPE (B) 基因在白粉菌誘導(dǎo)后不同時(shí)期內(nèi)的表達(dá)量PM. Experiment groups; CK. Control groups; Vp. Vitis pseudoreticulata accession.Baihe-35-1; VvC. Vitis vinifera cv. CarinenaFig. 5 Expression profile of VpγVPE (A) and VvCγVPE (B) gene after powdery mildew induced in different periods in grape

VPE家族是一種很重要的半胱氨酸蛋白酶，在植物發(fā)育進(jìn)程中它在PCD和超敏反應(yīng)中起著關(guān)鍵的作用[16，28]。Hatsugai通過(guò)病毒誘導(dǎo)基因沉默技術(shù)使煙草中的VPE基因沉默，當(dāng)煙草花葉病毒侵染未沉默VPE基因的植株時(shí)，在24 h后可以觀察到明顯的病變，但是當(dāng)煙草花葉病毒侵染已經(jīng)沉默了VPE基因的植株時(shí)，在24 h后未觀察到明顯的病變，說(shuō)明VPE基因在病毒誘導(dǎo)的超敏反應(yīng)中起重要作用[9]。研究還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用乙烯、水楊酸、機(jī)械損傷處理擬南芥植株時(shí)γVPE基因的表達(dá)上調(diào)，而且在12、24和48 h響應(yīng)均比較明顯[29]?？共√O果品種(MaluspumilaMill. cv. Free Redstar)在接種解淀粉歐氏菌(Erwiniaamylovora)后，VPE基因的表達(dá)量在誘導(dǎo)后的30 min和36 h有所增加[30]。相似的結(jié)果在花生的感抗品種中也發(fā)現(xiàn)了，用黑斑病菌侵染花生葉片，24 hAdVPE基因在抗病品種中的表達(dá)量是感病品種中的9倍左右[31]。而本研究中VpγVPE基因、VvCγVPE基因在白粉菌誘導(dǎo)后不同時(shí)期內(nèi)的表達(dá)量也有所不同，VpγVPE基因的表達(dá)量在誘導(dǎo)后的前期(4和48 h)和后期(168 h)均有所增加，VvCγVPE基因在誘導(dǎo)后4 h的表達(dá)量最高，隨后降低。同時(shí)接種白粉菌后‘佳麗釀’、‘白河-35-1’，均出現(xiàn)不同程度的病斑，通過(guò)細(xì)胞壞死來(lái)抵抗白粉菌的侵染。因?yàn)?種葡萄抗性不同，所以γVPE基因在白粉菌誘導(dǎo)后出現(xiàn)了不同的表達(dá)模式。但是γVPE基因與白粉菌之間的具體互作模式還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，葡萄中的γVPE基因底物結(jié)合口袋域中3個(gè)關(guān)鍵氨基酸之一的絲氨酸(Ser395)變?yōu)楸彼?Ala)，并且γVPE基因是與葡萄抗性相關(guān)的基因，因此下一步應(yīng)是將γVPE基因敲除或通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)得到轉(zhuǎn)基因擬南芥或煙草，進(jìn)一步研究γVPE基因的抗病性。為今后通過(guò)雜交育種和轉(zhuǎn)基因技術(shù)定向改良?xì)W洲葡萄的抗性提供依據(jù)。

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(編輯:宋亞珍)

Clonging and Expression Analysis ofγVPEGene Related to Powdery Mildew Resistance in Grapevine

WANG Yanqing, ZHANG Xiaoying, SONG Jianing, WANG Yuejin, ZHANG Chaohong*

(College of Horticulture, Northwest A&F University, State Key Laboratory of Crop Stress Biology in Arid Areas, Key Laboratory Biology and Genetic Improvement of Horticulture Crops, Ministry of Agriculture, Yangling, Shaanxi 712100,China)

Vacuolar processing enzyme (γVPE) was cloned from Chinese wildVitispseudoreticulataaccession.‘Baihe-35-1’ andVitisviniferacv.‘Carinena’ by RT-PCR. They were namedVpγVPEandVvCγVPE. The full length ofVpγVPEandVvCγVPEcDNA are 1 624 bp, and the open reading frame are 1 482 bp, encoding 493 amino acid. The alignment of the amino acid sequence revealed that Ser 395, one key amino acid in substrate pocket, was replaced by Ala inVitispseudoreticulataaccession.‘Baihe-35-1’,Vitisviniferacv.‘Carinena’,Vitisviniferacv.‘Thompson seedless’ , andVitisviniferacv.‘Pinot Noir’. The different expression profile ofVpγVPEgene andVvCγVPEgene in different periods after powdery mildew induced were analyzed by Real-time fluorescent quantitative PCR. After induction the expression ofVpγVPEgene increase slightly in 4 h, 48 h, 168 h and theVvCγVPEgene shows predominant expression in 4 h after that it decreases slowly. The study shows thatγVPEis related to resistant to powdery mildew. The study provides reference value to the molecular mechanism ofγVPEgene in disease resistance.

grape,γVPE, gene clone, expression analysis, powdery mildew

1000-4025(2016)08-1507-08

10.7606/j.issn.1000-4025.2016.08.1507

2016-04-07;修改稿收到日期:2016-06-02

國(guó)家自然科學(xué)基金(31171926)；國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(CARS-30-yz-7)；楊凌示范區(qū)農(nóng)業(yè)科技示范推廣項(xiàng)目(2015-TS-10)

王晏青(1989-)，女，碩士，主要從事果樹育種及生物技術(shù)研究。E-mail：876908609@qq.com

*通信作者:張朝紅，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事葡萄種質(zhì)資源與生物技術(shù)育種研究工作。E-mail：zhangchaohong@nwsuaf.edu.cn

Q785; Q786

A