光譜法結(jié)合分子模擬技術(shù)研究左氧氟沙星與胃蛋白酶的相互作用機(jī)理

曾華金,李夢(mèng)婷,李　晴,胡菲菲

(鄭州大學(xué) 藥學(xué)院，河南 鄭州　450001)

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光譜法結(jié)合分子模擬技術(shù)研究左氧氟沙星與胃蛋白酶的相互作用機(jī)理

曾華金*,李夢(mèng)婷,李晴,胡菲菲

(鄭州大學(xué) 藥學(xué)院，河南 鄭州450001)

在模擬生理?xiàng)l件下，采用熒光光譜法結(jié)合分子對(duì)接技術(shù)研究了左氧氟沙星與胃蛋白酶的相互作用。不同溫度下的Stern-Volmer曲線(xiàn)結(jié)果表明，左氧氟沙星主要以靜態(tài)猝滅的方式使胃蛋白酶的熒光產(chǎn)生猝滅。由熱力學(xué)數(shù)據(jù)確定了兩者之間存在的作用力主要為靜電作用力。三維熒光光譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在左氧氟沙星與胃蛋白酶發(fā)生作用過(guò)程中引起了胃蛋白酶中酪氨酸和色氨酸殘基構(gòu)象的變化，從而導(dǎo)致胃蛋白酶發(fā)生了猝滅作用。為了進(jìn)一步探討左氧氟沙星與胃蛋白酶相互作用的分子機(jī)理，利用分子對(duì)接技術(shù)對(duì)兩者的相互作用進(jìn)行模擬。結(jié)果表明兩者發(fā)生作用的區(qū)域位于胃蛋白酶的催化活性中心，左氧氟沙星的進(jìn)入導(dǎo)致酶催化中心氨基酸殘基的微環(huán)境發(fā)生改變，從而對(duì)胃蛋白酶的活性造成影響，這可能也是左氧氟沙星引起消化不良的主要原因。

左氧氟沙星；胃蛋白酶；相互作用；熒光光譜；分子對(duì)接

*Corresponding Author,E-mail:zenghuajin@sina.com.cn

1　引　　言

左氧氟沙星(Levofloxacin,LEFX)屬第3代喹諾酮類(lèi)抗菌藥物，其主要的作用機(jī)制是通過(guò)抑制細(xì)菌DNA旋轉(zhuǎn)酶的活性來(lái)阻礙細(xì)菌DNA的合成，最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡。結(jié)構(gòu)上，左氧氟沙星是氧氟沙星(Oflaxacin,OFLX)的左旋體，但體外抗菌活性卻是氧氟沙星的2 倍，因而在臨床上比氧氟沙星更廣泛地應(yīng)用于各種感染性疾病的預(yù)防與治療[1]。然而，隨著左氧氟沙星在臨床上使用頻率的增加，與之相關(guān)的藥物不良反應(yīng)也在不斷地呈現(xiàn)，如過(guò)敏性休克、皮膚瘙癢、血管神經(jīng)性水腫、惡心、嘔吐、腹瀉等[2]。

胃蛋白酶(Pepsin,PEP)是Theodor Schwann在1836年發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)動(dòng)物酶，屬于天冬氨酸酶家族中的一員，由機(jī)體胃部的胃粘膜主細(xì)胞分泌，能高效地將食物中的蛋白質(zhì)分解為小肽片段，在機(jī)體的消化系統(tǒng)中起著非常重要的作用[3]。然而，當(dāng)藥物分子經(jīng)口服進(jìn)入胃后，必定會(huì)與胃蛋白酶發(fā)生作用，繼而可能影響胃蛋白酶的消化活性，從而引起諸如惡心、嘔吐等癥狀。因此，研究藥物小分子與胃蛋白酶的相互作用能對(duì)藥物引起的消化不良反應(yīng)提供科學(xué)依據(jù)。目前，已有研究人員利用光譜法研究普盧利沙星[4]、加替沙星[5]、乳酸左氧氟沙星[6]等與胃蛋白酶相互作用的報(bào)道，但利用光譜法結(jié)合分子模擬技術(shù)研究左氧氟沙星與胃蛋白酶的相互作用卻未見(jiàn)報(bào)道。

基于以上原因，本文應(yīng)用熒光光譜法研究了不同溫度條件下左氧氟沙星與胃蛋白酶的相互作用，并利用分子對(duì)接技術(shù)對(duì)其相互作用過(guò)程進(jìn)行了分子模擬，旨在探討左氧氟沙星與胃蛋白酶之間的作用機(jī)制，從而為左氧氟沙星引起的消化不良反應(yīng)做出科學(xué)的解釋。

2　實(shí)　　驗(yàn)

2.1主要儀器與試劑

實(shí)驗(yàn)中使用的儀器主要有熒光分光光度計(jì)(Hitatch F-4500，Japan)、紫外分光光度計(jì)(UV-2660，Japan)、電子分析天平(CP214，China)、恒溫水浴(DK-98-ПA，China)和酸度計(jì)(pH-3S，China)。

左氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品(購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所)用雙蒸水配成1.0×10-3mol·L-1的溶液于4 ℃下保存?zhèn)溆谩Ｎ傅鞍酌竷?chǔ)備液用0.2 mol·L-1磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(pH=2.0)配成，濃度為2.5×10-4mol·L-1，在4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1熒光光譜測(cè)定

在具塞試管(10 mL)中，依次加入100 μL 胃蛋白酶溶液(2.5×10-4mol·L-1)和不同量的左氧氟沙星溶液，然后用緩沖液定容至5 mL。將試管置于恒溫水浴(20 ℃和37 ℃)中溫育10 min，在290～500 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，記錄胃蛋白酶的熒光光譜變化(λex/λem=280/338 nm，狹縫寬度5.0/5.0 nm)。

2.2.2分子對(duì)接

胃蛋白酶晶體(PDB ID∶5PEP)結(jié)構(gòu)來(lái)自蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(Protein Data Bank)。左氧氟沙星的二維結(jié)構(gòu)在ChemDraw Ultra 8.0軟件中繪制，同時(shí)采用3D模型中的分子力學(xué)(MM+力場(chǎng))對(duì)其三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化。使用AutoDock 4.0軟件對(duì)左氧氟沙星和胃蛋白酶分子進(jìn)行對(duì)接，用Larmarckian genetic algorithm來(lái)預(yù)測(cè)兩者對(duì)接時(shí)左氧氟沙星可能存在的分子構(gòu)象。

3　結(jié)果與討論

3.1左氧氟沙星對(duì)胃蛋白酶熒光光譜的影響

蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光主要表現(xiàn)為分子內(nèi)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸殘基的發(fā)射[7]。由圖1可見(jiàn)，隨著左氧氟沙星濃度的增加，胃蛋白酶的熒光發(fā)射強(qiáng)度均呈現(xiàn)有規(guī)律的猝滅，并且還伴隨著一定程度的紅移。熒光強(qiáng)度的下降及紅移現(xiàn)象表明氧氟沙星與胃蛋白酶的結(jié)合導(dǎo)致胃蛋白酶中生色基團(tuán)的微環(huán)境發(fā)生了改變[8-9]，使生色基團(tuán)進(jìn)入一個(gè)更加親水的環(huán)境中，左氧氟沙星與胃蛋白酶彼此發(fā)生了相互作用。

CPEP=3.0×10-6mol·L-1; 由上到下 CLEFX=(0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0)×10-6mol·L-1

圖1左氧氟沙星對(duì)胃蛋白酶熒光光譜的影響

Fig.1Effect of LEFX on fluorescence spectra of PEP

3.2熒光猝滅機(jī)理

熒光猝滅作用根據(jù)作用機(jī)理的不同通?？梢苑譃閯?dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅。對(duì)于熒光猝滅是動(dòng)態(tài)還是靜態(tài)，可以通過(guò)動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)(Ksv)和靜態(tài)猝滅常數(shù)(Kq)的結(jié)合程度來(lái)判斷[5]。為了探討左氧氟沙星與胃蛋白酶之間的猝滅機(jī)理，我們首先將猝滅機(jī)理按動(dòng)態(tài)猝滅來(lái)處理。根據(jù)Stern-Volmer方程[10]：

(1)

式中F0為左氧氟沙星加入前胃蛋白酶的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)為左氧氟沙星加入后的胃蛋白酶的熒光強(qiáng)度，Kq為雙分子猝滅過(guò)程的速率常數(shù)，τ0是猝滅劑不存在時(shí)生物大分子的平均熒光壽命(10-8s)，C為左氧氟沙星的濃度，Ksv為動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)。以F0/F對(duì)C作圖，得到不同實(shí)驗(yàn)條件下的Stern-Volmer圖(圖2)。

圖2　左氧氟沙星與胃蛋白酶相互作用的Stern-Volmer圖

根據(jù)方程(1)計(jì)算得出相應(yīng)的參數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可以看出，Ksv和Kq都隨溫度的升高而降低，表明左氧氟沙星對(duì)胃蛋白酶熒光的猝滅是由靜態(tài)猝滅引起的。此外，不同猝滅劑對(duì)生物大分子的最大擴(kuò)散碰撞猝滅常數(shù)為2.0×1010L·mol-1·s-1[11-12]，而實(shí)驗(yàn)中所得到的Kq值無(wú)論在293 K還是310 K，均遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于2.0×1010L·mol-1·s-1，這一結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明左氧氟沙星對(duì)胃蛋白酶的猝滅是由于形成了化合物而引起的靜態(tài)猝滅。

表1　左氧氟沙星與胃蛋白酶相互作用的Stern-Volmer猝滅常數(shù)

3.3結(jié)合常數(shù)與結(jié)合位點(diǎn)數(shù)計(jì)算

藥物小分子與生物大分子之間的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)可通過(guò)以下方程計(jì)算獲得[7]：

圖3左氧氟沙星與胃蛋白酶相互作用的lg(F0-F)/F對(duì)lg{1/[Cd-(F0-F) Cp/F0]}曲線(xiàn)

Fig.3Plots of lg(F0-F)/F vs.lg{1/[Cd-(F0-F) Cp/F0]} of LEFX-PEP system

(2)

式中，Cp為胃蛋白酶總濃度，Cd為左氧氟沙星總濃度，n為結(jié)合位點(diǎn)數(shù)，Ka為結(jié)合常數(shù)。以lg(F0-F)/F對(duì)lg{1/[Cd- (F0-F)Cp/F0]}作圖(圖3)，然后根據(jù)所得到的方程，計(jì)算結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表2。從表2可以看出，左氧氟沙星與胃蛋白酶的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)均約為1，表明一分子的胃蛋白酶可以結(jié)合一分子的左氧氟沙星；Ka值均大于1×104L·mol-1，說(shuō)明左氧氟沙星與胃蛋白酶之間發(fā)生了較強(qiáng)的相互作用。

表2　左氧氟沙星與胃蛋白酶的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

3.4作用力類(lèi)型

藥物小分子與蛋白質(zhì)的相互作用力通常包括氫鍵、范德華力、靜電作用力、疏水作用力4種，而藥物小分子與蛋白質(zhì)的相互作用力的類(lèi)型可以從熱力學(xué)參數(shù)的大小進(jìn)行判斷。當(dāng)ΔH>0，ΔS>0時(shí)，相互作用力主要表現(xiàn)為疏水作用力；當(dāng)ΔH<0,ΔS>0時(shí)，主要表現(xiàn)為靜電作用力；當(dāng)ΔH<0，ΔS<0時(shí)，則主要表現(xiàn)為氫鍵或者是范德華力[13]。根據(jù)熱力學(xué)公式：

(3)

(4)

(5)

計(jì)算得到左氧氟沙星與胃蛋白酶相互作用的熱力學(xué)參數(shù)及主要作用力類(lèi)型，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，ΔG都小于0，說(shuō)明左氧氟沙星與胃蛋白酶的作用過(guò)程是自發(fā)進(jìn)行的；而ΔH<0，ΔS>0表明左氧氟沙星與胃蛋白酶的結(jié)合主要以靜電引力為主。

表3左氧氟沙星與胃蛋白酶相互作用的熱力學(xué)參數(shù)和主要作用力類(lèi)型

Tab.3Thermodynamic parameters and acting forces of PEP with LEFX

T/K△H/(kJ·mol-1)△S/(J·K-1·mol-1)△G/(kJ·mol-1)293-1.4988.49-27.43310-1.4988.49-28.93

3.5三維熒光光譜

三維熒光圖譜不僅能提供更加完整的熒光光譜信息，也能更加直觀地呈現(xiàn)猝滅劑引起熒光大分子的熒光強(qiáng)度變化以及分析蛋白質(zhì)或酶的構(gòu)象變化[14]。圖4為胃蛋白酶和左氧氟沙星與胃蛋白酶復(fù)合物的三維熒光光譜等高線(xiàn)圖。從圖中可以看出，胃蛋白酶熒光峰的位置為λem=335 nm和λex=280 nm，而與左氧氟沙星發(fā)生相互作用后，胃蛋白酶熒光峰的位置發(fā)生了紅移(λem=340 nm和λex=285 nm)，這一結(jié)果表明，左氧氟沙星的加入導(dǎo)致了胃蛋白酶微環(huán)境及構(gòu)象上的變化，從而引起了胃蛋白酶內(nèi)源熒光的猝滅作用。此外，從熒光強(qiáng)度可以看出，加入左氧氟沙星后，胃蛋白酶的熒光強(qiáng)度明顯降低，這一結(jié)果進(jìn)一步表明兩者發(fā)生了相互作用，且是由于引起胃蛋白酶中酪氨酸和色氨酸殘基所處的微環(huán)境變化而引起的猝滅。

圖4胃蛋白酶和左氧氟沙星與胃蛋白酶復(fù)合物三維等高線(xiàn)圖。 (a) 胃蛋白酶三維熒光圖，CPEP=3.0×10-6mol·L-1; (b) 左氧氟沙星與胃蛋白酶復(fù)合物三維熒光圖,CPEP=3.0×10-6mol·L-1,CLEFX=12.0×10-6mol·L-1。

Fig.4Three-dimensional fluorescence contour spectra of PEP (a) and LEFX-PEP systems (b).(a) CPEP=3.0×10-6mol·L-1.(b) CPEP=3.0×10-6mol·L-1,CLEFX=12.0×10-6mol·L-1.

3.6分子對(duì)接

胃蛋白酶是一種由326個(gè)氨基酸殘基組成的單鏈蛋白酶，催化活性位點(diǎn)位于整個(gè)蛋白酶分子的中間區(qū)域，由六股反平行的β-折疊所組成[15]。為了進(jìn)一步說(shuō)明左氧氟沙星與胃蛋白酶結(jié)合并發(fā)生相互作用時(shí)對(duì)胃蛋白酶的構(gòu)象及活性的影響，我們運(yùn)用分子模擬技術(shù)將這一過(guò)程作更深入的探討。由分子對(duì)接結(jié)果可知，左氧氟沙星與胃蛋白酶的結(jié)合能ΔG為-6.48 kcal·mol-1(即-27.10 kJ·mol-1)，這一結(jié)果與實(shí)驗(yàn)所得的結(jié)果(-27.43 kJ·mol-1)較為一致，表明這一結(jié)合模式可以較為真實(shí)地反映左氧氟沙星與胃蛋白酶的相互作用方式。圖5為左氧氟沙星與胃蛋白酶最佳構(gòu)象圖。由圖5可以看出，左氧氟沙星與胃蛋白酶的作用中心位于胃蛋白酶的催化活性中心，并且左氧氟沙星分子周?chē)鼑鄠€(gè)氨基酸殘基，其中包括疏水性氨基酸殘基8個(gè)：ILE30、GLY34、TYR75、GLY76、PHE111、ILE120、TYR189和GLY217；親水性氨基酸殘基6個(gè)：GLU13、ASP32、SER35、THR74、THR77和THR218，這一結(jié)果表明，左氧氟沙星與胃蛋白酶之間的作用力主要以靜電引力為主，但同時(shí)也可能存在疏水作用力。這些氨基酸殘基中含有TYR75、PHE111、TYR189等發(fā)色基團(tuán)，當(dāng)左氧氟沙星進(jìn)入胃蛋白酶的催化活性中心時(shí)，必然對(duì)這些發(fā)色基團(tuán)的微環(huán)境造成影響，使它們的疏水環(huán)境發(fā)生改變，因而造成胃蛋白酶的熒光發(fā)生猝滅作用。

圖5LEFX與PEP相互作用的分子對(duì)接圖。(a)胃蛋白酶的活性中心；(b)左氧氟沙星與胃蛋白酶發(fā)生作用區(qū)域；(c)左氧氟沙星與胃蛋白酶催化活性中心發(fā)生作用的氨基酸殘基，虛線(xiàn)為氫鍵。

Fig.5Computation docking model of the interaction between LEFX and PEP.(a) Catalytic site of PEP.(b) Binding site in the PEP cavity.(c) Detailed illustration of the amino acid residues lining the binding site in the PEP cavity.Broken lines display hydrogen bonds.

此外，由于還存在離子型氨基酸殘基(如GLU13、ASP32和GLY34)，左氧氟沙星與這些氨基酸殘基還會(huì)形成氫鍵，如圖5所示，左氧氟沙星與GLU13、ASP32和GLY34所形成的氫鍵鍵長(zhǎng)分別為0.175，0.274，0.221 nm(1.75,2.74,2.21 ?)，因此，左氧氟沙星與胃蛋白酶之間的作用力還存在氫鍵。胃蛋白酶屬于天冬氨酸蛋白酶家族，其催化位點(diǎn)上天冬氨酸ASP32和ASP215兩種殘基所組成，當(dāng)一個(gè)天冬氨酸殘基質(zhì)子化、另一個(gè)天冬氨酸殘基去質(zhì)子化時(shí)，蛋白酶就會(huì)產(chǎn)生活性[16]。從對(duì)接結(jié)果可以看到，左氧氟沙星只與一個(gè)天冬氨酸ASP32形成氫鍵，而與ASP215不發(fā)生相互作用，這樣就導(dǎo)致胃蛋白酶的活性受到抑制，這可能也是左氧氟沙星引起消化不良的原因。

4　結(jié)　　論

采用熒光光譜法和分子對(duì)接技術(shù)研究了左氧氟沙星與胃蛋白酶的相互作用。左氧氟沙星和胃蛋白酶形成基態(tài)復(fù)合物，導(dǎo)致胃蛋白酶的熒光猝滅。通過(guò)計(jì)算，確定了左氧氟沙星和胃蛋白酶作用的猝滅機(jī)理、結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)及主要作用力，并且利用分子對(duì)接技術(shù)，對(duì)左氧氟沙星與胃蛋白酶相互作用的過(guò)程進(jìn)行了分子模擬，從而為闡明左氧氟沙星引起消化不良癥狀提供科學(xué)依據(jù)。

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曾華金(1977-)，男，廣東五華縣人，博士，副教授，2006年于中國(guó)藥科大學(xué)獲得博士學(xué)位，主要從事天然產(chǎn)物相關(guān)活性及其分析方面的研究。

E-mail:zenghuajin@sina.com

Mechanism of Interaction Between Levofloxacin and Pepsin by Spectroscopic and Molecular Docking Methods

ZENG Hua-jin*,LI Meng-ting,LI Qing,HU Fei-fei

(School of Pharmaceutical Sciences,Zhengzhou University,Zhengzhou 450001,China)

The binding of levofloxacin (LEFX) with pepsin (PEP) was investigated by spectroscopic and molecular docking methods under simulated physiological conditions.LEFX effectively quenched the fluorescence of PEP by a static quenching process.Based on the results of binding capacity,the thermodynamic parameters were calculated and the molecular docking was studied.It is concluded that the LEFX can spontaneously bind with PEP mainly through electrostatic forces.The three-dimensional fluorescence spectra reveal that the microenvironment and conformation of PEP are demonstrably changed in the presence of LEFX.Since the binding of LEFX can affect the microenvironment of the PEP activity site,LEFX causes the inhibition of PEP activity.

levofloxacin; pepsin; interaction; fluorescence spectroscopy; molecular docking

1000-7032(2016)04-0481-06

2015-12-13；

2016-01-24

O657.3

A

10.3788/fgxb20163704.0481