阿爾巴斯絨山羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離培養(yǎng)及鑒定

馬蘇日古嘎彭航劉佳佳張亦婷桂花劉鵬霞

（1.內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010021；2.西安交通大學(xué)前沿科學(xué)技術(shù)研究院 骨骼關(guān)節(jié)疾病與治療研究中心，西安 710061；3.中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，北京100101；4.中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所 藥物安全性評(píng)價(jià)中心，上海 201203）

阿爾巴斯絨山羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離培養(yǎng)及鑒定

馬蘇日古嘎1彭航2劉佳佳3張亦婷4桂花1劉鵬霞1

（1.內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010021；2.西安交通大學(xué)前沿科學(xué)技術(shù)研究院 骨骼關(guān)節(jié)疾病與治療研究中心，西安 710061；3.中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，北京100101；4.中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所 藥物安全性評(píng)價(jià)中心，上海 201203）

探討阿爾巴斯絨山羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Arbas cashmere goat bone marrow-derived mesenchymal stem cells，gBMMSCs）體外分離培養(yǎng)，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行系統(tǒng)的鑒定，進(jìn)一步深入分析體外誘導(dǎo)時(shí)多向分化相關(guān)基因動(dòng)態(tài)表達(dá)情況。結(jié)果顯示，原代培養(yǎng)的gBM-MSCs呈梭形或紡錘形、放射狀排列的細(xì)胞集落，能夠連續(xù)穩(wěn)定傳代至15代以上；免疫熒光及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示，gBM-MSCs表達(dá)間質(zhì)系特異性表面標(biāo)志物，如：CD13、CD29、CD44、CD106、CD90及CD166，不表達(dá)造血干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD45及CD34；體外誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)證實(shí)該細(xì)胞具有多向分化潛能，能夠向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞分化；熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，gBM-MSCs多向分化相關(guān)基因的表達(dá)水平隨著誘導(dǎo)天數(shù)的增加呈上升趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)阿爾巴斯絨山羊骨髓中分離培養(yǎng)的細(xì)胞具備gBM-MSCs的生物學(xué)特性。

阿爾巴斯絨山羊；間充質(zhì)干細(xì)胞；培養(yǎng)；分化；生物學(xué)特性

1966年，F(xiàn)riedenstein等［1-3］首次從大鼠骨髓中分離鑒定出具有造血支持功能的干細(xì)胞，并證明其在體外可以分化為骨細(xì)胞及脂肪細(xì)胞。在此基礎(chǔ)上，Owen及其同事提出間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymalstem cells，MSCs）這一概念［4，5］。目前，已經(jīng)證實(shí)MSCs是中胚層來(lái)源的一類(lèi)多能干細(xì)胞，具有自我更新及多向分化潛能，廣泛存在于胎兒和成體多種組織器官中，例如：骨髓、脂肪、羊水、骨骼肌、胎肺、胎肝、臍血、臍帶和胎盤(pán)等［6-11］。其中，骨髓中的含量高，分離及獲取操作簡(jiǎn)便，可于自身獲取等特點(diǎn)一直深受研究人員的青睞，因此骨髓來(lái)源的MSCs研究比較普遍；但是，目前絨山羊骨髓MSCs體外分離培養(yǎng)的文獻(xiàn)報(bào)道極少。

絨山羊作為經(jīng)濟(jì)價(jià)值很高的家畜，有關(guān)其生物學(xué)研究對(duì)當(dāng)代畜牧業(yè)發(fā)展具有重大的戰(zhàn)略意義。目前的絨山羊轉(zhuǎn)基因克隆大多使用的是成纖維細(xì)胞，它的一個(gè)顯著的缺點(diǎn)是培養(yǎng)傳代數(shù)目有限、基因轉(zhuǎn)染后存活率低，這一缺點(diǎn)已成為絨山羊轉(zhuǎn)基因新品種培育的瓶頸。本研究從阿爾巴斯絨山羊骨髓中分離培養(yǎng)MSCs，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行系統(tǒng)研究，旨在深入了解大型偶蹄類(lèi)動(dòng)物骨髓MSCs的生物學(xué)特性，為后續(xù)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物新品種培育及組織工程提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 阿爾巴斯絨山羊3-5月齡流產(chǎn)胎兒5個(gè)。

1.1.2 主要試劑 DMEM/F12、IMDM、胎牛血清（Hyclone公司產(chǎn)品）；胰酶、L-谷氨酰胺、地塞米松、吲哚美辛、β-磷酸甘油、維生素C、黃嘌呤、Giemsa染液、DAPI染液（Sigma公司產(chǎn)品）；油紅O（上海紫一試劑廠）；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β、人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、人表皮生長(zhǎng)因子（Pepro Tech公司產(chǎn)品）；阿利新藍(lán)染液（阿拉丁公司產(chǎn)品）；氨水（永大公司產(chǎn)品）；CCK-8試劑盒（Beyotime公司產(chǎn)品）；TRLzol 裂解液（Ambion公司產(chǎn)品）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司產(chǎn)品）；兔多克隆抗體 CD13、CD29、CD34、CD44、CD45、CD90、CD106和CD166（博士德產(chǎn)品）；山羊抗兔 FITC-IgG（Protein Tech產(chǎn)品）；定量PCR引物均由大連寶生物（TaKaRa）公司設(shè)計(jì)并合成，序列見(jiàn)表1。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR引物序列

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞分離和培養(yǎng) 無(wú)菌條件下取阿爾巴斯絨山羊3-5月齡流產(chǎn)胎兒腿骨，用培養(yǎng)基沖洗獲取骨髓，加入肝素抗凝。置20 mL DMEM/F12培養(yǎng)基中，1 000 r/min離心10 min，收集細(xì)胞；再加入完全培養(yǎng)基（含有DMEM/F12，50 ng/mL人表皮生長(zhǎng)因子，10 ng/mL人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，10-8mol/L地塞米松，2 mmol/L谷氨酰胺，5%胎牛血清，100 U/mL青霉素/鏈霉素），將細(xì)胞懸浮后接種到10 mm培養(yǎng)皿中，隨后置于37℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后全量換液，以后每隔2 d換液，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行1∶2的消化傳代。培養(yǎng)的過(guò)程中，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)狀況。

1.2.2 細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 取分離至3個(gè)不同個(gè)體的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的第4代gBM-MSCs，加入完全培養(yǎng)基稀釋為2×104/mL細(xì)胞懸液，按每孔100 μL接種到96孔板中，每隔2 d換液；接種后的第1天起，每隔24 h加入10 μL CCK-8試劑，置于37℃恒溫箱中孵育4 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的吸光值，連續(xù)檢測(cè)7 d，并用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.2.3 細(xì)胞核型分析 取第15代處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的gBM-MSCs，加入80 μL 0.1 mg/mL秋水仙素，置37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育3.5 h；消化收集細(xì)胞，加入8 mL 0.075 mol/L KCl低滲液，置于37℃水浴鍋，孵育30 min，固定，滴片；Gimesa染色15 min，自來(lái)水沖洗，自然晾干，油鏡下觀察細(xì)胞中期染色體形態(tài)及數(shù)目，并用Genus軟件分析。

1.2.4 免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物CD13、CD-29、CD44、CD90和CD106 取第4代gBM-MSCs，在6孔板內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞爬片，細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，每孔加入1.5 mL 4%多聚甲醛固定30 min；加入封閉液（PBS+2%牛血清蛋白+2%山羊封閉血清+2%脫脂奶粉+0.15 mol/L甘氨酸）室溫封閉2 h；滴加1∶200稀釋兔多克隆抗體CD13、CD29、CD44、CD106、CD90，4℃孵育過(guò)夜，PBS沖洗；之后加入1∶50稀釋異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的山羊抗兔IgG，室溫孵育2 h；DAPI染色15 min后共聚焦顯微鏡下觀察結(jié)果。陰性對(duì)照以磷酸鹽緩沖液（PBS）代替第一抗體。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物CD34、CD45和CD166 消化收集第4代gBM-MSCs，用F-PBS（含1%胎牛血清PBS）重懸，將細(xì)胞以106個(gè)/管分裝至2 mL離心管中，離心棄上清，分別加5 μL兔多克隆抗體 CD34、CD45和CD166，避光常溫孵育2 h，PBS沖洗，之后加入1∶50稀釋異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的山羊抗兔IgG，室溫孵育2 h；補(bǔ)加F-PBS沖洗2次，離心棄上清，加800 μL 2%多聚甲醛固定，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，用FlowJo 7.6.1軟件分析數(shù)據(jù)。

1.2.6 多向分化潛能檢測(cè) 消化收集第4代gBMMSCs，加完全培養(yǎng)基，將細(xì)胞濃度調(diào)整至2×104個(gè)/mL，接種于六孔板中，培養(yǎng)24 h后，更換誘導(dǎo)培養(yǎng)液，以后每隔2 d換液，第21天檢測(cè)誘導(dǎo)結(jié)果。對(duì)于成脂肪誘導(dǎo)的細(xì)胞，用1%油紅O染色，倒置熒光顯微鏡觀察脂滴形成情況；用RT-PCR法檢測(cè)脂肪細(xì)胞經(jīng)典基因過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ PPARG（Peroxisome proliferator-activated receptor gamma）的表達(dá)。成骨誘導(dǎo)的細(xì)胞，用20 ng/mL硝酸銀染色，觀察鈣鹽沉積情況；用RT-PCR法檢測(cè)骨細(xì)胞經(jīng)典基因骨鈣素蛋白GLA（Galactosidase alpha）的表達(dá)。成軟骨誘導(dǎo)的細(xì)胞，用1%阿利新藍(lán)染色，觀察酸性黏多糖合成情況，用RT-PCR法檢測(cè)軟骨細(xì)胞經(jīng)典基因光蛋白聚糖LUM（lumican）的表達(dá)。

成脂肪誘導(dǎo)液：IMDM，5%牛胎血清，1 μmol/L地塞米松，5 μg/mL胰島素，0.5 mmol/L黃嘌呤，60 μmol/L吲哚美辛；成骨誘導(dǎo)液：IMDM，5%牛胎血清，0.1 μmol/L地塞米松，0.05 mmol/L維生素C，10 mmol/L β-甘油磷酸；成軟骨誘導(dǎo)液：IMDM，5%牛胎血清，10 ng/mL 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β，10-7mol/L地塞米松，50 μg/mL維生素C。

1.2.7 多向分化相關(guān)基因動(dòng)態(tài)表達(dá)分析 按照上述1.2.6中的實(shí)驗(yàn)方法誘導(dǎo)培養(yǎng)gBM-MSCs后，分別提取誘導(dǎo)7、14和21 d 后的細(xì)胞總RNA，通過(guò)熒光定量PCR法檢測(cè)誘導(dǎo)不同天數(shù)后相應(yīng)分化基因動(dòng)態(tài)表達(dá)情況。對(duì)于成脂肪誘導(dǎo)的細(xì)胞，檢測(cè)脂肪經(jīng)典基因PPARG的表達(dá)趨勢(shì)；對(duì)于成骨誘導(dǎo)的細(xì)胞，檢測(cè)骨經(jīng)典基因GLA的表達(dá)趨勢(shì)；對(duì)于成軟骨誘導(dǎo)的細(xì)胞，檢測(cè)軟骨經(jīng)典基因LUM的表達(dá)趨勢(shì)；以未誘導(dǎo)的gBM-MSCs作為對(duì)照，基因相對(duì)表達(dá)量用GAPDH標(biāo)準(zhǔn)化并用 2-ΔΔCt法運(yùn)算。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞分離和培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)對(duì)5個(gè)絨山羊流產(chǎn)胎兒進(jìn)行了骨髓分離培養(yǎng)，獲得了5株gBM-MSCs。gBM-MSCs原代培養(yǎng)時(shí)4-6 h開(kāi)始貼壁，大約培養(yǎng)14 d后達(dá)到80% 匯合，通過(guò)培養(yǎng)基篩選和傳代培養(yǎng)去除其他類(lèi)型的干細(xì)胞和終末分化細(xì)胞，傳至P5時(shí)呈現(xiàn)均一的成纖維樣細(xì)胞，貼壁生長(zhǎng)，狀態(tài)良好（圖1）。

圖1 阿爾巴斯絨山羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)

2.2 細(xì)胞增殖能力檢測(cè)

第5代gBM-MSCs生長(zhǎng)曲線呈S型（圖2），接種后第0-1天為潛伏適應(yīng)期，從第1天起快速增殖，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，第5天進(jìn)入平臺(tái)期，平臺(tái)期持續(xù)1-2 d，之后細(xì)胞增殖速度顯著下降，進(jìn)入衰退期。

圖2 第5代阿爾巴斯絨山羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

2.3 細(xì)胞核型分析

為驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)所分離出的gBM-MSCs在體外傳代過(guò)程中細(xì)胞染色體數(shù)目是否完整，我們收集第15代gBM-MSCs做染色體數(shù)目分析，隨機(jī)選取20個(gè)樣本進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)。結(jié)果（圖3）顯示，所做的第15代gBM-MSCs中有95%（19/20）的細(xì)胞染色體為2n=60條，具有正常二倍體核型，表明體外培養(yǎng)的gBM-MSCs能夠進(jìn)行正常染色體復(fù)制和分裂。

圖3 第15代阿爾巴斯絨山羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞核型（2n=60）

2.4 免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物CD13、CD29、CD44、CD90和CD106

免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，第5代gBM-MSCs表達(dá)間質(zhì)系表面標(biāo)志物CD13（圖4-B）、整合素家族成員CD29（圖4-C）、黏附分子CD44（圖4-D）、CD106（圖4-E）及CD90（圖4-F）。

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物CD34、CD45和CD166

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，第5代gBM-MSCs表達(dá)粘附分子CD166（圖5-A）、不表達(dá)造血干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD34（圖5-B）、CD45（圖5-C）。

2.6 多向分化潛能檢測(cè)

第5代gBM-MSCs分別用成脂肪、成骨和成軟骨培養(yǎng)基誘導(dǎo)21 d后，進(jìn)行染色和RT-PCR法鑒定。結(jié)果（圖6）顯示，成脂肪誘導(dǎo)后細(xì)胞質(zhì)中形成脂肪顆粒，經(jīng)油紅O染色后，能觀察到桔紅色的脂滴（圖6-A1），RT-PCR顯示成脂肪誘導(dǎo)后的細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)脂肪經(jīng)典基因PPARG（圖6-A3）；成骨誘導(dǎo)后細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)鈣鹽沉積，硝酸銀染色呈陽(yáng)性（圖6B1），RT-PCR顯示成骨誘導(dǎo)后的細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)成骨經(jīng)典基因GLA（圖6-B3）；成軟骨誘導(dǎo)后細(xì)胞質(zhì)中形成酸性黏多糖，經(jīng)阿爾新蘭染色后，能特異性著藍(lán)色（圖6-C1）；RT-PCR顯示成軟骨誘導(dǎo)后的細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)軟骨經(jīng)典基因LUM（圖6-C3）。以上結(jié)果顯示，gBM-MSCs具有多向分化潛能。

圖4 免疫熒光法檢測(cè)第5代阿爾巴斯絨山羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)第5代阿爾巴斯絨山羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物

2.7 多向分化相關(guān)基因動(dòng)態(tài)表達(dá)分析

進(jìn)一步通過(guò)熒光定量PCR法檢測(cè)誘導(dǎo)7、14和21 d后相關(guān)分化基因動(dòng)態(tài)表達(dá)情況，結(jié)果（圖7）顯示，成脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)后脂肪經(jīng)典基因PPARG表達(dá)量隨著誘導(dǎo)天數(shù)的增加逐步上升，誘導(dǎo)21 d后達(dá)到最高，約上調(diào)1 270倍（圖7-A）；成骨細(xì)胞誘導(dǎo)后骨細(xì)胞經(jīng)典基因GLA的表達(dá)也隨著誘導(dǎo)天數(shù)的增加逐步上調(diào)，誘導(dǎo)21 d后達(dá)到最高，約上調(diào)165倍（圖7-B）；成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)后軟骨經(jīng)典基因LUM的表達(dá)量也逐步增加，誘導(dǎo)21 d后達(dá)到最高，約上調(diào)63倍（圖7-C）。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)我們分離培養(yǎng)的gBM-MSCs具有多向分化潛能，多向分化相關(guān)基因的表達(dá)水平隨著誘導(dǎo)天數(shù)的增加呈上升趨勢(shì)。

3 討論

本研究采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法，對(duì)5個(gè)絨山羊流產(chǎn)胎兒進(jìn)行了骨髓分離培養(yǎng)，用含人表皮生長(zhǎng)因子（EGF）和人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）等的擴(kuò)增培養(yǎng)基培養(yǎng)，獲得了5株細(xì)胞，該細(xì)胞具備MSCs的生物學(xué)特征。有研究證實(shí)，培養(yǎng)基中添加人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子有利于細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)［12］，同時(shí)不影響其多向分化能力［13］；而人表皮生長(zhǎng)因子的添加能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖，縮短細(xì)胞的倍增時(shí)間［14，15］。

目前，MSCs的鑒定采用2006年國(guó)際細(xì)胞治療協(xié)會(huì)（International Soeiety for Cellular Therapy，ISCT）提出的標(biāo)準(zhǔn)，包括以下幾方面：①細(xì)胞形態(tài)為成纖維細(xì)胞樣，具有貼壁生長(zhǎng)特性；②陽(yáng)性表達(dá)間質(zhì)系表面標(biāo)志物，如CD73（SH3和SH4），CD105（SH2）和CD90（Thy1）等，陰性表達(dá)造血干細(xì)胞表面標(biāo)志物，如：CD45，CD19，CD19或CD79、CD14或CD11b和HLA-DR等；③具有向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞分化的多向分化潛能［16，17］。本實(shí)驗(yàn)對(duì)gBM-MSCs生物學(xué)特征進(jìn)行了系統(tǒng)研究，結(jié)果顯示，gBM-MSCs體外培養(yǎng)時(shí)具有貼壁特性，呈梭形或紡錘形，具有較強(qiáng)的增殖能力，符合MSCs的基本特征；可連續(xù)穩(wěn)定傳代至15代以上，第15代gBMMSCs仍然具備正常二倍體核型；第5代gBM-MSCs表達(dá)間質(zhì)系表面標(biāo)志物，如：CD13、CD29、CD44、CD106、CD90及CD166，而不表達(dá)造血干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD45及CD34；體外誘導(dǎo)培養(yǎng)后，gBMMSCs能夠向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞分化；以上結(jié)果說(shuō)明我們分離獲得的細(xì)胞具備MSCs的生物學(xué)特性。這一結(jié)果與Ren等［18，19］的報(bào)道相似，他們研究顯示，絨山羊gBM-MSCs表達(dá)間質(zhì)系表面標(biāo)志物CD29、CD44和CD90，不表達(dá)內(nèi)皮及造血干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD31及CD45，體外可以向骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化。

圖6 體外誘導(dǎo)第5代阿爾巴斯絨山羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪、成骨和軟骨細(xì)胞分化

圖7 實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)誘導(dǎo)后分化相關(guān)基因的動(dòng)態(tài)表達(dá)

在此基礎(chǔ)上，我們通過(guò)熒光定量PCR法檢測(cè)多向分化相關(guān)基因PPARG、GLA和LUM動(dòng)態(tài)表達(dá)情況。Rosen等研究顯示，PPARG通過(guò)結(jié)合脂肪細(xì)胞特異基因，如脂肪酸結(jié)合蛋白和脂肪細(xì)胞P2基因，在脂肪形成過(guò)程中扮演重要角色［20，21］。我們發(fā)現(xiàn)成脂肪誘導(dǎo)后PPARG表達(dá)量隨著誘導(dǎo)天數(shù)的增加逐步上升。GLA是成骨特異性表達(dá)基因，與骨礦化基質(zhì)的形成有關(guān)［22，23］。我們發(fā)現(xiàn)成骨誘導(dǎo)后GLA表達(dá)隨著誘導(dǎo)天數(shù)的增加逐步上調(diào)，此結(jié)果與A?il等［24］的研究一致，他們發(fā)現(xiàn)人骨髓MSCs成骨分化過(guò)程中，堿性磷酸酶和骨鈣蛋白表達(dá)上調(diào)。LUM編碼形成亮氨酸豐富的蛋白多糖家族，包括聚糖、雙鏈蛋白聚糖和纖維調(diào)節(jié)蛋白，也可能參與到膠原原纖維的構(gòu)建［25］。我們發(fā)現(xiàn)成軟骨誘導(dǎo)后LUM表達(dá)量同樣隨著誘導(dǎo)天數(shù)的增加逐步上升，誘導(dǎo)21 d時(shí)，表達(dá)顯著上調(diào)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)體外誘導(dǎo)培養(yǎng)gBM-MSCs后，多向分化相關(guān)基因的表達(dá)水平隨著誘導(dǎo)天數(shù)的增加呈上升趨勢(shì)，進(jìn)一步證實(shí)gBM-MSCs具有多向分化潛能。

綜上所述，采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法能夠從阿爾巴斯絨山羊骨髓中分離gBM-MSCs，獲得的gBMMSCs具有自我更新及多向分化潛能。此培養(yǎng)法操作簡(jiǎn)單，可大量分離及純化gBM-MSCs，可以為后續(xù)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物新品種培育及組織工程提供充足種子細(xì)胞，具有重要現(xiàn)實(shí)意義。

4 結(jié)論

本研究從阿爾巴斯絨山羊骨髓中分離培養(yǎng)獲得了gBM-MSCs，該細(xì)胞符合國(guó)際細(xì)胞治療協(xié)會(huì)提出的MSCs鑒定標(biāo)準(zhǔn)，具備MSCs生物學(xué)特性，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

［1］Friedenstein AJ， Piatetzky-Shapiro II， Petrakova KV. Osteogenesis in transplants of bone-marrow cells［J］. J Embryol Exp Morphol，1966， 16：381-390.

［2］Friedenstein AJ， Gorskaja JF， Kulagina NN. Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs［J］. Exp Hematol， 1976， 4（5）：267-274.

［3］Owen M， Friedenstein AJ. Stromal stem cells：marrow-derived osteogenic precursors［J］. Ciba Found Symp， 1988， 136：42-60.

［4］Caplan AI. Mesenchymal stem cells［J］. J Orthop Res， 1991， 9：641-650.

［5］Ahn MY， Zhang ZG， Tsang W， et al. Endogenous plasminogen activator expression after embolicfocal cerebral ischemia in mice［J］. Brain Res， 1999， 83（7）：169-176.

［6］Campagnoli C， Roberts IA， Kumar S， et al. Identification of mesenchymal stem/progenitorcells in human first-trimester fetal blood， liver， and bone marrow［J］. Blood， 2001， 98：2396-2402.

［7］Zvaifler NJ， Marinova-Mutafchieva L， Adams G， et al. Mesenchymal precursor cells in theblood of normal individuals［J］. Arthritis Res， 2000， 2：477-488.

［8］Erices A， Conget P， Minguell JJ. Mesenchymal progenitor cells in human umbilical cord blood［J］. Br J Haematol， 2000， 109：235-242.

［9］Wang HS， Hung SC， Peng ST， et al. Mesenchymal stem cells in the Wharton's jelly of thehuman umbilical cord［J］. Stem Cells，2004， 22：1330-1337.

［10］In ‘t Anker PS， Scherjon SA， Kleijburg-van der Keur C， et al. Isolation of mesenchymal stem cells of fetal or maternal origin from human placenta［J］. Stem Cells， 2004， 22：1338-1345.

［11］Bruder SP， Kurth AA， Shea M， et al. Bone regeneration by implantation of purified， culture-expanded human mesenchymal stem cells［J］. J Orthop Res， 1998， 16：155-162.

［12］Shur I， Lokiec F， Bleiberg I， et al. Differential gene expression of cultured human osteoblasts［J］. J Cell Biochem， 2001， 83：547-553.

［13］Solmesky L， Lefler S， Jacob-Hirsch J， et al. Serum free cultured bone marrow mesenchymal stem cells as a platform to characterize the effects of specific molecules［J］. PLoS One， 2010， 5（9）：e12689.

［14］Sotiropoulou PA， Perez SA， Salagianni M， et al. Characterization of the optimal culture conditions for clinical scale production of human mesenchymal stem cells［J］. Stem Cells， 2006， 24：462-471.

［15］ Horwitz E， Le BK， Dominici M， et al. Clarification of the nomenclature for MSC：the international society for cellular therapy position statement［J］. Cytotherapy， 2005， 7：393-395.

［16］Dominici M， Le Blanc K， Mueller I， et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. the international society for cellular therapy position statement［J］. Cytotherapy，2006， 8：315-317.

［17］ Burgener A. Cell culture technology for pharmaceutical and cellbased therapies［M］. USA：CRC Press， 2006：41-79.

［18］Ren Y， Wu H， Wang X， et al. Analysis of the stem cell characteristics of adult stem cells from Arbas white Cashmere goat［J］. Biochemical， 2014， 448（2）：121-128.

［19］Ren Y， Wu H， Wang X， et al. The effect of arbas cashmere goatbone marrow stromal cells on production of transgenic cloned embryos［J］. Theriogenology， 2014， 81（9）：1257-1267.

［20］Rosen ED， Spiegelman BM. PPARγ：a nuclear regulator of metabolism， differentiation， and cell growth［J］. J Bio Chem，2001， 276（41）：37731-37734.

［21］ Tontonoz P， Hu E， Graves RA， et al. PPAR γ2：tissue-specific regulator of an adipocyte enhancer［J］. Genes Dev， 1994， 8：1224-1234.

［22］ Ryoo HM， Hoffmann HM， Beumer T， et al. Stage-specific expression of dlx-5 during osteoblast differentiation：involvement in regulation of osteocalcin gene expression［J］. Mol Endocrinol，1997， 11（11）：1681-1694.

［23］Hauschka PV， Lian JB， Cole DE， et al. Osteocalcin and matrix gla protein vitamin K-dependent proteins in bone［J］. Physiol Rev，1989， 69（3）：990-1047.

［24］A?il Y， Ghoniem AA， Wiltfang J. Optimizing the osteogenic differentiation of human mesenchymal stromal cells by the synergistic action of growth factors［J］. J Craniomaxillofac Surg，2014， 42（8）：2002-2009.

［25］Pietraszek K， Chatron-Colliet A， Brezillon S， et al. Lumican：A new inhibitor of matrix metalloproteinase-14 activity［J］. FEBS Lett， 2014， 588（23）：4319-4324.

（責(zé)任編輯 馬鑫）

Isolation，Culture and Identification of Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells from Arbas Cashmere Goat

MA Su-ri-gu-ga1PENG Hang2LIU Jia-jia3ZHANG Yi-ting4GUI Hua1LIU Peng-xia1
（1. College of Life Sciences，Inner Mongolia University，Hohhot 010021；2. Bone and Joints Research Center，F(xiàn)rontier Institute of Science and Technology，Xi'an Jiaotong University，Xi'an 710061；3. Institute of Microbiology，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100101；4. Center for Drug Safety Evaluation and Research，Shanghai Institute of Materia Medica，Chinese Academy of Sciences，Shanghai 201203）

Here we isolated and cultured Arbas cashmere goat bone marrow-derived mesenchymal stem cells（gBM-MSCs）in vitro，identified the biological characteristics of gBM-MSCs， and analyzed the dynamic expressions of differentiation genes while induced in vitro. The primary cultured gBM-MSCs were spindle cell-based， showing radial colony arrangement， and stably and continuously passed down for over 15 generations. The detections by immunofluorescence and flow cytometry showed that gBM-MSCs were positive for mesenchymal specific markers，such as CD13， CD29， CD44， CD106， CD90 and CD166， but negative for hematopoietic stem cell surface markers CD45 and CD34. The induction in vitro confirmed that gBM-MSCs owned the multiple differentiation potential， and differentiated into adipocytes， osteoblasts and chondrocyte. Real-time PCR further indicated that the expressions of differentiation genes increased throughout the culture period. Our results confirmed that the isolated and cultured cells from the bone marrow of Arbas cashmere goat possessed the biological characteristics of gBM-MSCs. Our findings promoted the basic research of MSCs in livestock and laid a theoretical foundation for the further application of gBM-MSCs in transgenic breeding and tissue engineering.

Arbas cashmere goat；mesenchymal stem cells；culture；differentiate；biological characteristics

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.02.028

2015-09-06

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31101698），內(nèi)蒙古杰出青年自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2011JQ03）

馬蘇日古嘎，女，碩士研究生，研究方向：干細(xì)胞生物學(xué)；E-mail：1017955583@qq.com

劉鵬霞，女，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：干細(xì)胞生物學(xué)；E-mail：Liupengxia@imu.edu.cn