日本結(jié)縷草‘膠東青’DREB2.2基因克隆及表達模式研究

可祥 農(nóng)鈞琇 石大林 馬禮鵬 李京 韋善君

（中央民族大學(xué)生命與環(huán)境學(xué)院，北京 100081）

日本結(jié)縷草‘膠東青’DREB2.2基因克隆及表達模式研究

可祥 農(nóng)鈞琇 石大林 馬禮鵬 李京 韋善君

（中央民族大學(xué)生命與環(huán)境學(xué)院，北京 100081）

DREB（dehydration responsive element binding protein）是植物中普遍存在的一類重要轉(zhuǎn)錄因子，參與植物逆境響應(yīng)和生長發(fā)育過程。以日本結(jié)縷草‘膠東青’為材料，克隆獲得了DREB2.2基因的編碼區(qū)序列，分析了該基因的生物信息學(xué)特征，通過半定量PCR技術(shù)檢測其逆境表達模式。測序結(jié)果表明，‘膠東青’DREB2.2 基因存在長、短兩個轉(zhuǎn)錄本。長轉(zhuǎn)錄本DREB2.2-L編碼區(qū)長1 067 bp，多含一個長50 bp的序列，閱讀框提前終止，僅推測編碼65個氨基酸。短轉(zhuǎn)錄本DREB2.2-S編碼區(qū)長1 017 bp，推測編碼338個氨基酸，蛋白質(zhì)分子量37.3 KD，等電點 pI為4.86，含有一個保守的AP2結(jié)構(gòu)域和核定位序列，屬于DREB亞家族A-2組成員。半定量PCR結(jié)果顯示，DREB2.2-S和DREB2.2-L在正常生長條件下有表達，低溫脅迫時表達量上調(diào)，脅迫2 h時最高，干旱脅迫2 h和24 h時輕度上調(diào)表達，高鹽脅迫下表達量無顯著變化。在相同條件下，DREB2.2-L的表達量均略高于DREB2.2-S。

日本結(jié)縷草‘膠東青’；轉(zhuǎn)錄因子；DREB；非生物逆境

結(jié)縷草（Zoysia Willd）隸屬于禾本科（Gramineae）畫眉草亞科（Eragrostoideae），是一種多年生C4型低矮草本植物，主要分布于亞洲和大洋洲。該屬植物的5個種，即日本結(jié)縷草（Zoysia japonica Steud.）、中華結(jié)縷草（Zoysia sinica Hance）、大穗結(jié)縷草（Zoysia macrostachya Franch. et Sav）、溝葉結(jié)縷草（Zoysia matrella）和細葉結(jié)縷草（Zoysia tenuifolia Willd. ex Trin）［1］，具有耐高溫和干旱、耐修剪、匍匐生長、耐踐踏的優(yōu)點，是開發(fā)作為草坪草的理想草種。目前在全球種植的結(jié)縷草品種有17個左右，廣泛用于運動場草場、公用綠地、家庭草坪、高爾夫球場果嶺和固沙保土草坪的建植。由于多變的自然環(huán)境，草坪的完整性和觀賞性常常受到低溫、干旱和鹽堿等非生物因素的威脅?？鼓鏅C制和抗逆育種研究仍然是結(jié)縷草育種工作的重要內(nèi)容之一。

近年來人們對模式植物擬南芥、水稻等植物材料的抗逆分子機制研究結(jié)果為結(jié)縷草的相關(guān)研究提供了參考。對擬南芥的研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子DREB（Dehydration responsive element binding protein）在逆境應(yīng)答中起重要作用。DREB屬于AP2超家族，包括6個亞組，即DREB1-DREB6，其中DREB1和DREB2與植物逆境響應(yīng)關(guān)系最密切，能特異結(jié)合啟動子中含有的DRE/CRT順式元件，激活許多逆境誘導(dǎo)基因的表達，增強植物對逆境的忍耐能力。其中，DREB1B/CBF1、DREB1C/CBF2和DREB1A/CBF3主要與低溫應(yīng)答相關(guān)［2-5］，DREB1D/CBF4主要參與干旱脅迫相應(yīng)［6］，而DREB1E/DDF2和DREB1F/DDF1主要參與鹽脅迫響應(yīng)［7］。DREB2組有8個基因，主要對干旱、高鹽和高溫脅迫響應(yīng)［8-11］。在其他多種植物中，包括水稻［12］、玉米［13］、大麥［14，15］、小麥［16］、油菜［17］等農(nóng)作物，黑麥草［18，19］、狗牙根［20］等草坪草，均克隆獲得了多個DREB1和DREB2基因，它們在基因序列和功能上都有不同程度的相似性。對同一物種不同種質(zhì)的比較研究結(jié)果表明，不同種質(zhì)之間抗逆能力差異與DREB1/CBFs和DREB2的基因結(jié)構(gòu)或表達差異相關(guān)。例如，玉米的ZmDREB2.7的表達與幼苗的抗旱性相關(guān)［13］；不同生態(tài)型擬南芥中，CBF2基因結(jié)構(gòu)和表達、CBFs基因調(diào)節(jié)子的表達差異與種質(zhì)抗寒能力差異相關(guān)［21-23］；大麥的一個CBF基因簇與耐凍和越冬性的遺傳位點FR-2的遺傳定位一致［15］；一粒小麥（Triticum monococcum）中含有11個CBF基因的基因簇被定位到 5號染色體的Fr-Am2抗凍位點上［16］；冬小麥中CBF14的拷貝數(shù)比春小麥的高［24］。結(jié)縷草作為一種多耐逆性的草種，其DREB基因與抗逆性的關(guān)系值得研究。

本研究以我國山東膠州灣的結(jié)縷草‘膠東青’變種為材料，克隆獲得到一個新DREB A-2亞組基因，分析該基因在低溫、干旱和高鹽脅迫下的表達調(diào)節(jié)，以期為結(jié)縷草DREB基因研究積累資料。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用植物材料為日本結(jié)縷草‘膠東青’變種（Zoysia japonica var. pallida cv Jiaodong），由青島海源草坪有限公司贈送。RNA 提取用 RNAPrep pure 植物總RNA提取試劑盒（北京天根生物工程公司），mRNA反轉(zhuǎn)錄用M-MLV（Progema），質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖DNA快速膠回收試劑盒和T-載體（pUMT）連接試劑盒均購自北京百泰克生物工程有限公司，PCR擴增用的普通PCR mix 和高保真的Pfu mix購自TaKaRa公司。試驗用引物均由上海生物工程有限公司合成，引物名稱及序列見表1。

表1 實驗用引物

1.2 方法

1.2.1 植物材料培養(yǎng)及逆境脅迫處理 從‘膠東青’草坪中采集匍匐莖段回溫室內(nèi)培養(yǎng)，基質(zhì)為營養(yǎng)土、珍珠巖和蛭石以2∶1∶1比例的混合物，培養(yǎng)溫度25℃-28℃，光周期14 h/d。室內(nèi)培養(yǎng)6月后，選取生長狀態(tài)良好、長勢基本一致的材料進行逆境處理，方法如下：

（1）低溫脅迫：材料轉(zhuǎn)到植物生長箱中培養(yǎng)，4℃恒溫，光周期14 h/d；（2）PEG模擬干旱脅迫：用PEG6000濃度為20%的營養(yǎng)液澆灌根部至流出溶液為培養(yǎng)基質(zhì)體積的兩倍以上，然后將培養(yǎng)缽放到托盤中，在托盤加淺層澆灌液，溫室內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)；（3）高鹽脅迫：用NaCl濃度為200 mmol/L的營養(yǎng)液澆灌根部，方法同PEG處理。

3種逆境脅迫時間分為2、24和72 h。以室溫培養(yǎng)的材料為低溫處理的對照，以澆灌營養(yǎng)液的材料為高鹽脅迫和PEG模擬干旱脅迫處理的對照。取對照和逆境處理材料上部第1-2展開葉，液氮速凍后貯存于-80℃冰箱中。

1.2.2 RNA的提取與cDNA的制備 將葉片在液氮中研磨，用植物總RNA 提取試劑盒提取RNA，電泳檢測RNA的完整性，用NanoDrop2000超微量分光光度計（美國Thermo公司）檢測RNA濃度。再以O(shè)ligo dT為引物，用M-MLV將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，具體操作按照說明書進行。以Actin1為內(nèi)標(biāo)基因，用其cDNA特異性引物Pactin-F和Pactin-R對cDNA 進行PCR擴增，檢測反轉(zhuǎn)錄效果。1.2.3 DREB2.2基因的克隆 以低溫脅迫2 h的cDNA 為模板，用引物P1、P2和 Pfu mix進行PCR擴增，產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠上電泳。回收DNA片段，連接到載體pUM-T上，并測序。對測序獲得的基因序列，用Conserved Domain Search Service（CD Search）工具（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/ cdd/wrpsb.cgi）預(yù)測其保守結(jié)構(gòu)域。蛋白質(zhì)的等電點、分子量和二級結(jié)構(gòu)用ExPASy網(wǎng)站相關(guān)軟件完成；亞細胞定位信息用PSORT Prediction（http：//psort.hgc. jp/）預(yù)測；蛋白模型用Built Model（http：//swissmodel. expasy.org/interactive）以及RaptorX（http：//raptorx. uchicago.edu/）工具預(yù)測。用DNA man 6.0制作基因的系統(tǒng)進化樹。

1.2.4 逆境脅迫下基因表達模式 以cDNA 為模板，先用Pactin-F和Pactin-R對內(nèi)標(biāo)基因進行23個循環(huán)的PCR擴增，產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳，確定條帶亮度基本一致時各處理的cDNA用量。然后以該用量的cDNA為模板，分別用引物PLF+PLS-R和PS-F+PLS-R組合，對各處理cDNA 進行31個循環(huán)的PCR擴增，產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳，比較各處理條帶亮度。

2 結(jié)果

2.1 RNA提取和反轉(zhuǎn)錄效果

提取的RNA電泳結(jié)果顯示，各樣品中28S和18S條帶清晰完整，兩條帶亮度比例為2∶1左右。用Nano Drop 2000超微量分光光度計檢測結(jié)果表明，各樣品RNA的A260/280比值均大于2，說明RNA無明顯的蛋白質(zhì)污染。對RNA進行反轉(zhuǎn)錄制備獲得的cDNA樣品，用Actin1的cDNA特異性引物進行PCR擴增，結(jié)果都產(chǎn)生了約450 bp左右的特異帶，說明所有樣品RNA反轉(zhuǎn)錄效果良好。

2.2 DREB2.2基因的克隆

以低溫處理2 h 樣品的cDNA 為模板，用DREB2.2基因特異性引物進行PCR擴增，獲得了1 000 bp左右的特異帶（圖1）。回收該條帶并克隆到pUM-T載體中。對10個可能重組子進行PCR鑒定，結(jié)果（圖2）顯示，有7個在1 000 bp附近均產(chǎn)生高亮度的特異帶，其中1號、6號和9號的條帶位置略低，4號、5號、8號和10號的條帶略高，推測PCR產(chǎn)物中可能存在兩種長短不同的轉(zhuǎn)錄本。選擇6號和9號、8號和10號重組子進行測序，結(jié)果（圖3）證實了我們的推測，前兩者克隆的核酸序列長1 017 bp，后兩者克隆的核酸序列從第75位堿基開始有50 bp的插入序列，總長1 067 bp。

2.2 DREB2.2基因的序列分析

本研究將DREB2.2的長、短轉(zhuǎn)錄本分別命名為DREB2.2-L和DREB2.2-S。由于含有50 bp的插入序列，DREB2.2-L的閱讀框提前終止，僅推測編碼65個氨基酸。DREB2.2-S有完整的閱讀框，推測編碼蛋白含338個氨基酸（圖3）。這兩個序列均已登錄到NCBI網(wǎng)站上，登錄號分別為KP676131 和KP676132。

圖1 DREB2.2基因的RT-PCR擴增

圖2 DREB2.2核酸片段與克隆載體重組子的PCR鑒定

圖 3 DREB2.2基因兩個轉(zhuǎn)錄本的序列比較

DREB2.2-S推測編碼的蛋白質(zhì)分子量37.3 kD，等電點 pI為4.86。氨基酸序列的疏水性/親水性分析結(jié)果表明，第24-33位氨基酸區(qū)域的親水性最強，疏水區(qū)域中，第156-164位氨基酸疏水性最強。氨基酸序列中18%為α-螺旋，5%為β-折疊，76%為無規(guī)則卷曲。第89-145位氨基酸構(gòu)成一個AP2結(jié)構(gòu)域（圖4-A），其三維模型與擬南芥ERF1A（At4g17500）中的AP2/ERF結(jié)構(gòu)域PDB2gcc：A的模型高度相似（P-value：2.94e-04）。亞細胞定位分析結(jié)果顯示，第23-32位氨基酸（PGRKKRPRRS）為細胞核定位序列（NLSs）。DREB2.2-S整體蛋白的結(jié)構(gòu)模型預(yù)測，見圖4-B。

在NCBI網(wǎng)站上進行蛋白BLAST分析結(jié)果（圖5）表明，與DREB2.2-S相似度最高的前5個基因分別來自高粱（Sorghum bicolor），谷子（Setaria italic）、玉米（Zea mays）、羊草（Leymus chinensis）和四倍體小麥硬粒亞種（Triticum turgidum subsp. Durum），它們與DREB2.2-S在核定位序列和AP2結(jié)構(gòu)域序列上高度相似，但在基因的C端差異較大。基因系統(tǒng)進化分析結(jié)果（圖6）顯示，DREB2.2-S被歸到A2亞組，與高粱、玉米、谷子中的同源基因遺傳距離較近。

2.3 DREB2.2在逆境脅迫下的表達變化

以Actin基因為內(nèi)標(biāo)，采用半定量PCR技術(shù)研究DREB2.2基因在低溫、干旱和高鹽脅迫下的表達變化。在相同cDNA用量條件下，Actin1基因進行了23個循環(huán)的擴增，DREB2.2-L和DREB2.2-S進行了31個循環(huán)的擴增。產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果（圖7）顯示，在正常生長條件下，DREB2.2-S和DREB2.2-L的擴增均獲得了比較亮的特異帶，說明兩者均為組成型較高水平表達。干旱脅迫2 h和24 h時，兩種序列均略受上調(diào)表達；低溫脅迫時，兩序列均受上調(diào)表達，脅迫2 h時表達量最高；在高鹽脅迫下，兩序列表達均無明顯響應(yīng)?？傮w上，相同條件下DREB2.2-L的條帶亮度均比DREB2.2-S的稍亮一些，說明前者的表達量略高

3 討論

結(jié)縷草作為一種多耐逆植物，其DREB基因結(jié)構(gòu)、功能和表達模式值得研究。Wang等［25］克隆獲得了首個結(jié)縷草DREB A-2亞組的基因（ZjDREB-2.1），過量表達該基因的擬南芥植株的抗寒性明顯高于野生型。馮勛偉和才宏偉［26］以日本北海道地區(qū)的耐寒生態(tài)型室蘭（Murorann）和日本九州地區(qū)的不耐寒生態(tài)型俵山北（Tawarayamakita）為材料，克隆獲得了結(jié)縷草的首個DREB A-1亞組基因ZjCBF，在擬南芥中超表達該基因可增強植株抗凍能力。本研究以結(jié)縷草‘膠東青’變種為材料，克隆獲得該屬植物的第2個DREB A-2亞組的基因，命名為DREB2.2。

圖 4 DREB2.2-S蛋白AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域（A）和3D模型（B）

結(jié)縷草DREB2.2基因有兩個轉(zhuǎn)錄本，長轉(zhuǎn)錄本DREB2.2-L在第75位堿基處插入50 bp的序列，導(dǎo)致閱讀框提前終止，僅編碼65個氨基酸，短轉(zhuǎn)錄本DREB2.2-S 包含完整的閱讀框，推測編碼蛋白含338個氨基酸，與ZjDREB2.1氨基酸序列相似度為33.14%。在DREB亞家族基因的進化系統(tǒng)中，DREB2.2-S 屬于A-2組，與高粱、玉米、谷子的同源基因遺傳距離較近，而與ZjDREB2.1處于A-2亞組中的不同分枝上，推測結(jié)縷草的這兩個基因有不同的禾本科DREB2基因祖先。DREB2基因的多種轉(zhuǎn)錄剪接方式在其他禾本科植物中也有報道。玉米的ZmDREB2A有兩個轉(zhuǎn)錄本，長轉(zhuǎn)錄本ZmDREB2A-L多含一個53 bp的序列，編碼區(qū)提前終止，僅推測編碼89個氨基酸，而短轉(zhuǎn)錄本ZmDREB2A-S編碼蛋白屬于DREB2亞組［27］。大麥的HvDRF1和小麥的TaDRF1基因有3個轉(zhuǎn)錄本，其中兩個轉(zhuǎn)錄本可以翻譯產(chǎn)生DREB2類轉(zhuǎn)錄因子［28］。Qin等［27］根據(jù)他們對玉米ZmDREB2A基因的研究結(jié)果認(rèn)為，單子葉和雙子葉植物在一些DREB2基因活性調(diào)控方式上有差異，前者通過轉(zhuǎn)錄剪接調(diào)節(jié)，后者通過磷酸化調(diào)節(jié)，本研究結(jié)果支持了這個觀點。由于有生理活性的DREB2基因的超表達影響植株的生長發(fā)育［9，27］，采用可變剪接產(chǎn)生無活性轉(zhuǎn)錄本的調(diào)節(jié)方式，可能有利于減輕基因的負面效應(yīng)，使植株正常生長。

圖 5 DREB2.2-S與5個相似度最高的直系同源基因氨基酸序列的比較

多數(shù)DREB2基因具有逆境應(yīng)答特性，不同物種中DREB2基因的逆境響應(yīng)模式有差異。擬南芥中的DREB2A、DREB2B基因的表達受干旱和高鹽誘導(dǎo)，而對低溫誘導(dǎo)無明顯響應(yīng)［29］。菊花（Dendranthema vestitum）DvDREB2A基因表達受低溫誘導(dǎo)的強度是干旱和高鹽誘導(dǎo)強度的8-15倍左右［30］。珍珠狼尾草（Pennisetum glaucum）PgDREB2A基因表達對干旱脅迫響應(yīng)較早，但在低溫脅迫下上調(diào)幅度比在干旱脅迫和高鹽脅迫下的高［31］。胡楊（Populus euphratica）的PeDREB2基因?qū)Ω啕}脅迫響應(yīng)較低溫和干旱脅迫的滯后［32］。玉米ZmDREB2A基因的兩個長、短轉(zhuǎn)錄本在常溫下表達量非常低，在低溫和鹽脅迫下兩者均上調(diào)表達，其中有生理功能的ZmDREB2A-S上調(diào)幅度更大［27］。本研究表明，結(jié)縷草的DREB2.2的兩個轉(zhuǎn)錄本在正常生長條件下有表達，在干旱脅迫下，兩種剪接本在24 h內(nèi)均略上調(diào)表達；在低溫脅下，兩序列均在2 h時表達量最高；高鹽脅迫下，兩序列表達均無明顯響應(yīng)。在相同條件下，DREB2.2-L的表達量均略高于DREB2.2-S的量或與其相當(dāng)。轉(zhuǎn)基因研究表明，DREB2基因超表達后可增強植株抵抗低溫、干旱和高鹽等非生物逆境的能力。擬南芥組成型活性DREB2A基因的超表達明顯增強擬南芥植株的抗旱能力，但未增強抗凍能力［9］。超表達PgDREB2A基因的煙草植物抗高鹽和干旱脅迫能力增強［33］。Chen 等［34］用大豆轉(zhuǎn)錄因子 GmDREB2 轉(zhuǎn)化擬南芥，干旱處理（19 d 不澆水）后野生型全部死亡，而轉(zhuǎn)基因植株的成活率可高達45.9%，證明轉(zhuǎn)基因植株抗旱能力有明顯提高。組成型表達玉米ZmDREB2A-S的擬南芥植株抗旱能力增強，植株矮壯，發(fā)育遲緩。結(jié)縷草DREB2.2-S編碼的蛋白質(zhì)屬于DREB2亞組轉(zhuǎn)錄因子，在氨基酸序列上與高粱、谷子、玉米的同源基因高度相似，推測它具有DREB2亞組基因類似的生理功能，參與結(jié)縷草抗逆生理過程。

圖6 DREB2.2-S基因的系統(tǒng)發(fā)育樹

4 結(jié)論

結(jié)縷草‘膠東青’DREB2.2基因含DREB2.2-L和DREB2.2-S兩個轉(zhuǎn)錄本，前者閱讀框不完整，推測后者編碼的蛋白質(zhì)屬于DREB轉(zhuǎn)錄因子亞家族A-2亞組，與高粱、谷子、玉米的同源基因親緣關(guān)系較近。DREB2.2-L和DREB2.2-S為組成型表達，表達量受低溫和干旱誘導(dǎo)上調(diào)，可能參與結(jié)縷草抗逆生理過程。

圖7 逆境脅迫下DREB2.2的表達

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（責(zé)任編輯馬鑫）

Cloning and Expression Profile of DREB2.2 Gene from Zoysia japonica var. pallida cv Jiaodong

KE Xiang NONG Jun-xiu SHI Da-lin MA Li-peng LI Jing WEI Shan-jun
（College of Life and Environmental Sciences，Minzhu University of China，Beijing 100081）

DREB（dehydration responsive element binding protein）is a type of transcription factor commonly existing in higher plants，and involves in abiotic stress response and the process of growth and development. In this study， using Zoysia japonica var. pallida cv Jiaodong as material， the coding sequence of gene DREB2.2 was cloned， then the bioinformatics were analyzed， and the expression profile of the gene in the stress environment was detected by semi-quantitative PCR technique. Sequencing analysis indicated that DREB2.2 had 2 transcripts of long and short. The long transcript， DREB2.2-L， was 1 067 bp in length， with a premature ORF because of a 50 bp insertion sequence， and putatively encoding 65 amino acids. The short one， DREB2.2-S， was 1 017 bp in length， encoding 338 amino acids；the putative protein was 37.3 kD， pI was 4.86， and it belonged to the A-2 group of DREB subfamily， containing an AP2 conservative structure domain and nuclear localization sequence. The results of semi-quantitative PCR showed that both DREB2.2-S and DREB2.2-L were expressed in normal condition，the expressions were up-regulated under low temperature stress with the highest level at 2 h exposure， and were slightly up-regulated during the 2 h and 24 h of drought stress， but showed no response to high salt stress. In both normal and stress conditions， the mRNA amount of DREB2.2-L was slightly higher than that of DREB2.2-S.

Zoysia japonica var. pallida cv Jiaodong；transcription factor；DREB；abiotic stress.

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.020

2015-03-30

國家自然科學(xué)基金項目（31100507），中央民族大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項目（BEIJ2014110012，URTP2014110029，GCCX-2015110020）

可祥，男，碩士研究生，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)，E-mail：706320299@qq.com；農(nóng)鈞琇與石大林為本文并列第一作者

韋善君，女，博士，講師，研究方向：植物生理與分子生物學(xué)，E-mail：wei.s.j@163.com