• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    一株高產納豆激酶菌株的鑒定與分析

    2016-10-11 01:27:49王雪妍孫玉飛馮菲陳曉飛李鋒周伏忠
    生物技術通報 2016年1期
    關鍵詞:納豆亞種枯草

    王雪妍 孫玉飛 馮菲 陳曉飛 李鋒 周伏忠

    (河南省科學院生物研究所有限責任公司 河南省微生物工程重點實驗室,鄭州 450008)

    一株高產納豆激酶菌株的鑒定與分析

    王雪妍 孫玉飛 馮菲 陳曉飛 李鋒 周伏忠

    (河南省科學院生物研究所有限責任公司 河南省微生物工程重點實驗室,鄭州 450008)

    鑒定高產納豆激酶菌株Td,分析納豆激酶的分子特征。利用菌體形態(tài)、生理生化特征、以及分子生物學方法對菌株Td進行鑒定;并采用MALDI-TOF質譜測定與分析、SDS-PAGE和纖溶活性測定等方法檢測納豆激酶特性,利用PCR方法擴增納豆激酶的基因全長。結合菌體形態(tài)、生理生化特征和16S rDNA、gyrA基因序列、DNA-DNA雜交率等實驗結果,鑒定菌株Td為枯草芽孢桿菌枯草亞種(Bacillus subtilis subsp. subtilis);菌株Td發(fā)酵產生的納豆激酶產量可達300 mg/L以上,占發(fā)酵液總蛋白的40%以上;纖溶活性達230 U/mL以上;氨基酸序列與subtilisin E的序列相似性最高;基因全長序列為1 143 bp??莶菅挎邨U菌枯草亞種Td是一株高產、高活性納豆激酶的產生菌,具有優(yōu)良的工業(yè)化開發(fā)價值。

    枯草芽孢桿菌枯草亞種;納豆激酶;菌株鑒定

    納豆激酶(Nattokinase,NK)是由枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)代謝產生的一種絲氨酸蛋白酶,是目前國內外研究和開發(fā)溶栓藥物的熱點[1]。產生納豆激酶的菌種大多來源于日本納豆或中國豆豉等傳統(tǒng)的發(fā)酵食品經篩選獲得,這些篩選方法是建立在纖溶活性基礎上的,如纖維平板法和纖維降解法[2],然而有很多類似的酶具有相同的纖溶活性,如subtilisin DJ-4、subtilisin DFE和纖溶酶BSF1[3-5],對納豆激酶產生菌的篩選帶來了干擾。納豆激酶的基因aprN,在這些纖溶活性的酶中具有專一性[6],因此,采用PCR方法檢測納豆激酶基因和測定纖溶活性兩者相結合的方法為一種高效篩選獲得納豆激酶產生菌的途徑,幾乎未檢索到這方面的報道。

    目前納豆激酶發(fā)酵活性或產量不高,阻礙了產業(yè)化開發(fā)進程。近年來通過基因工程手段,研究人員獲得了一些納豆激酶的基因工程菌種,但酶活力或產量也并不理想。在基因水平上,納豆激酶產生菌(納豆菌)的基因組信息獲得了解析并已經公開發(fā)表[7],因此,從分子水平上對納豆激酶進行研究奠定了基礎。各國學者對納豆激酶發(fā)酵工藝[8-10]、分離純化技術[11]、高產菌株誘變與選育[12]以及納豆激酶代謝動力學和作用機理等[13,14]諸多方面進行了大量研究,獲得許多較為重要的進展。同時繼續(xù)尋找不同來源的納豆激酶高產菌,以得到具有工業(yè)化潛在應用價值的新菌株,也越來越受到人們的關注。本課題組經多年的研究,從發(fā)酵豆制品中選育出1株納豆激酶高產菌株,前期對納豆激酶酶學性質、發(fā)酵培養(yǎng)、分離純化及體外溶栓特性等方面進行過研究[15-17],現(xiàn)在正進行納豆激酶保健產品的開發(fā)和應用研究。然而,前期的工作未對納豆激酶和菌株名稱進行確切的鑒定,一直是以測定纖溶活性這種傳統(tǒng)方法為基礎進行研究的。本研究擬利用檢測納豆激酶分子(蛋白和基因)與測定纖溶活性相結合的方法對納豆激酶進行鑒定,同時結合分子生物學方法將該高產菌株的名稱定名到亞種的水平,旨在為產納豆激酶菌株的鑒定提供借鑒和參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 供試樣品 分離菌株的樣品分別來源于中國傳統(tǒng)食品自然發(fā)酵的豆豉;枯草芽孢桿菌枯草亞種(B. subtilis subsp. subtilis)168菌株來自于中國普通微生物菌種保藏管理中心。

    1.1.2 主要試劑 凝血酶、人纖維蛋白原均購自中國藥品生物制品檢定所;酵母粉、胰蛋白胨為Oxoid公司產品;其他試劑均為國產分析純試劑。

    1.1.3 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基:酵母粉5 g/L,胰蛋白胨10 g/L,NaCl 10 g/L,pH7.2(固體加1.5%瓊脂粉);發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖5 g/L,蛋白胨10 g/L,酵母粉5 g/L,NaCI 5 g/L,pH值7.2-7.4。

    1.2 方法

    1.2.1 菌種的分離純化 用無菌牙簽挑取少量豆豉表面的黏性物質,接種到10 mL無菌水的試管中充分攪拌,制成懸濁液。取少量懸濁液,涂布在LB培養(yǎng)基平板上,待風干后倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-24 h,挑取平板上長出的有皺褶的白色菌落,鏡檢觀察。繼續(xù)劃線純化1次,挑取單菌落,保存于LB培養(yǎng)基斜面上。

    1.2.2 纖溶活性測定 采用纖維蛋白平板法測定納豆激酶活性[18]。將分離獲得的不同菌株接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中于37℃下振蕩培養(yǎng)過夜,發(fā)酵液8 000 r/min離心5 min得到上清粗酶液。取粗酶液10 μL點于纖維蛋白平板上,倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h后測量透明圈直徑,計算納豆激酶的纖溶活性,篩選獲得活性最高的菌株,編號為Td。

    1.3 菌株鑒定

    1.3.1 菌株形態(tài)及生理生化特性測定 觀察高產菌株Td的菌落和菌體形態(tài),參照《常見細菌鑒定手冊》并與枯草芽孢桿菌枯草亞種168對比進行生理生化鑒定試驗[19]。

    1.3.2 分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹構建 參照《分子克隆實驗指南》描述的方法提取菌株Td的基因組DNA[20]。分別應用16S引物(27F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3';1492R:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')和解旋酶gyrA引物(gyrA-42F:5'-CAGTCAGGAA ATGCGTACGTCCTT-3';gyrA-1066R:5'-CAAGGTAATGCTCCAGGCATTGCT-3')進行PCR擴增[21],目的產物純化后由北京華大基因有限公司進行測序。將獲得的16S rDNA和gyrA序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對,確定與其親緣關系最近的屬種,并從數(shù)據(jù)庫下載獲得相關種屬的gyrA基因序列,構建系統(tǒng)發(fā)育樹。序列比對用ClustalX 2.1進行,系統(tǒng)進化樹的構建采用MEGA 5.0軟件進行,應用Neighbour-Joining方法進行bootstrap分析,重復次數(shù)為1 000。

    1.3.3 基因組DNA-DNA雜交分析 根據(jù)上述方法提取菌株Td和菌株168的基因組DNA,用儀器DU800進行DNA-DNA雜交分析。通過超聲斷裂法(400 W,2 s,6次)剪切基因組DNA,使DNA片段在1 000-2 000 bp之間。將剪切過的DNA用 0.1×SSC精確配置成OD260為1.5-2.0。取Td、168(分別標記為a,b)各300 μL及兩者各150 μL的混合物(標記為m),分別加到1.5 mL離心管中,于沸水浴中變性10 min,并用預熱的槍頭吸取75 μL預熱的10×SSC溶液加入變性樣品中,吹打混勻,使終濃度為2×SSC,固定溫度為最適復性溫度(Tor),以2×SSC為空白對照,復性45 min,在260 nm波長下,每隔25 s測一次吸光值,作出復性曲線,計算復性速率Va、Vb、Vm,并用下式計算DNA-DNA雜交度D%=[4Vm-(Va+Vb)]/2(VaVb)1/2。

    1.4 納豆激酶的鑒定

    1.4.1 SDS-PAGE凝膠電泳檢測納豆激酶產量 配制濃度為5%濃縮膠、12%分離膠的聚丙烯酰胺凝膠用于納豆激酶產量的SDS-PAGE分析,每個點樣孔加入1.2.2中描述的發(fā)酵液16 μL進行電泳。電泳完畢后對凝膠用考馬斯亮藍R-250染色蛋白質條帶,使用quantity one軟件對蛋白進行定量分析。

    1.4.2 MALDI-TOF質譜分析鑒定納豆激酶 將菌株Td培養(yǎng)得到的發(fā)酵液進行SDS-PAGE電泳分離,切膠回收目的大小的條帶,用胰蛋白酶(Trypsin)進行膠內酶切處理來進行MALDI-TOF質譜分析。獲得的肽質量指紋圖譜應用MASCOT 2.0軟件進行NCBI蛋白質數(shù)據(jù)庫的檢索分析。

    1.4.3 納豆激酶基因的克隆 根據(jù)1.4.2的結果,并參照GenBank公布的納豆激酶基因來設計一對引物,序列分別為F:5'-TCAGCATAATGAACATTTACTCA -3'和R:5'-GGTTGATCCTCCGGTGCTTGTGA-3'。參照1.3.2中方法提取菌株Td基因組DNA為模板進行PCR擴增納豆激酶基因。PCR反應體系(50 μL):10×rTaq Reaction Buffer 5 μL,rTaq DNA聚合酶2.5 U,上下游引物(10 mmol/L)各2 μL,10 mmol/L dNTPs 3 μL,補足ddH2O至50 μL。反應條件:94℃預變性5 min后進入循環(huán),94℃ 50 s,56℃ 40 s,72℃2 min,循環(huán)30次,最后72℃延伸10 min。PCR產物經純化后連接到質粒pMD18-T載體上,連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞,堿裂解法提取大腸桿菌轉化子質粒。經酶切鑒定后,將驗證為陽性的重組質粒送至北京華大基因有限公司進行序列測定。

    2 結果

    2.1 納豆激酶高產菌株的篩選

    從供試樣品中共分離得到18株菌株,將篩選得到的菌株經過再次純化、發(fā)酵培養(yǎng),用纖維蛋白法測其納豆激酶的活性大小。根據(jù)在纖維蛋白原平板上產生透明圈的大?。▓D1),最終確定1號菌株為高產菌株,編號為Td。

    圖1 不同菌株發(fā)酵液的纖溶活性

    2.2 菌種鑒定

    2.2.1 菌株形態(tài)與生理生化反應 在LB培養(yǎng)基平板上于37℃恒溫培養(yǎng)24 h后,菌株Td的菌落呈圓形,表面粗糙有皺褶、微突起、邊緣不整齊、無光澤、呈乳白或灰白色,菌落直徑3-4 mm。顯微鏡下觀察菌體呈桿狀,單個或鏈狀排列,大?。?.0-3.0)μm×(0.6-0.8)μm,有鞭毛,能運動,芽孢呈橢圓或柱狀。

    以標準菌株168作為對照菌株,與菌株Td共同進行生理生化特性的試驗。結果(表1)表明,菌株Td與菌株168生理生化特性相同,因此可以確定菌株Td符合芽孢桿菌屬(Bacillus)的特征。

    表1 菌株Td與菌株168的生理生化特性

    2.2.2 分子鑒定與系統(tǒng)發(fā)育樹 根據(jù)16S rDNA序列的測定結果,與GenBank 中已經登錄的序列進行BLAST檢索比對,結果顯示菌株Td的16S rDNA與芽孢桿菌屬(Bacillus)不同種具有高度相似,同源性高達99%以上;而基因gyrA進行BLAST檢索比對結果表明,與枯草芽孢桿菌枯草亞種(B. subtilis subsp. subtilis)的相似性最高,達100%。根據(jù)BLAST檢索結果,篩選芽孢桿菌屬相關物種的gyrA基因序列與供試菌株Td的序列進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構建。結果(圖2)表明,菌株Td與枯草芽孢桿菌枯草亞種聚為一個分支上,而與其他物種相距較遠。

    圖2 芽孢桿菌屬部分菌種的gyrA基因系統(tǒng)發(fā)育樹(括號內數(shù)字表示GenBank的登錄號)

    2.2.3 DNA-DNA雜交分析 經DU-800測定與分析,根據(jù)表2的結果,計算菌株Td與標準菌株168的復性速率為Va=0.002 7和Vb=0.002 3,混合樣品的復性速率Vm=0.002 4,代入雜交率計算公式得出菌株Td與標準菌株168的DNA雜交率D%=92.3%,顯著高于80%的閾值,因此可以確定兩者為同一個亞種。

    綜合形態(tài)特征和分子鑒定的結果,鑒定菌株Td為枯草芽孢桿菌枯草亞種。

    2.3 納豆激酶的活性與鑒定

    2.3.1 納豆激酶的溶解纖維蛋白活性 納豆激酶活性越高,在纖維蛋白平板上的透明圈直徑則越大。根據(jù)活性測定結果(圖1),Td產生的透明圈明顯比其它菌株的大,因此菌株Td產生的納豆激酶活性最高,纖溶活性達237 U/mL。

    2.3.2 SDS-PAGE電泳分析 菌株Td發(fā)酵液進行SDS-PAGE凝膠電泳的結果(圖3-A)顯示,泳道中的蛋白質雜質譜帶較少,其中有1條明顯較亮的蛋白質譜帶。與標準分子量蛋白比較和計算,得出此條帶的蛋白分子量大小約為27 kD;應用quantity one軟件計算蛋白產量可達300 mg/L,占總蛋白的40%以上。

    表 2 DNA樣品a、b、m的復性速率

    圖3 納豆激酶的SDS-PAGE和PCR擴增基因的電泳圖

    2.3.3 MALDI-TOF質譜分析 從圖3-A凝膠中挖取最亮的蛋白質條帶采用胰蛋白酶進行膠內酶切后用于MALDI-TOF分析。根據(jù)肽質量指紋譜和數(shù)據(jù)庫檢索結果,MASCOT 值最高達150,與枯草芽孢桿菌的蛋白酶Subtilisin E相似性最高;驗證了7條序列,分別為:GAYSLSLR、GFFLFVEGGR、GSSIFGLAPGK、SSGTSYPDVLK、VCNYVSWIK、GSSIFGLAPGK、LNTLETEEWFFK,這與納豆激酶的序列完全相同。

    2.3.4 納豆激酶的基因序列 根據(jù)PCR擴增條帶(圖3-B)和基因序列測定(圖4)結果,獲得了菌株Td的納豆激酶全基因序列。菌株Td的納豆激酶基因全長為1 143 bp,以GTG 為起始密碼子,起始密碼子上游 -17- -11 bp位點為核糖體結合位點SD 序列,SD序列上游是A/T含量高達72%的轉錄調控區(qū)域。隨后是由1 143 bp組成的開放閱讀框架,編碼379個氨基酸,其中氨基酸序列的前27個氨基酸為信號肽序列,隨后的77個氨基酸為前導肽序列,最后的275個氨基酸為成熟肽?;虻?'末端是3個連續(xù)的終止密碼子TAA、TAG 和TAA,轉錄終止序列位于成熟蛋白區(qū)域C端下游7 bp處,該段終止序列可形成莖環(huán)結構,即ρ因子非依賴性終止序列。

    3 討論

    納豆激酶(nattokinase)是枯草芽孢桿菌產生的一種胞外絲氨酸蛋白激酶,在血栓、血脂、血壓、抗癌、糖尿病等方面均有預防和治療的功能,已為國際社會所接受,但是對其產生菌的定名卻存在爭議。目前已經發(fā)表的文章采用的納豆枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis subsp. natto)或枯草芽孢桿菌納豆亞種(Bacillus subtilis subsp. natto),嚴格意義上來說并非一個合法有效的名稱,只是人們的傳統(tǒng)習慣命名。目前有效發(fā)表的枯草芽孢桿菌有3個亞種,分別為B. subtilis subsp. subtilis、B. subtilis subsp. spizizenii和B. subtilis subsp. inaquosorum,已為研究人員所接受[22]。本研究也遵從此命名法,認為定名為枯草芽孢桿菌枯草亞種(Bacillus subtilis subsp. subtilis)較為適宜。

    枯草芽孢桿菌及其近緣種群(簡稱枯草群)是一群表型相似的革蘭氏陽性、產芽孢的桿菌,但是單一的鑒定技術不能完全勝任枯草群菌株的鑒定,特別是通過生理生化等表型特征分析的方法。雖然16S rDNA基因序列廣泛應用于細菌鑒定或構建細菌的系統(tǒng)進化關系,但對于枯草群的菌種由于序列間的相似度太高而不能有效區(qū)分開來,因此通過表型特性和16S rDNA序列分析將菌株鑒定到種缺乏有力的證據(jù)。近年來研究者發(fā)現(xiàn)以編碼蛋白的基因作為系統(tǒng)發(fā)育鑒定標記可以彌補16S rDNA基因的不足,如gyrA基因、gyrB基因、ropD基因等[23,24]。Rooney 等[21]利用gyrA 基因研究了枯草芽孢桿菌種間的復雜性發(fā)現(xiàn),枯草芽孢桿菌的不同菌株間存在很大的差異;可以基于gyrA 基因的差異分為不同的群。本研究結果顯示,單獨利用gyrA 基因進行BLAST 搜索時,所獲信息主要是Rooney 等登錄的信息,利用這些信息構建系統(tǒng)發(fā)育樹時,可以發(fā)現(xiàn)菌株Td與已知菌株間的親緣關系,因此根據(jù)NCBI上登錄的gyrA 基因信息來鑒定枯草芽孢桿菌是可行的。

    圖4 菌株Td的納豆激酶基因及編碼蛋白質序列

    應用全基因組DNA雜交方法作為公認的標準來劃分細菌的種已為廣大分類學家所接受,并且普遍認為,細菌種內DNA-DNA雜交同源性為60%-100%;80%-90%以上的雜交同源性屬于種內同一亞種水平;60%-70%以上的雜交同源性屬于種內不同亞種水平;而20%-60%的同源性則代表著待定菌株是與參比菌株靠近的種。本研究中菌株Td與枯草芽孢桿菌枯草亞種標準菌株168的DNA-DNA雜交同源性達到了92.3%,顯著高于同一亞種的DNA雜交同源性標準;同時參照16S rDNA和gyrA的基因序列信息,因此將菌株Td定名為枯草芽孢桿菌枯草亞種。

    納豆激酶的名稱最初命名為BSP[25],隨后改為subtilisin NAT[6]。比較納豆激酶的氨基酸序列與其他幾種枯草桿菌蛋白酶發(fā)現(xiàn)它們有較高的同源性,與枯草桿菌蛋白酶E(Subtilisin E)的同源性達到99.5%,與枯草桿菌蛋白酶amylosacchariticus、subtilisin BPN和subtilisin Carlsberg的同源性也分別達到99.3%、86%和72%[6]。本研究應用MALDITOF質譜分析獲得的結果與subtilisin E相似性最高,這可能與兩者序列高度相似有關。利用PCR克隆獲得的納豆激酶全基因序列推導出的氨基酸序列也與已報道的納豆激酶的氨基酸序列完全一致。通過對菌株Td發(fā)酵液進行SDS-PAGE測定納豆激酶的分子量大小、MALDI-TOF分析氨基酸序列特征和PCR克隆全基因序列,三者取得了一致的結果,相互印證了納豆激酶的氨基酸和核酸序列,為鑒定納豆激酶提供了依據(jù)。另外,本研究成功地克隆了納豆激酶全長基因,這為下一步的基因工程菌株的構建和納豆激酶的活性改造奠定了基礎。

    4 結論

    根據(jù)菌體形態(tài)、生理生化特征和16S rDNA、gyrA基因序列、DNA-DNA雜交率等實驗結果,鑒定菌株Td為枯草芽孢桿菌枯草亞種(Bacillus subtilis subsp. subtilis);通過MALDI-TOF質譜分析和PCR克隆基因,鑒定了菌株Td產生的納豆激酶的分子特征;SDS-PAGE和纖溶活性測定表明菌株Td是一株高產納豆激酶菌株。

    [1]Sumi H, Hamada H, Tsushima H, et al. A novel fibrinolytic enzyme(nattokinase)in the vegetable cheese Natto:a typical and popular soybean food in the Japanese diet[J]. Experientia, 1987, 43(10):1110-1111.

    [2]Ku TW, Tsai RL, Pan TM. A simple and cost-saving approach to optimize the production of subtilisin NAT by submerged cultivation of Bacillus subtilis Natto[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2009, 57(1), 292-296.

    [3]Choi NS, Chang KT, Jae MP, et al. Cloning, expression, and fibrin(ogen)olytic properties of a subtilisin DJ-4 gene from Bacillus sp. DJ-4[J]. FEMS Microbiology Letters, 2004, 236(2):325-331.

    [4]Peng Y, Yang XJ, Xiao L, et al. Cloning and expression of a fibrinolytic enzyme(subtilisin DFE)gene from Bacillus amyloliquefaciens DC-4 in Bacillus subtilis[J]. Research in Microbiology, 2004, 155(3):167-173.

    [5]Agrebi R, Haddar A, Hmidet N, et al. BSF1 fibrinolytic enzyme from a marine bacterium Bacillus subtilis A26:purification, biochemical and molecular characterization[J]. Process Biochemistry, 2009,44(11):1252-1259.

    [6]Nakamura T, Yamagata Y, Ichishima E. Nucleotide sequence of the subtilisin NAT gene, aprN, of Bacillus subtilis(natto)[J]. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 1992, 56(11):1869-1871.

    [7]Nishito Y, Osana Y, Hachiya T, et al. Whole genome assembly of a natto production strain Bacillus subtilis natto from very short read data[J]. BMC Genomics, 2010, 11:243-254.

    [8]周伏忠, 賈蘊莉, 陳國參, 等. 纖溶酶高產菌株篩選及其液體發(fā)酵條件研究[J]. 河南科學, 2008, 26(1):125-130.

    [9]熊迎新, 尹宗寧, 李婉宜. 納豆激酶固體淺盤發(fā)酵工藝的優(yōu)化[J]. 中國生化藥物雜志, 2005(5):15-17.

    [10]Cho YH, Song JY, Kim KM, et al. Production of nattokinase by batch and fed-batch culture of Bacillus subtilis[J]. New Biotechnology, 2010, 27(4):341-346.

    [11]Wang C, Du M, Zheng D, et al. Purification and characterization of nattokinase from Bacillus subtilis natto B-12[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2009, 57(20):9722-9729.

    [12] Chen PT, Chao YP. Enhanced production of recombinant nattokinase in Bacillus subtilis by the elimination of limiting factors[J]. Biotechnology Letters, 2006, 28(19):1595-1600.

    [13] Kim JY, Gum SN, Paik JK, et al. Effects of nattokinase on blood pressure:a randomized, controlled trial[J]. Hypertension Research, 2008, 31(8):1583-1588.

    [14] Yang NC, Chou CW, Chen CY, et al. Combined nattokinase with red yeast rice but not nattokinase alone has potent effects on blood lipids in human subjects with hyperlipidemia[J]. Asia Pacific Journal of Clinical Nutrition, 2009, 18(3):310-317.

    [15] 陳曉飛, 杜迅, 劉安邦, 等. 納豆激酶酶學性質的初步研究[J].河南科學, 2008(10):1212-1214.

    [16]陳曉飛, 周伏忠, 陳國參, 等. 納豆激酶的分離純化及體外溶栓特性研究[J]. 大豆科學, 2010, 29(2):295-298.

    [17]陳曉飛, 周伏忠, 陳國參, 等. 納豆激酶酶學性質研究[J].河南科學, 2010, 28(1):41-43.

    [18]Astrup T, Mullertz S. The fibrin plate method for estimating fibrinolytic activity[J]. Archive of Biochemistry and Biophysics. 1952, 40(2):346-351.

    [19]東秀珠, 蔡妙英. 常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[M]. 北京:科學出版社, 2001.

    [20]薩姆布魯克, 拉塞爾著;黃培堂, 等譯. 分子克隆實驗指南[M].第3版. 北京:科學出版社, 2008.

    [21]Rooney AP, Price NPJ, Ehrhardt C, et al. Phylogeny and molecular taxonomy of the Bacillus subtilis species complex and description of Bacillus subtilis subsp. inaquosorum subsp. nov. [J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2009, 59:2429-2436.

    [22]曹鳳明, 楊小紅, 馬鳴超, 等. 枯草芽孢桿菌近緣種群鑒定方法研究進展[J]. 微生物學通報, 2014, 41(5):968-974.

    [23]Chun J, Bae KS. Phylogenetic analysis of Bacillus subtilis and related taxa based on partial gyrA gene sequence[J]. Antonie Van Leeuwenhoek International Journal of General and Molecular Microbiology, 2000, 78(2):123-127.

    [24]Yamamoto S, Harayama S. Phylogenetic relationships of Pseudomonas putida strains deduced from the nucleotide sequences of gyrB, rpoD and 16S rRNA genes[J]. International Journal of Systematic Bacteriology, 1998, 48:813-819.

    [25]Kamata H, Yamagata Y, Nakamura, et al. Characterization of the complex between a macroglobulin and a serine proteinase from Bacillus natto[J]. Agricultural and Biological Chemistry, 1989,53:2695-2702.

    (責任編輯李楠)

    Identification and Analysis of a Nattokinase-producing Strain

    WANG Xue-yan SUN Yu-fei FENG Fei CHEN Xiao-fei LI Feng ZHOU Fu-zhong
    (Institute of Biology Co.,Ltd.,Henan Academy of Sciences,Key Laboratory of Microbial Engineering of Henan Province,Zhengzhou 450008)

    The objective of this work is to identify an isolate Td of yielding high nattokinase, and to analyze the molecular characteristics of its nattokinase. The morphologic, biochemical and physiological characterizations, and molecular biological methods were used to identify the taxonomic position of isolate Td;mass spectrometric determination and analysis of MALDI-TOF, SDS-PAGE and fibrinolytic activity were employed to measure the characteristics of nattokinase, and PCR method was adopted to clone the full length of nattokinase gene. The bacterial strain Td was identified as Bacillus subtilis subsp. subtilis according to the results of morphologic, biochemical and physiological characterizations, as well as 16S rDNA, the sequences of 16S rDNA gyrA, hybrid rate of DNA-DNA. The yield of nattokinase produced by strain Td reached 300 mg/L, accounted for over 40% of the total protein. Fibrinolytic activity was over 230 U/mL. Amino acid sequence of nattokinase produced by Td showed the highest similarity to the subtilisin E. and the full length of the gene was 1143 bp. Conclusively, as a high-yield and high-activity strain for nattokinase, B. subtilis subsp. subtilis Td is a promising candidate for industrial development and utilization.

    Bacillus subtilis subsp. subtilis;nattokinase;strain identification

    10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.030

    2015-05-06

    河南省重點實驗室建設專項項目(122300413214),河南省重點科技攻關項目(142102210087),鄭州市攻關計劃項目(141PPTGG415)資助項目。

    王雪妍,女,研究方向:微生物發(fā)酵工程;E-mail:1060877396@qq.com

    李鋒,男,博士,研究方向:微生物技術與應用;E-mail:lifengac@126.com

    猜你喜歡
    納豆亞種枯草
    A comprehensive review on the chemical constituents,sesquiterpenoid biosynthesis and biological activities of Sarcandra glabra
    亞沉茶漬亞洲亞種Lecanora subimmersa subsp. asiatica Zahlbr.的訂正研究
    盤羊新亞種
    ——和田盤羊
    枯草芽孢桿菌在養(yǎng)雞生產中的應用
    湖南飼料(2021年4期)2021-10-13 07:32:46
    歲末
    揚子江(2019年3期)2019-05-24 14:23:10
    納豆改變命運 養(yǎng)生成就人生
    納豆改變命運養(yǎng)生成就人生
    納豆改變命運 養(yǎng)生成就人生
    納豆改變命運 養(yǎng)生成就人生
    大西洋鮭殺鮭氣單胞菌無色亞種的分離鑒定和致病性研究
    成人国产一区最新在线观看| 国产精品九九99| 欧美在线黄色| 亚洲成人免费av在线播放| 国产野战对白在线观看| 一区二区三区激情视频| 国产一区二区三区视频了| 亚洲精品一区av在线观看| 757午夜福利合集在线观看| 激情视频va一区二区三区| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 亚洲全国av大片| 美女福利国产在线| 亚洲 欧美一区二区三区| 搡老乐熟女国产| 我的亚洲天堂| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 窝窝影院91人妻| 91九色精品人成在线观看| 无限看片的www在线观看| 亚洲一区中文字幕在线| 欧美不卡视频在线免费观看 | 一本大道久久a久久精品| 好男人电影高清在线观看| 欧美最黄视频在线播放免费 | 又紧又爽又黄一区二区| 欧美国产精品va在线观看不卡| 日韩精品中文字幕看吧| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 亚洲成人久久性| 国产av在哪里看| 国产xxxxx性猛交| 男人舔女人下体高潮全视频| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 国产亚洲精品久久久久5区| 极品人妻少妇av视频| 国产1区2区3区精品| 丰满饥渴人妻一区二区三| 免费av毛片视频| 又大又爽又粗| 91大片在线观看| 一级黄色大片毛片| 欧美黑人欧美精品刺激| 国产欧美日韩一区二区精品| 成人精品一区二区免费| 亚洲成人免费av在线播放| 香蕉丝袜av| 极品人妻少妇av视频| 9191精品国产免费久久| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 久久草成人影院| 无限看片的www在线观看| 免费看a级黄色片| 男女做爰动态图高潮gif福利片 | 国产成人av教育| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 欧美一区二区精品小视频在线| 天堂√8在线中文| 午夜免费激情av| svipshipincom国产片| 成年版毛片免费区| 亚洲片人在线观看| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 最近最新免费中文字幕在线| 日韩欧美在线二视频| 日韩免费高清中文字幕av| 亚洲国产精品999在线| 久久人妻熟女aⅴ| 色综合欧美亚洲国产小说| 超碰成人久久| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 精品福利永久在线观看| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 亚洲精品在线观看二区| 亚洲av熟女| 校园春色视频在线观看| 国产精品98久久久久久宅男小说| 十八禁网站免费在线| 成人黄色视频免费在线看| xxxhd国产人妻xxx| 97碰自拍视频| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 伦理电影免费视频| 欧美+亚洲+日韩+国产| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 国产亚洲欧美精品永久| 天堂俺去俺来也www色官网| 18禁国产床啪视频网站| 99热只有精品国产| 天堂中文最新版在线下载| 大码成人一级视频| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 精品国产美女av久久久久小说| 日韩大码丰满熟妇| 国产精品野战在线观看 | 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 激情在线观看视频在线高清| 久久中文看片网| 欧美成狂野欧美在线观看| 亚洲 欧美一区二区三区| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 日本a在线网址| av网站在线播放免费| 97人妻天天添夜夜摸| 最好的美女福利视频网| 亚洲国产精品999在线| 亚洲免费av在线视频| 91国产中文字幕| 国产亚洲欧美精品永久| netflix在线观看网站| 国产精品免费视频内射| 欧美日韩亚洲高清精品| 乱人伦中国视频| 国产一卡二卡三卡精品| 岛国视频午夜一区免费看| 国产亚洲精品久久久久5区| 青草久久国产| 国产精品国产av在线观看| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 日本a在线网址| 高清黄色对白视频在线免费看| 久久久国产成人免费| 日本三级黄在线观看| 最新美女视频免费是黄的| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| ponron亚洲| 国产一卡二卡三卡精品| 国产亚洲精品久久久久5区| 三级毛片av免费| 精品久久蜜臀av无| 看黄色毛片网站| 老司机亚洲免费影院| 欧美亚洲日本最大视频资源| 男女做爰动态图高潮gif福利片 | 18禁国产床啪视频网站| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 国产精品偷伦视频观看了| 高潮久久久久久久久久久不卡| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 久久精品91无色码中文字幕| 亚洲中文日韩欧美视频| 成人三级黄色视频| 香蕉国产在线看| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 高潮久久久久久久久久久不卡| 日韩免费av在线播放| 丝袜美腿诱惑在线| xxx96com| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 99国产精品一区二区蜜桃av| 精品午夜福利视频在线观看一区| 激情视频va一区二区三区| 91成年电影在线观看| 老司机福利观看| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 久久久久久久午夜电影 | 精品乱码久久久久久99久播| 亚洲免费av在线视频| 国产精品1区2区在线观看.| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 老司机午夜十八禁免费视频| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 国产精品九九99| 91麻豆av在线| 精品国产亚洲在线| 成人免费观看视频高清| 久久伊人香网站| 热re99久久精品国产66热6| 日本黄色日本黄色录像| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 亚洲精品中文字幕在线视频| 日韩三级视频一区二区三区| 桃红色精品国产亚洲av| aaaaa片日本免费| 91老司机精品| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 无遮挡黄片免费观看| 亚洲av电影在线进入| 三级毛片av免费| 看免费av毛片| 天堂俺去俺来也www色官网| 两个人免费观看高清视频| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 在线观看日韩欧美| 伦理电影免费视频| 久热爱精品视频在线9| av在线播放免费不卡| 日本a在线网址| 大码成人一级视频| 不卡av一区二区三区| 国产不卡一卡二| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 久99久视频精品免费| 啦啦啦在线免费观看视频4| 纯流量卡能插随身wifi吗| 天堂√8在线中文| 久久久国产成人免费| 91老司机精品| 夜夜看夜夜爽夜夜摸 | 国产欧美日韩一区二区精品| 我的亚洲天堂| 亚洲成人久久性| 亚洲精品粉嫩美女一区| 久久久国产成人免费| 国产激情欧美一区二区| 男人舔女人的私密视频| 90打野战视频偷拍视频| 99久久国产精品久久久| 国产激情久久老熟女| 又黄又粗又硬又大视频| 国产高清激情床上av| 亚洲七黄色美女视频| 91九色精品人成在线观看| 成人国产一区最新在线观看| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 看免费av毛片| 波多野结衣av一区二区av| 亚洲七黄色美女视频| 欧美成人免费av一区二区三区| 久久国产精品影院| 日韩欧美三级三区| av福利片在线| 9191精品国产免费久久| 无遮挡黄片免费观看| 久久中文字幕人妻熟女| 两人在一起打扑克的视频| 国产精品野战在线观看 | 国产精华一区二区三区| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 国产精品亚洲一级av第二区| 18禁国产床啪视频网站| 久久精品亚洲av国产电影网| 久久午夜综合久久蜜桃| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 国产欧美日韩一区二区三| 中文欧美无线码| 亚洲av片天天在线观看| 国产男靠女视频免费网站| 亚洲av第一区精品v没综合| 久久久久国产一级毛片高清牌| 国产免费男女视频| 男女下面进入的视频免费午夜 | 新久久久久国产一级毛片| 日韩高清综合在线| 国产精品99久久99久久久不卡| 美女高潮到喷水免费观看| 免费av中文字幕在线| 日韩欧美国产一区二区入口| 亚洲人成电影免费在线| 丰满饥渴人妻一区二区三| 亚洲一码二码三码区别大吗| 无限看片的www在线观看| 成年人免费黄色播放视频| 多毛熟女@视频| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| av福利片在线| 国产成人欧美| 两性夫妻黄色片| 手机成人av网站| 国产av精品麻豆| 我的亚洲天堂| 亚洲av美国av| 黄色丝袜av网址大全| 久久久久亚洲av毛片大全| 在线观看午夜福利视频| 水蜜桃什么品种好| 亚洲七黄色美女视频| 久久久久久久久中文| 男女床上黄色一级片免费看| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 亚洲国产精品sss在线观看 | 日韩中文字幕欧美一区二区| 亚洲国产欧美一区二区综合| 亚洲av五月六月丁香网| 国产伦人伦偷精品视频| 久久影院123| 啦啦啦免费观看视频1| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 动漫黄色视频在线观看| 丝袜人妻中文字幕| av免费在线观看网站| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 男女床上黄色一级片免费看| 高清在线国产一区| 精品国产一区二区三区四区第35| 国产97色在线日韩免费| 亚洲伊人色综图| 午夜精品在线福利| 超碰97精品在线观看| av网站免费在线观看视频| 91精品国产国语对白视频| 国产成年人精品一区二区 | 黄色视频不卡| 成人影院久久| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 成年女人毛片免费观看观看9| 18禁观看日本| 99精品久久久久人妻精品| 女同久久另类99精品国产91| 69av精品久久久久久| 色综合婷婷激情| 亚洲熟妇中文字幕五十中出 | 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| xxx96com| 日本精品一区二区三区蜜桃| 色尼玛亚洲综合影院| 国产成人系列免费观看| 久久久久国产一级毛片高清牌| 国产av在哪里看| 女警被强在线播放| 超碰97精品在线观看| 18美女黄网站色大片免费观看| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 在线看a的网站| 咕卡用的链子| 欧美激情极品国产一区二区三区| 久久热在线av| 国产精品二区激情视频| 日韩大尺度精品在线看网址 | 亚洲一区二区三区欧美精品| 色婷婷久久久亚洲欧美| 大型av网站在线播放| 中文字幕高清在线视频| 色综合站精品国产| 亚洲色图综合在线观看| 五月开心婷婷网| 亚洲色图综合在线观看| 国产一区二区激情短视频| 黄色a级毛片大全视频| 免费av毛片视频| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 老司机福利观看| 亚洲少妇的诱惑av| 黄色片一级片一级黄色片| 999久久久精品免费观看国产| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 色综合欧美亚洲国产小说| 一边摸一边做爽爽视频免费| 啦啦啦 在线观看视频| 免费在线观看亚洲国产| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 18禁观看日本| 国产精品久久视频播放| 真人做人爱边吃奶动态| 在线观看一区二区三区激情| 中国美女看黄片| 日日夜夜操网爽| 亚洲美女黄片视频| 中文欧美无线码| 亚洲av片天天在线观看| 天堂√8在线中文| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 18美女黄网站色大片免费观看| 色综合婷婷激情| 宅男免费午夜| e午夜精品久久久久久久| 亚洲精品在线美女| 日韩欧美免费精品| 精品一区二区三区av网在线观看| 国产精品久久久av美女十八| 高清毛片免费观看视频网站 | 日韩欧美一区视频在线观看| 欧美精品一区二区免费开放| 在线观看一区二区三区激情| 久9热在线精品视频| 热re99久久精品国产66热6| 国产精品偷伦视频观看了| 在线观看www视频免费| 欧美乱妇无乱码| 999精品在线视频| 久久久国产成人免费| 午夜视频精品福利| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 日本五十路高清| 亚洲免费av在线视频| 最好的美女福利视频网| 成熟少妇高潮喷水视频| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| www.熟女人妻精品国产| 国产91精品成人一区二区三区| 久久人妻av系列| 天堂动漫精品| 久久 成人 亚洲| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 国产激情欧美一区二区| 黄色视频,在线免费观看| 又黄又粗又硬又大视频| 夜夜爽天天搞| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 十八禁人妻一区二区| 在线观看66精品国产| 午夜福利在线观看吧| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 午夜精品在线福利| 97碰自拍视频| 大码成人一级视频| 一进一出好大好爽视频| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 色综合站精品国产| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 满18在线观看网站| 欧美日韩精品网址| 十八禁人妻一区二区| 亚洲精品国产区一区二| 99在线视频只有这里精品首页| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| av片东京热男人的天堂| 精品一品国产午夜福利视频| 久久伊人香网站| 日韩欧美三级三区| 一区二区三区国产精品乱码| 一夜夜www| 国产乱人伦免费视频| 国产黄色免费在线视频| 亚洲熟女毛片儿| 久久香蕉激情| 亚洲成人免费av在线播放| 久久久国产一区二区| 国产欧美日韩一区二区三| 国产成人av激情在线播放| 国产一区二区激情短视频| 欧美乱码精品一区二区三区| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 欧美精品亚洲一区二区| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 精品久久久久久久久久免费视频 | 久久久久久久久免费视频了| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 精品电影一区二区在线| 91国产中文字幕| 女同久久另类99精品国产91| 狠狠狠狠99中文字幕| 亚洲 欧美一区二区三区| 一进一出好大好爽视频| 中文字幕色久视频| 日韩免费av在线播放| 欧美日韩视频精品一区| 国产精品亚洲一级av第二区| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 日韩精品青青久久久久久| 99在线视频只有这里精品首页| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 欧美乱码精品一区二区三区| 成人免费观看视频高清| av国产精品久久久久影院| 亚洲精品一二三| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 91老司机精品| 亚洲av片天天在线观看| 欧美激情极品国产一区二区三区| av国产精品久久久久影院| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 久久精品人人爽人人爽视色| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 国产欧美日韩精品亚洲av| 亚洲成a人片在线一区二区| 亚洲精品国产区一区二| 午夜精品在线福利| 麻豆成人av在线观看| 久久精品91无色码中文字幕| 九色亚洲精品在线播放| 人成视频在线观看免费观看| 岛国在线观看网站| 69av精品久久久久久| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 男女之事视频高清在线观看| 国产亚洲精品一区二区www| 成年人免费黄色播放视频| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 午夜免费观看网址| 在线播放国产精品三级| 国产一区在线观看成人免费| 国产亚洲欧美98| 免费看a级黄色片| 色婷婷av一区二区三区视频| 国产av在哪里看| x7x7x7水蜜桃| 欧美一区二区精品小视频在线| 久久香蕉激情| 久久久久久人人人人人| av福利片在线| 精品电影一区二区在线| 日本一区二区免费在线视频| 老熟妇仑乱视频hdxx| 国产熟女午夜一区二区三区| 一区二区三区激情视频| 嫁个100分男人电影在线观看| 一级黄色大片毛片| a在线观看视频网站| 嫩草影视91久久| 午夜久久久在线观看| 亚洲熟妇熟女久久| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 欧美成狂野欧美在线观看| 国产三级在线视频| 久久国产精品人妻蜜桃| 丝袜美腿诱惑在线| 日本黄色视频三级网站网址| 十分钟在线观看高清视频www| 亚洲激情在线av| 久久久久久久久中文| 久久久久久久久久久久大奶| 亚洲全国av大片| 午夜久久久在线观看| 亚洲精品粉嫩美女一区| 曰老女人黄片| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 国产又爽黄色视频| 亚洲 欧美一区二区三区| 最近最新中文字幕大全免费视频| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 女人被狂操c到高潮| 免费在线观看完整版高清| 亚洲国产欧美网| 免费看十八禁软件| 日韩精品青青久久久久久| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 欧美激情极品国产一区二区三区| 成年版毛片免费区| 三级毛片av免费| 黄色女人牲交| 中文字幕高清在线视频| 在线观看午夜福利视频| 新久久久久国产一级毛片| 久久午夜综合久久蜜桃| 香蕉丝袜av| 妹子高潮喷水视频| 国产区一区二久久| 久久中文看片网| 无限看片的www在线观看| 欧美乱妇无乱码| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 国产99久久九九免费精品| 国产成人精品无人区| 热re99久久精品国产66热6| 中文字幕色久视频| 免费高清视频大片| 美女国产高潮福利片在线看| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 丝袜美足系列| 十八禁人妻一区二区| 亚洲成人精品中文字幕电影 | 亚洲 国产 在线| 高清在线国产一区| 99国产综合亚洲精品| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 性欧美人与动物交配| 亚洲激情在线av| 午夜福利影视在线免费观看| 欧美日韩视频精品一区| 日韩精品免费视频一区二区三区| 久久久久久久久中文| 日韩大码丰满熟妇| 亚洲国产精品999在线| 好男人电影高清在线观看| 日韩欧美在线二视频| 久久久久久大精品| 日韩中文字幕欧美一区二区| 大码成人一级视频| 美女高潮到喷水免费观看| 麻豆成人av在线观看| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 宅男免费午夜| 老司机亚洲免费影院| 人人妻人人澡人人看| 国产91精品成人一区二区三区| 欧美乱色亚洲激情| 中文字幕人妻熟女乱码| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 亚洲午夜理论影院| 午夜精品在线福利| 久久亚洲精品不卡| 91精品国产国语对白视频| 日韩高清综合在线| 亚洲精品在线观看二区| 欧美成人免费av一区二区三区| 国产av一区二区精品久久| 国产99久久九九免费精品| 香蕉丝袜av| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 亚洲精华国产精华精| 超碰97精品在线观看| 国产极品粉嫩免费观看在线| 91成人精品电影| 夜夜夜夜夜久久久久| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 怎么达到女性高潮| 俄罗斯特黄特色一大片| 9热在线视频观看99| 嫁个100分男人电影在线观看| 自线自在国产av| 日本 av在线| 国产精品一区二区在线不卡| 亚洲精品美女久久av网站| 久久精品国产综合久久久| 亚洲国产看品久久| 一级,二级,三级黄色视频| 国产一区二区三区视频了| 无人区码免费观看不卡| 久久欧美精品欧美久久欧美| 成人三级做爰电影| 亚洲,欧美精品.| 最近最新中文字幕大全电影3 | 麻豆国产av国片精品| 国产精品久久久av美女十八| svipshipincom国产片|