茶樹咖啡堿合成代謝中N-甲基轉(zhuǎn)移酶的研究進(jìn)展

王榮秀，江麗娜，鄧威威*，張正竹

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茶樹咖啡堿合成代謝中N-甲基轉(zhuǎn)移酶的研究進(jìn)展

王榮秀，江麗娜，鄧威威*，張正竹

（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶樹生物學(xué)與資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥 230036）

咖啡堿是茶葉中的主要品質(zhì)成分之一，是一種黃嘌呤生物堿化合物，約占茶葉干重的2%-5%。在茶樹中咖啡堿的核心合成途徑為：黃嘌呤核苷甲基化反應(yīng)生成7-甲基黃嘌呤核苷，再通過(guò)脫核糖反應(yīng)生成7-甲基黃嘌呤，然后經(jīng)過(guò)兩次甲基化依次生成可可堿和咖啡堿?？Х葔A合成途徑中轉(zhuǎn)甲基化反應(yīng)是通過(guò)N-甲基轉(zhuǎn)移酶催化進(jìn)行的，該酶是咖啡堿合成的關(guān)鍵酶。本文綜述了茶樹中N-甲基轉(zhuǎn)移酶的基因克隆、結(jié)構(gòu)、功能分析及表達(dá)調(diào)控等方面的研究進(jìn)展。

茶樹；咖啡堿；N-甲基轉(zhuǎn)移酶

咖啡堿是茶、咖啡和可可世界三大軟飲料植物中共有的重要功能性成分之一，同時(shí)也是茶樹中主要的生化活性物質(zhì)，約占茶葉干重的2%-5%。19世紀(jì)20年代在咖啡和茶中發(fā)現(xiàn)并分離得到咖啡堿[1]，20世紀(jì)60年代以來(lái)對(duì)咖啡堿在茶樹中的代謝途徑研究有了很大的進(jìn)展，其生物合成途徑也逐步的明晰起來(lái)。Ashihara等[2]用同位素示蹤法證明了茶樹中咖啡堿生物合成與茶樹的生長(zhǎng)發(fā)育有著密切的關(guān)系?？Х葔A在生物體內(nèi)的核心合成途徑為[3-4]：黃嘌呤核苷（Xanthosine，XR）甲基化反應(yīng)生成7-甲基黃嘌呤核苷（7-methylxanthosine，7-mXR），再通過(guò)脫核糖反應(yīng)生成7-甲基黃嘌呤（7-methylxanthine，7-MX），然后經(jīng)過(guò)兩次甲基化作用依次生成可可堿（Theobromine，Tb）和咖啡堿（Caffeine，Cf）。途徑中轉(zhuǎn)甲基化反應(yīng)是通過(guò)N-甲基轉(zhuǎn)移酶（N-methyltransferases，NMTs）催化進(jìn)行的，NMTs是茶樹咖啡堿合成的關(guān)鍵酶。2014年晏嫦妤[5]等綜述了植物中NMTs的酶學(xué)特性、克隆、基因結(jié)構(gòu)及表達(dá)等，本文通過(guò)近年來(lái)學(xué)者的研究對(duì)茶樹NMTs基因克隆、結(jié)構(gòu)、功能分析及表達(dá)調(diào)控等方面的深入研究，了解其分子機(jī)制，全面解析NMTs對(duì)茶樹咖啡堿生物合成的影響。

1茶樹中咖啡堿的概況

咖啡堿（1,3,7-三甲基黃嘌呤）是一種含氮化合物，茶樹中的生物堿以嘌呤堿為主體，而咖啡堿又是構(gòu)成嘌呤堿的主體，因此咖啡堿在茶樹次生代謝中起到了舉足輕重的作用。自然界中富含咖啡堿的植物為數(shù)不多，茶樹就是其中的一個(gè)高等植物。茶樹中的咖啡堿分布與其他植物也略有不同，在其他植物中咖啡堿主要分布在果實(shí)和種子中，葉片中的含量極少。而茶樹中的咖啡堿除了種子外，在其他部位均有分布，其中以新梢嫩芽部位的含量最高，老葉和莖梗中次之，花和果實(shí)中最少，因此咖啡堿通常作為茶葉老嫩程度和判斷茶葉真?zhèn)蔚闹匾煞趾椭笜?biāo)之一[6]。此外，茶樹的品種，生長(zhǎng)環(huán)境，栽培條件也是影響茶樹中咖啡堿含量的因素。20世紀(jì)80年代初發(fā)現(xiàn)了一種天然無(wú)咖啡堿茶葉——南昆山毛葉茶，其體內(nèi)生物堿的組成以可可堿為主，而不是咖啡堿[7]。

咖啡堿不僅在植物體內(nèi)能夠保護(hù)植物免受自然環(huán)境的傷害，促進(jìn)植物的生長(zhǎng)，同時(shí)也是一種普遍、有一定藥用價(jià)值的食物。適量的攝入咖啡堿可以健胃消食、利尿[8、9]、降低高血壓[10]、提高記憶力、抗癌[11]、降低II型糖尿病風(fēng)險(xiǎn)[12、13]等；但過(guò)量的攝入會(huì)引起失眠[14]、焦慮[15]、骨質(zhì)疏松[16]和胎兒畸形[17、18]等。因此，如何調(diào)控茶樹中咖啡堿的合成對(duì)于茶樹資源的高效利用有著重大意義。

2茶樹中咖啡堿的合成途徑

植物中咖啡堿合成途徑大多是針對(duì)咖啡樹和茶樹的研究，但是在其他含有咖啡堿的植物中其合成的主要途徑是一致的[6]?？Х葔A的嘌呤環(huán)骨架來(lái)源于嘌呤核苷酸，在嘌呤甲基化過(guò)程中其甲基供體主要來(lái)自于S-腺苷甲硫氨酸，它是由甲硫氨酸與ATP作用轉(zhuǎn)化而來(lái)的。

`在茶樹中咖啡堿的合成途徑已經(jīng)基本研究清晰：主要分為核心途徑和供體途徑。核心途徑為腺嘌呤核苷酸途徑，其包括四個(gè)主要步驟（如圖中方框部分），(圖1)：經(jīng)過(guò)N-7、N-3、N-1位的三次甲基化反應(yīng)和一步脫核苷反應(yīng)[19-20]。在為核心途徑提供甲基的供體途徑中，合成黃嘌呤核苷有多種來(lái)源，已發(fā)現(xiàn)的有四條[20]：腺嘌呤核苷酸（AMP） 途徑，鳥嘌呤核苷酸（GMP） 途徑，嘌呤環(huán)從頭合成途徑，S-腺苷甲硫氨酸循環(huán)（SAM）途徑。其中，AMP途徑中，由于AMP 大量存在于植物細(xì)胞中，AMP成為咖啡堿合成最有效的前體[1，19-25]。此外，在茶樹植物體內(nèi)還有其他合成咖啡堿的途徑，如茶葉堿通過(guò)補(bǔ)救途徑由3-甲基黃嘌呤、可可堿合成咖啡堿[26]。

3茶樹中NMTs基因的克隆

由于植物中嘌呤生物堿擁有多樣的代謝途徑，在一定的條件下它們也會(huì)相互轉(zhuǎn)化，因此，咖啡堿作為一種黃嘌呤生物堿化合物，在茶樹合成咖啡堿的途徑中，可能存在很多咖啡堿合成相關(guān)的NMTs基因。2000年，Kato[27]等從茶樹嫩葉中得到咖啡堿合成酶，并利用RACE技術(shù)從茶葉中克隆得到了TCS1（AB031280），其是催化咖啡堿生物合成后兩步甲基化反應(yīng)的N（3、1）-甲基轉(zhuǎn)移酶基因，并通過(guò)體外酶活實(shí)驗(yàn)證實(shí)了TCS1基因功能。根據(jù)TCS1基因序列，近年來(lái)從山茶屬中克隆出多個(gè)NMTs基因，許煜華[28]等和金基強(qiáng)[29]等研究表明茶樹中存在著與嘌呤堿合成相關(guān)的NMT基因家族，克隆出多個(gè)NMTS的gDNA序列。在NCBI中已登錄的茶樹咖啡堿合成相關(guān)的N-甲基轉(zhuǎn)移酶序列有大概20多個(gè)，此外還有部分序列尚未登陸NCBI。

圖1 茶樹中咖啡堿的合成途徑

隨著近年來(lái)對(duì)茶樹咖啡堿合成相關(guān)的N-甲基轉(zhuǎn)移酶研究逐步深入，在茶樹中克隆得到具有雙重催化活性的NMTs，可以催化N-3和N-1的甲基化反應(yīng)[27，30]，同時(shí)在可可茶、滇緬茶等山茶屬植物中克隆得到具有催化N-3甲基化反應(yīng)的NMTs。然而，在茶樹中催化咖啡堿合成的第一步甲基化的7-NMT未有報(bào)道，許多疑似具有N-7催化作用的NMTs序列，都證明沒有功能。此外，茶樹體內(nèi)咖啡堿合成的主要途徑已經(jīng)研究透徹，但其次要代謝途徑研究并不完整，其相關(guān)酶的研究也較少。

4茶樹中NMTs的表達(dá)

咖啡堿一般在植物子葉、種子、幼葉中分布，在茶樹中咖啡堿不僅分布在這些部位，其生物活性也已在山茶屬植物的雄蕊、花瓣中發(fā)現(xiàn)，但是可可堿只發(fā)現(xiàn)在茶樹的雄蕊中[31]。眾多研究者通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，茶樹中NMTs的表達(dá)量與咖啡堿的含量呈正相關(guān)，這一表達(dá)規(guī)律與咖啡相似，且茶樹中參與咖啡堿生物合成的主要三個(gè)NMTs在嫩葉、成熟葉片和老葉中的表達(dá)量與咖啡大體是一致的[32]。幼嫩組織中的表達(dá)量高于成熟組織，但是在不含嘌呤生物堿的山茶屬植物中NMTs在成熟葉片中的表達(dá)高于嫩葉[32，33]。通過(guò)研究者的實(shí)驗(yàn)，生長(zhǎng)周期和季節(jié)的變化對(duì)茶樹不同部位的NMTs的表達(dá)有一定的影響。Mohanpuria等[34]的研究發(fā)現(xiàn)茶樹中咖啡堿的合成和降解是發(fā)展變化的和受季節(jié)性調(diào)節(jié)，與休眠生長(zhǎng)階段相比，咖啡堿合成酶在非休眠狀態(tài)下在頂端芽，第一葉，第二葉，幼莖的表達(dá)量比老葉低。陳麗萍[35]等采用Northern blot技術(shù)證明NMTs在不同品種茶樹中春、夏、秋3個(gè)季節(jié)都有表達(dá)，且同一季節(jié)不同品種之間NMTs的表達(dá)量無(wú)明顯差異。李金[36]等研究表明在茶樹秋季嫩葉中，TCS1表達(dá)量與咖啡堿含量顯著正相關(guān)，即TCS1表達(dá)量顯著影響咖啡堿的合成。Fujimori[37]等通過(guò)實(shí)驗(yàn)表明四月份到六月份可可堿和咖啡堿在茶樹嫩芽中被檢測(cè)，但是沒有檢測(cè)到咖啡堿合成酶的活性。

此外，研究者通過(guò)改變外界條件和不同的脅迫處理方式來(lái)研究茶樹中是否受到其他因素的影響。Kato[38]等通過(guò)對(duì)離體茶樹枝條（20-30 cm）進(jìn)行低溫處理、機(jī)械損傷和鹽脅迫，發(fā)現(xiàn)對(duì)TCS基因表達(dá)沒有影響；對(duì)整株茶樹和離體的葉片都進(jìn)行MeJA處理，TCS表達(dá)量都沒有變化；用重金屬處理茶樹葉片24小時(shí)后抑制了TCS的表達(dá)，但這種抑制對(duì)TCS基因表達(dá)不是特異性的，因?yàn)樗瑫r(shí)抑制了茶樹咖啡堿合成其他相關(guān)基因的表達(dá)；茶樹葉片脫水處理后24小時(shí)TCS表達(dá)消失。此外，在對(duì)茶樹葉片分別進(jìn)行蛋氨酸、谷氨酸和硝酸鈉處理2小時(shí)后TCS表達(dá)量高于對(duì)照組（水處理后的葉片）兩倍；在氯化銨和尿素處理后葉片中TCS表達(dá)水平略高于對(duì)照組（水處理后的葉片）。這極有可能是咖啡堿生物合成受下游氮代謝變化的調(diào)控，這就需要進(jìn)一步明確咖啡堿代謝和氮代謝的關(guān)系。Shinozaki[39]等提出ABA缺少影響TCS的基因表達(dá)，表明ABA擁有獨(dú)立的通路參與TCS基因表達(dá)。Koshiishi[40]等研究表明，在光處理和暗處理下的茶樹葉片中都發(fā)生了咖啡堿生物合成且光照條件的改變對(duì)TCS基因的表達(dá)并沒有影響。后者可能是由于咖啡堿合成酶的活性與葉綠體有關(guān)[41]，因此光照條件的改變對(duì)TCS基因的表達(dá)并沒有影響。綜上所述，研究者對(duì)茶樹中影響NMTs表達(dá)因素做了大量的研究，如不同季節(jié)、不同組織部位、不同外界條件和脅迫作用，使得研究者了解NMTs的表達(dá)規(guī)律，從而進(jìn)一步促進(jìn)NMTs的表達(dá)調(diào)控研究，對(duì)調(diào)節(jié)茶樹中咖啡堿合成具有積極意義。

5茶樹中NMTs的活性和結(jié)構(gòu)

茶樹咖啡堿合成酶的氨基酸序列及相關(guān)酶基因表現(xiàn)出高度的相似性且呈現(xiàn)出其底物特異性（見表1），將17條基因用MEGA軟件做系統(tǒng)發(fā)育樹分析（見圖2）后發(fā)現(xiàn)它們的相似度都在65%以上。茶樹中NMTs共有的高保守序列有：motif A（AA/VDLGCAAGP）， motif B’（VYLNDLF/PGNDFN），motif C（PGSFHGRLFP）和YFFF（AYLSQFHEDFTMFL）。甲基供體結(jié)合位點(diǎn)（SAM）有五個(gè)關(guān)鍵氨基酸殘基，這五個(gè)都有相同的motif A，B’和C保守區(qū)。實(shí)驗(yàn)證明TCS1-5的gDNA序列均由4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子組成[29]。三個(gè)保守區(qū)（motif A，B’和C）的編碼區(qū)域位于TCS1序列的第二段外顯子區(qū)。相對(duì)應(yīng)的甲基黃嘌呤結(jié)合的氨基酸編碼區(qū)（在TCS1氨基酸序列中225，269，和318的位置）位于第三和第四段外顯子[42]?？紫槿餥43]等采用生物信息學(xué)分析方法對(duì)植物咖啡堿合成酶的等電點(diǎn)、亞細(xì)胞定位、信號(hào)肽、跨膜螺旋、保守性功能結(jié)構(gòu)域及基序、二級(jí)結(jié)構(gòu)與三級(jí)結(jié)構(gòu)等重要參數(shù)進(jìn)行預(yù)測(cè)與分析。結(jié)果表明，植物咖啡堿合成酶主要定位于胞質(zhì)和胞核中，含有磷酸化、?；吞腔揎椢稽c(diǎn)。

圖2 山茶屬植物NMT蛋白序列的進(jìn)化樹

表1 茶樹中NMTs的克隆及功能[5，43]

植物中參與咖啡堿生物合成相關(guān)的NMTs擁有不同的表達(dá)方式和轉(zhuǎn)錄水平，這些不同可能是由于多個(gè)原因?qū)е碌摹?007年，Mccarthy[44]等實(shí)驗(yàn)表明黃嘌呤核苷甲基轉(zhuǎn)移酶（XMT）中316位絲氨酸可能是底物黃嘌呤核苷的識(shí)別位點(diǎn)，XMT中161位谷氨酰胺到3,7-二甲黃嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶（DXMT）中160位組氨酸可能是催化的結(jié)果，266位苯丙氨酸到異亮氨酸的變化則對(duì)其辨別單甲基和二甲基轉(zhuǎn)移酶至關(guān)重要。

TCS1-6的核苷酸序列擁有很高的同源性（TCS6為假基因[29]），但是這些NMTs的啟動(dòng)子核苷酸序列的相似度非常低[45]。Jin[40，42]等對(duì)不同茶樹品種5’-UTR區(qū)（ATG前252bp）堿基序列和其自然變異的等位基因TCS1a（TCS1，AB031280）（為對(duì)照組），TCS1b(ICS1，AB056108)，TCS1c(PCS1， AB207817)，TCS1d（KT215399），TCS1e（KT215397）和TCS1f（KT215398）進(jìn)行研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明TCS1d，e，f（包含關(guān)鍵氨基酸第225位和第269位）三個(gè)基因重組蛋白的咖啡堿合成酶活性都高于可可堿合成酶，TCS1bc的重組蛋白只有可可堿合成酶（TS）的活性，說(shuō)明TCS1的自然變異改變了其活性和轉(zhuǎn)錄水平。同時(shí)，通過(guò)對(duì)定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)證明了TCS1 氨基酸殘基269位對(duì)TCS的活性和底物識(shí)別中起著重要的作用，但不能檢測(cè)底物的特異性[45]。此外，在低咖啡堿的茶種質(zhì)資源中，TCS1等位基因轉(zhuǎn)錄水平低或其編碼的蛋白質(zhì)只有TS活性這兩個(gè)分子機(jī)制控制著咖啡堿的生物合成，導(dǎo)致了咖啡堿的積累減少[45]。在不同的茶樹品種TCS1是多樣性的，這是個(gè)體樣本不同的遺傳背景的影響導(dǎo)致的。Jin[46]等對(duì)中國(guó)14個(gè)省選擇的44個(gè)擁有豐富遺傳背景的茶樹品種中，在其TCS1的外顯子區(qū)發(fā)現(xiàn)了31個(gè)SNPs。此外，對(duì)TCS1中的SNP4318進(jìn)行位點(diǎn)突變（C/T）可顯著提高TCS1重組蛋白后可可堿合成酶（TS）和咖啡堿合成酶（CS）的活性，同時(shí)驗(yàn)證了SNP4318和咖啡堿含量的關(guān)系。

綜上所述，眾多研究者希望明確決定NMTs活性的關(guān)鍵位點(diǎn)。目前大多數(shù)研究者用定點(diǎn)突變的方法來(lái)進(jìn)行功能驗(yàn)證（表2）。NMTs的結(jié)構(gòu)與其活性關(guān)系的研究，將有助于我們對(duì)咖啡堿合成酶分子機(jī)制的明晰及高、低咖啡堿茶樹選育具有重要意義。

表2 定點(diǎn)突變研究NMTs的活性位點(diǎn)[5]

6展望

由于茶樹NMTs直接參與咖啡堿合成茶樹中與咖啡堿合成相關(guān)的NMTs基因的克隆、調(diào)控對(duì)培育高或低的咖啡堿茶樹品種有重要意義。余有本[47]等通過(guò)構(gòu)建TCS1的植物表達(dá)載體，將TCS1轉(zhuǎn)入煙草發(fā)現(xiàn)TCS1在這些植株中均能表達(dá)。同時(shí)，通過(guò)提取轉(zhuǎn)基因植株中粗酶液進(jìn)行體外酶促反應(yīng)發(fā)現(xiàn)，TCS1能催化7-甲基黃嘌呤和可可堿生成咖啡堿，由此證明轉(zhuǎn)基因煙草植株中的TCSl具有催化活性。此外，張廣輝[48]等構(gòu)建了TCS基因的RNA干涉載體，從而降低茶樹中的咖啡堿含量；一些研究者通過(guò)反義RNA等手段獲得低咖啡堿含量的茶樹品種。2016年，Jin[46]等通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇（MAS）的方法為選擇高含量的咖啡堿茶樹品種提供了強(qiáng)大高效分子標(biāo)記實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為加快育種進(jìn)程、提高效率和選擇精確提供策略。

根據(jù)已有報(bào)道，目前茶樹中NMTs的研究需要進(jìn)一步深入，要進(jìn)一步完善茶樹中NMT信息，了解NMTs在茶樹中的調(diào)控機(jī)制，為完善咖啡堿合成代謝途徑提供分子證據(jù)，從而實(shí)現(xiàn)茶樹咖啡堿的有效靶標(biāo)。

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當(dāng)轉(zhuǎn)發(fā)模式為GSF時(shí),雷區(qū)中心位置和比例因子均為空。當(dāng)轉(zhuǎn)發(fā)模式為GSF時(shí),需利用雷區(qū)轉(zhuǎn)發(fā)數(shù)據(jù)包,進(jìn)而平衡網(wǎng)絡(luò)負(fù)載。因此,對(duì)凸包H進(jìn)行相似變換,且從凸包H內(nèi)隨機(jī)選擇中心位置,而比例因子ξ的定義如式(6)所示:

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（責(zé)任編輯：蔣文倩）

2016-09-06

S571.1

A

1006-5768（2016）04-0177-08