異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌Bacillus sp.JB4的分離鑒定試驗(yàn)

李泳洪，陳小嵐，許旭萍

(福建師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350108)

?

異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌Bacillus sp.JB4的分離鑒定試驗(yàn)

李泳洪，陳小嵐，許旭萍

(福建師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350108)

采用異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基與BTB培養(yǎng)基分離篩選到了一株異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌JB4，通過(guò)形態(tài)觀察、生理生化鑒定及16SrDNA序列測(cè)定，初步鑒定JB4為芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)。試驗(yàn)結(jié)果表明：該菌株JB4具有良好的異養(yǎng)硝化-好氧反硝化能力，12h內(nèi)氨氮去除率為76.95%～84.58%，亞硝態(tài)氮的積累量小于1.83 mg/L。

異養(yǎng)硝化；芽孢桿菌；脫氮

1　引言

筆者篩選到一株具備高效脫氮能力的異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌株，在此基礎(chǔ)上，對(duì)其進(jìn)行菌種鑒定、異養(yǎng)硝化性能的測(cè)定等，為進(jìn)一步研究該菌株的脫氮路徑、脫氮產(chǎn)物及其應(yīng)用于實(shí)際廢水的處理提供理論基礎(chǔ)。

2　材料與方法

2.1材料

2.1.1樣品

試驗(yàn)樣品采自福州市閩侯縣某排污口淤泥、閩江口某池塘廢水及淤泥、建甌福矛酒廠酒曲和堆積樣等。

2.1.2培養(yǎng)基

(1)BTB培養(yǎng)基[5,6](g/L)：丁二酸鈉 4.72，NaNO30.85，KH2PO41.00;FeSO4·7H2O 0.20;MgSO4·7H2O 0.10，溴百里酚藍(lán)1 mL，瓊脂15(固體培養(yǎng)基加入)，pH值=7.0～7.3。

(2)異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基(HNM)(g/L)：(NH4)2SO40.24，丁二酸鈉2.17，維氏鹽溶液50mL，瓊脂20(固體培養(yǎng)基加入)，pH值=7.0。

(3)維氏鹽溶液(g/L)：K2HPO4·3H2O 6.50，MgSO4·7H2O 2.50，NaCl 2.50，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05，MnSO4·H2O 0.04 。

(4)好氧反硝化培養(yǎng)基(DM)(g/L)：把異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基中的氮源改成KNO30.72，其它同異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基，pH值=7.0。

(5)LB培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 5，葡萄糖2，瓊脂20(固體培養(yǎng)基加入)，pH值=7.0～7.2。

2.2異養(yǎng)硝化-好氧反硝化細(xì)菌的分離篩選

分離純化菌株主要運(yùn)用梯度稀釋平板法和平板劃線(xiàn)法[7]。將樣品稀釋液涂布于異養(yǎng)硝化固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待長(zhǎng)出單菌落，挑取不同形態(tài)菌落進(jìn)行多次劃線(xiàn)分離后得到純菌株，將其接種到斜面培養(yǎng)基中保存并編號(hào)。結(jié)合格林斯試劑法[8]和BTB法[9]，對(duì)分離得到的菌株進(jìn)行異養(yǎng)硝化活性和好氧反硝化活性的鑒別，初步判斷篩選的菌株是否為異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌。將初篩得到的菌株接種于異養(yǎng)硝化液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，測(cè)定氨氮的含量并計(jì)算脫氮率，選取脫氮效果較好的菌株作為實(shí)驗(yàn)菌株進(jìn)行后續(xù)研究。

2.3菌株的鑒定

2.3.1形態(tài)學(xué)鑒定

將待鑒定的菌株接種到LB培養(yǎng)基平板上，28 ℃培養(yǎng)48h后觀察菌落特征；并挑取少量菌體制片進(jìn)行革蘭氏染色和芽孢染色，然后光鏡觀察菌體形態(tài)；同時(shí)，用JSM-6500F掃描電子顯微鏡觀察菌體形態(tài)并攝像。

2.3.1生理生化鑒定

菌株的生理生化特性采用細(xì)菌自動(dòng)鑒定系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)定。

2.3.216SrDNA序列測(cè)定與系統(tǒng)發(fā)育分析

16SrDNA測(cè)序由鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司完成。將所得序列信息提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST比對(duì)后，選擇同源性較高的相關(guān)序列，由Clustal X序列比對(duì)軟件進(jìn)行多序列匹配，然后由Mega 4.0構(gòu)建菌株JB4的16SrDNA系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2.4生長(zhǎng)及脫氮曲線(xiàn)

2.5分析方法

硝態(tài)氮的測(cè)定采用麝香草酚分光光度法[10]；氨氮的測(cè)定采用納氏試劑分光光度法；亞硝態(tài)氮的測(cè)定采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法[11]；菌體生長(zhǎng)量測(cè)定采用濁度法(OD600)。

3　結(jié)果和分析

3.1異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌株的分離與鑒定

經(jīng)多次分離純化，篩選得到一株具有較高脫氮能力的異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌株，命名為JB4。

3.1.1形態(tài)學(xué)鑒定

菌株JB4在LB培養(yǎng)基平板上28 ℃培養(yǎng)48 h后呈現(xiàn)的菌落特征為：圓形，白色，表面褶皺，有光澤，邊緣呈波狀，不透明。菌落直徑為0.3～0.8 cm。菌株JB4革蘭氏染色陽(yáng)性，細(xì)胞呈直桿狀、有芽孢，菌體大小為(0.57～0.95) μm×(1.71～3.8) μm，如圖1所示。

圖1　菌株JB4掃描電子顯微鏡圖片(×8000)

3.1.2生理生化特性

菌株JB4的生理生化特性為：兼性厭氧；可以在含有海藻糖、蔗糖、D-甘露糖、D-甘露醇、葡萄糖、D-核糖培養(yǎng)基上生長(zhǎng)并產(chǎn)酸，不能在含有D-棉子糖、D-麥芽糖、乳糖、D-山梨醇、D-木糖培養(yǎng)基上生長(zhǎng)并產(chǎn)酸；精氨酸雙水解酶1陽(yáng)性，精氨酸雙水解酶2陰性；L-乳酸鹽產(chǎn)堿陽(yáng)性；酪氨酸芳胺酶、α-半乳糖苷酶、α-甘露糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶陽(yáng)性。該菌株能在鹽度為6.5%的培養(yǎng)液中生長(zhǎng)。

3.1.316SrDNA序列測(cè)定與系統(tǒng)發(fā)育分析

提取并測(cè)定片段長(zhǎng)度為1417bp的16SrDNA序列。此序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源性比較，結(jié)果顯示菌株JB4和多株Bacillus sp.16SrDNA的相似性達(dá)99%以上，結(jié)合菌株的形態(tài)特征和生理生化特性，初步鑒定其為Bacillus sp.。選取同源性較高的序列用Mega 4.0軟件，以Neighbor-joining法繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

3.2JB4生長(zhǎng)曲線(xiàn)及脫氮性能

菌株JB4在初始硝態(tài)氮濃度為442 mg/L的好氧反硝化培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線(xiàn)如圖2(B)所示。由OD600變化可知，菌株JB4在0～4 h是延遲期， 4～12 h為對(duì)數(shù)期，16 h后OD600達(dá)到最大值0.642，20 h降至0.546，之后保持穩(wěn)定，基本與在異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)規(guī)律一致。由硝態(tài)氮的質(zhì)量濃度變化可知，菌株JB4培養(yǎng)4h后的硝態(tài)氮由442 mg/L降至70.30 mg/L，脫氮率達(dá)到84.09%，12h后降到最低61.58 mg/L，脫氮率達(dá)到86.07%。反硝化過(guò)程的第一步是還原成亞硝態(tài)氮，然后再轉(zhuǎn)變成N2O和N2。由劉俊女的研究[12]可知，亞硝態(tài)氮的累積與脫氮中間產(chǎn)物N2O的生成有正相關(guān)關(guān)系，而該實(shí)驗(yàn)中的亞硝態(tài)氮的累積量很小，最高也不超過(guò)1.83 mg/L，可以推測(cè)脫氮過(guò)程中N2是最主要的最終脫氮產(chǎn)物。與已報(bào)道的相關(guān)菌株X3和XF3相比[4,6](菌株X3經(jīng)12h培養(yǎng)，硝態(tài)氮濃度從初始42 mg/L降到29.80 mg/L，去除率為29.05%，培養(yǎng)18h時(shí)硝態(tài)氮降至12.32 mg/L，去除率為70.67%；菌株XF3經(jīng)48 h培養(yǎng)，硝態(tài)氮濃度可從初始84 mg/L降到9 mg/L，脫氮率高達(dá)89.3%，但是亞硝態(tài)氮積累量達(dá)到11.22 mg/L)，菌株JB4硝態(tài)氮去除速率更高。此結(jié)果說(shuō)明菌株JB4具備高效的好氧反硝化能力，且反硝化作用主要發(fā)生在菌株生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期。

圖2菌株JB4在異養(yǎng)硝化(A)和好氧反硝化培養(yǎng)基(B)中的生長(zhǎng)降解曲線(xiàn)

4　結(jié)論

(1)從福矛酒廠的堆積樣中分離到一株異養(yǎng)硝化-好氧反硝化細(xì)菌JB4。JB4生長(zhǎng)迅速、脫氮效果高，亞硝態(tài)氮積累量低于1.83 mg/L。

(2)經(jīng)形態(tài)觀察、生理生化特性鑒定及16SrDNA序列分析，將JB4鑒定為芽孢桿菌屬細(xì)菌(Bacillus sp.)。

[1]胡耐根.水體富營(yíng)養(yǎng)化的成因及防治對(duì)策[J].科技信息,2009(33):726～727.

[2]潘紅波.湖泊富營(yíng)養(yǎng)化問(wèn)題及其防治淺議[J].環(huán)境科技,2011,24(1):123～126.

[3]Hung-Soo J, Mitsuyo H, Makoto S.Nitrification and denitrification in high-strengh ammonium by Alcaligenes faecallis [J].Biotechnology Letters,2005,27(11):773～778.

[4]孫雪梅,李秋芬,張艷,等.一株海水異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌系統(tǒng)發(fā)育及脫氮特性[J].微生物學(xué)報(bào),2012,52(6):687～695.

[5]韓永和,章文賢,莊志剛,等.耐鹽好氧反硝化菌A-13菌株的分離鑒定及其反硝化特性[J].微生物學(xué)報(bào),2013,53(1):47～58.

[6]郝敏娜,楊云龍.高溫好氧反硝化菌的分離鑒定及脫氮特性[J].環(huán)境工程學(xué)報(bào),2014(7):3058～3062.

[7]何偉,王薇,王潔,等.一株好氧反硝化菌的分離鑒定及其混合應(yīng)用特性研究[J].生態(tài)與農(nóng)村環(huán)境學(xué)報(bào),2009,25(2):88～93.

[8]黃菲菲. 異養(yǎng)硝化—好氧反硝化菌的篩選與脫氮性能研究[D].南京：南京理工大學(xué),2013.

[9]Naoki T,Maria A B. Catalan-Sakairi,et al.Aerobic Denitrifying Bacteria That Produce Low Levels of Nitrous Oxide[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2003,69(6):3152～3157.

[10]國(guó)家環(huán)境保護(hù)局.水和廢水檢測(cè)分析方法[M].4版.北京：中國(guó)環(huán)境科學(xué)出版社,2002：368～370.

[11]金敏,王景峰,孔慶鑫,等.好氧異養(yǎng)硝化菌Acinetobacter sp.YY-5的分離鑒定及脫氮機(jī)理[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào),2009,15(5):692～697.

[12]修海峰,朱仲元,丁愛(ài)中,等.好氧反硝化菌種DF2的分離鑒定及生理生化特性分析[J].生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào),2011,20(8):1307～1314.

2016-07-04

福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：2013J01123)

李泳洪(1994—)，男，福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院學(xué)生。

許旭萍(1962—)，女，教授，主要從事廢水微生物處理技術(shù)研究。

X832

A

1674-9944(2016)16-0023-03